CN101801941B - 含有ppar△激动剂的药物 - Google Patents

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Abstract

提供促进睑板腺上皮细胞或角膜上皮细胞增殖的试剂，以及提供比如睑板腺功能异常、干眼等眼病的治疗剂。使用含有[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐作为活性成分的制剂作为促进睑板腺上皮细胞或角膜上皮细胞增殖的试剂，以及作为比如睑板腺功能异常、干眼等眼病的治疗剂。

Description

含有PPAR△激动剂的药物
技术领域
本发明涉及促进睑板腺上皮细胞或角膜上皮细胞增殖的试剂，其含有PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体)δ激动剂作为活性成分。
背景技术
睑板腺是包围在上和下眼皮(眼睑)内的产生脂质的腺体，通过位于眼睑睫毛的结膜侧的开口分泌脂质。构成泪液的脂质层含有睑板腺提供的脂质作为组分，防止泪液从眼表面蒸发。已知患有睑板腺功能异常或睑板腺炎的患者，由于睑板腺显示功能恶化并以较低水平分泌脂质，故发生与干眼有关的蒸发过强型干眼、角膜结膜上皮病症、角膜上皮糜烂和角膜溃疡等。此外，角膜由上皮和外界膜(Bowman膜)、基质、内界膜(Descemet膜)以及内皮构成。由于角膜位于眼球的最前部，其容易受到外界环境的影响，结果发生多种病症。与角膜上皮细胞的损伤或缺陷有关的疾病的实例包括干眼综合征、角膜溃疡、浅层点状角膜炎、角膜上皮糜烂、与角膜损害有关的眼变应性疾病如春季结膜炎、特应性角膜结膜炎等。
另一方面，PPAR是一种表达于大多数脊椎动物中的核内受体，并且被认为是与细胞内糖或脂代谢以及细胞分化紧密相关的转录因子组。作为亚型，已知α、δ和γ型。PPARδ有时被称为PPARβ(非专利文献1)。对于PPAR在眼组织中的分布，已知PPARα和β在兔的角膜上皮细胞中的表达(非专利文献2)。有报道称被认为主要具有PPARγ激活作用的5-[4-(6-甲氧基-1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基甲氧基)苯甲基]噻唑烷-2，4-二酮可被用作角膜结膜病症的治疗剂(专利文献1和2)，以及PPARα、δ或γ激动剂被给予用于眼病(结膜炎、干眼综合征、角膜炎等)的治疗(专利文献3)。此外，已知PPARα分布在肝、肾等中，并且影响脂代谢和运输。进一步地，还有报告称其激动剂可被用作角膜疾病的治疗剂(专利文献4)。已有报告称PPARδ激动剂促进大鼠皮脂腺上皮细胞增殖和分化(非专利文献3)，并促进皮肤的损伤愈合(非专利文献4)。除上述之外，已知通过给予非噻唑烷二酮PPAR配体和GLP-1衍生物刺激β-细胞增殖的方法(专利文献5)，通过匹格列酮(PPARγ激动剂)抑制白血病细胞、前列腺癌细胞等增殖的方法(专利文献6)等。
但是，PPARα、δ或γ在各动物种类和各组织或细胞中的表达和功能的很多方面都尚待澄清，并且还不确切地知道PPARδ激动剂是否可用于人眼疾病。专利文献1：WO2005/039574专利文献2：JP-A-2001-39976专利文献3：WO2002/076177专利文献4：JP-A-2005-008570专利文献5：WO2002/69994专利文献6：WO1998/25598非专利文献1：J Med Chem 2000，43：527-550非专利文献2：J Biol Chem 2000，275：2837非专利文献3：Molecular Genetic and Metabolism 2001，74：362-369非专利文献4：Am J Clin Dermatol 2003，4(8)：523-530
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明的目的是提供能够促进睑板腺上皮细胞和角膜上皮细胞增殖的药剂，其可为比如干眼等眼病的基础治疗，以及使用促进剂的、用于比如睑板腺功能异常、角膜上皮病症、干眼等眼病的治疗剂。解决问题的手段
鉴于上述问题，本发明人进行了深入研究，并且发现特异性的PPARδ激动剂在促进睑板腺上皮细胞和角膜上皮细胞增殖中显示优越的作用，这导致了本发明的完成。因此，本发明包括至少以下方面：(1)促进睑板腺上皮细胞增殖的试剂，包含[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐。(2)促进角膜上皮细胞增殖的试剂，包含[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐。(3)治疗睑板腺功能异常的试剂，包含[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐。(4)治疗角膜上皮病症的试剂，包含[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐。(5)治疗干眼的试剂，包含[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐。(6)上述(5)的试剂，其中所述干眼是蒸发过强型干眼。(7)[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐的用途，用于生产促进睑板腺上皮细胞增殖的试剂。(8)[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐的用途，用于生产促进角膜上皮细胞增殖的试剂。(9)[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐的用途，用于生产治疗睑板腺功能异常的试剂。(10)[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐的用途，用于生产治疗角膜上皮病症的试剂。(11)[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐的用途，用于生产治疗干眼的试剂。(12)上述(11)的用途，其中所述干眼是蒸发过强型干眼。(13)促进睑板腺上皮细胞增殖的方法，包括对需要促进睑板腺上皮细胞增殖的对象施予有效量的[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐。(14)促进角膜上皮细胞增殖的方法，包括对需要促进角膜上皮细胞增殖的对象施予有效量的[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐。(15)治疗睑板腺功能异常的方法，包括对需要治疗睑板腺功能异常的对象施予有效量的[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐。(16)治疗角膜上皮病症的方法，包括对需要治疗角膜上皮病症的对象施予有效量的[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐。(17)治疗干眼的方法，包括对需要治疗干眼的对象施予有效量的[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐。(18)上述(17)的方法，其中所述干眼是蒸发过强型干眼。
发明效果
本发明提供促进睑板腺上皮细胞或角膜上皮细胞增殖的新型睑板腺上皮细胞增殖促进剂或角膜上皮细胞增殖促进剂。此外，本发明的治疗剂可有效地用于治疗或改善例如睑板腺功能异常、角膜上皮病症和干眼等疾病。
附图说明
图1显示了培养的人角膜上皮细胞(上列)、培养的兔角膜上皮细胞(中列)、以及培养的猴睑板腺上皮细胞(下列)中PPARα、δ和γmRNA的表达。
实施本发明的最佳方式
本发明提供促进睑板腺上皮细胞增殖的试剂，包含[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐(以下有时统称为“本发明的化合物”)作为活性成分。该试剂促进睑板腺上皮细胞增殖。此外，本发明提供促进角膜上皮细胞增殖的试剂，包含[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐作为活性成分。该试剂促进角膜上皮细胞增殖。本发明中的细胞增殖促进剂意指具有促进细胞分裂以增加细胞数量作用的试剂、和具有抑制细胞死亡以增加细胞数量作用的试剂两者。
[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸(CAS NO.515138-06-4)：
Figure G200880025498XD00061
含有在本发明的促进剂中作为活性成分，是具有PPARδ激动剂活性的化合物，且记载于WO2003/03 3493(特别是实施例5)。
[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸(CAS NO.500581-25-8)：
含有在本发明的促进剂中作为活性成分，是具有PPARδ激动剂活性的化合物，且记载于WO2003/016291(特别是实施例3)。
[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸(CAS NO.500581-27-1)：
Figure G200880025498XD00072
含有在本发明的促进剂中作为活性成分，是具有PPARδ激动剂活性的化合物，且记载于WO2003/016291(特别是实施例6)。
这些化合物的可药用盐的实例包括与碱金属比如钠、钾等；碱土金属比如钙、镁等的金属盐等。此外，本发明的化合物也包括其溶剂化物。
本发明中的PPARδ激动剂是下述物质，其结合至PPARδ的配体结合结构域(LBD)，活化该受体，并调节PPAR靶基因的转录。PPARδ激动剂活性可以使用LBD和酵母GAL4的嵌合受体、以及报告基因，通过酵母双杂交法来测量，以排除固有存在于哺乳动物细胞中的其它核受体的影响。该测量方法的具体实例包括记载于参考文献中的PPAR-GAL4测定，T.M.Willson et al.，Journal of Medicinal Chemistry，2000，vol.43，No.4，p.528-550和J.M.Lehmann et al.，The Journalof Biological Chemistry，1995，vol.270，No.22，p.12953-12956。根据WO2003/033493，实施例12和WO2003/016291，实施例51中记载的方法，本发明的化合物已被证实具有PPARδ激动剂活性。
本发明的化合物可以根据WO2003/033493(特别是实施例5)和WO2003/016291(特别是实施例3、6)的记载合成。
在本发明的促进剂中，活性成分的含量通常为0.000001-1wt％，优选为0.00001-1wt％，最优选为0.0001-0.1wt％。
本发明的促进剂除上述活性成分之外可以含有任意载体。这种载体的实例包括溶剂(例如水、醇等)、缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、谷氨酸、ε氨基己酸等)、防腐剂(例如，苯扎氯胺、苄索氯铵、葡萄糖酸洗必泰、氯丁醇、苯甲醇、脱氢乙酸钠、对羟基苯甲酸的酯、依地酸钠、硼酸等)、等渗剂(例如，氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇、山梨糖醇、硼酸、葡萄糖、丙二醇等)等。
本发明的促进剂可在体外或体内用作药剂或试验试剂等。当本发明的促进剂被用作试验试剂时，其可在生理学和生物化学领域且在多个实施方案中用作试验试剂。
当发明的促进剂被用作药剂时，因为该试剂促进睑板腺上皮细胞增殖，故其可用作与睑板腺上皮细胞的损伤或萎缩有关的疾病、以及由睑板腺上皮细胞功能异常引起的疾病的治疗剂。上述疾病的实例包括睑板腺功能异常、睑板腺炎等。此外，由于睑板腺上皮细胞在泪液中分泌脂质组分，并且所述脂质防止了泪液蒸发并稳定泪液层，所以本发明的治疗剂可用于与泪液中脂质异常(分泌减少、组分变化)有关的疾病。所述疾病的实例包括蒸发过强型干眼。
此外，由于本发明的促进剂促进角膜上皮细胞增殖，所以其可用作与角膜上皮细胞损伤(即，创伤或缺陷)有关的疾病的治疗剂。本发明的促进剂可用作角膜上皮病症的治疗剂，特别地，与内源疾病比如Sjogren综合征、Stevens-Johnson综合征、干性角膜结膜炎(干眼)等有关的角膜上皮病症；与外源疾病比如手术后、药物使用、创伤、角膜溃疡、睑板腺炎、配戴隐形眼镜期间的外源疾病等有关的角膜上皮病症；与伴有角膜损害的眼变应性疾病比如春季结膜炎、特应性角膜结膜炎相关的角膜上皮病症等。本发明的促进剂还可用于治疗浅层点状角膜炎(superficial punctate keratitis)和角膜上皮溃疡。此外，本发明的促进剂也可用作角膜创伤愈合促进剂。
此外，由于本发明的促进剂同时显示对角膜上皮细胞增殖的促进作用和睑板腺上皮细胞增殖作用，并且提供直接作用于角膜组织的效果和通过作用于睑板腺细胞而改善泪液功能的效果，所以该试剂可用作治疗干眼的试剂，特别地，非常可用作治疗蒸发过强型干眼的试剂。
本发明的治疗剂中，活性成分的含量通常为0.000001-1wt％，优选为0.00001-1wt％，最优选为0.0001-0.1wt％。
本发明的促进剂或治疗剂的给药对象的实例包括哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊、猴等)。
本发明的治疗剂可以以例如滴眼剂、贴剂、软膏、洗剂、乳膏、口服剂等的剂型使用，并且除了上述活性成分外还可含有任意载体，例如可药用载体。
本发明的治疗剂的给药途径只要发挥上述治疗效果，则没有特别限制，但是其优选局部给药至眼。局部给药至眼的剂型的实例包括滴眼剂和眼软膏。例如，当本发明的治疗剂被用作滴眼剂或眼软膏时，稳定剂(例如，亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、依地酸钠、柠檬酸钠、抗坏血酸、二丁基羟基甲苯等)、增溶剂(例如，丙三醇、丙二醇、聚乙二醇(macrogol)、聚氧乙烯氢化蓖麻油等)、助悬剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等)、乳化剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚山梨醇酯80等)、缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、谷氨酸、ε-氨基己酸等)、增稠剂(例如，水溶性纤维素衍生物比如甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素等，硫酸软骨素钠，透明质酸钠，羧基乙烯聚合物，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇等)、防腐剂(例如，苯扎氯胺、苄索氯铵、葡萄糖酸洗必泰、氯丁醇、苯甲醇、脱氢乙酸钠、对羟基苯甲酸的酯、依地酸钠、硼酸等)、等渗剂(例如，氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇、山梨糖醇、硼酸、葡萄糖、丙二醇等)、pH调节剂(例如，盐酸、氢氧化钠、磷酸、乙酸等)、清凉剂(例如1-薄荷醇、d-樟脑、d-龙脑、薄荷油等)、软膏基质(白凡士林、纯化的羊毛脂、液体石蜡、植物油(橄榄油、山荼油(camelia oil)、花生油等)等)等可作为添加剂被加入。尽管这些添加剂的量随添加剂的种类、用途等而变化，但是它们可以以赋予下述浓度的量加入，该浓度能够实现使用该添加剂的目的。当本发明的治疗剂以滴眼剂或眼软膏的形式使用时，所述试剂可以根据制药领域常用的方法，并且例如可基于Japanese Pharmacopoeia14th edition，Preparation General Rules，section of eye drop and sectionof ophthalmic ointment(日本药典第14版，一般配制规则，滴眼剂项和眼软膏项)来生产。
滴眼剂的形式的实例包括水性滴眼剂(水性滴剂、水性悬浮滴剂、粘性滴剂等)、非水性滴眼剂(非水性滴剂、非水性悬浮滴剂等)、乳剂滴眼剂等。
滴眼剂的pH虽根据该滴眼剂的形式适当地测定，但其通常在4-8的范围内。当滴眼剂为水性滴剂时，从活性成分的溶解度的方面出发，pH特别优选调节至pH6-8。
滴眼剂通常是通过下述方法灭菌的制剂，比如过滤灭菌、辐射灭菌(例如，电子灭菌、紫外线灭菌、伽马灭菌等)、高压釜灭菌、热空气灭菌等。
当试剂被配制为滴眼剂时，优选将液体填装于提供有滴液开口的滴剂容器中，所述滴液开口具有能够控制液滴量以便于滴剂进入眼内的小直径。被用于所述容器的材料是合成树脂、玻璃、纤维素、浆状物等，并且根据活性成分和基质的性质或用量而适当选择。从可压缩性和耐久性方面出发，该容器优选由合成树脂制造。所述合成树脂的材料的具体实例包括聚乙烯树脂(例如，低密度聚乙烯或高密度聚乙烯)、聚丙烯树脂、乙烯-丙烯共聚物树脂、聚对苯二甲酸乙二醇酯树脂等。
滴剂容器的实例包括独立铸塑的、栓部件被嵌合于容器主体中的容器，液体在铸塑容器的同时被密封的整体铸塑的容器(例如，WO2004/006826)等。当采用整体铸塑的容器时，由于容器和液体被连续生产，故该容器在成本或卫生方面优越。滴剂容器可以是每次使用后抛弃的单位剂量型容器(例如，JP-A-9-207959)。当使用该容器时，可以配制对角膜高度安全的、无防腐剂的制剂。此外，这种容器可以粘合包装有UV阻断膜。而且，容器可被染色(褐色、绿色、蓝色、黄色等)以增强UV阻断性能。
本发明提供促进睑板腺上皮细胞增殖的方法，包括向需要促进睑板腺上皮细胞增殖的对象给予有效量的本发明的化合物。该方法期望被进行用于治疗睑板腺功能异常。
此外，本发明提供促进角膜上皮细胞增殖的方法，包括向需要促进角膜上皮细胞增殖的对象给予有效量的本发明的化合物。该方法期望被进行用于治疗角膜上皮病症。
此外，本发明提供治疗干眼的方法，包括向患有干眼的患者给予有效量的本发明的化合物。
本发明的化合物的有效量不能机械地定义，因为它随给药对象的年龄、体重和状况，治疗目的等而变化。当本发明的促进剂或治疗剂对人给药时，例如通常将含有0.000001-1wt％、优选0.00001-1wt％、最优选0.0001-0.1wt％的本发明的化合物的溶液对每只眼每次滴注1-2滴，一天1-8次，即每次滴注约50-200μL。具有以上范围内浓度和体积的溶液中含有的化合物的量可被例示为有效量。
实施例
以下参照不欲被解释为限定性的试验实施例详细说明本发明。
(试验实施例1)对正常人角膜上皮细胞数量增加的作用1.使用的细胞使用了正常人角膜上皮细胞(KURABO)
2.试验物质溶液的制备方法作为试验物质，使用了[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸(以下称作化合物A)。将化合物A溶解于乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)至培养基中终浓度的200倍的浓度，并将该溶液保存于-80℃直到即将使用前。作为用于考虑化合物A所致细胞数量增加作用的细胞培养基，使用了通过向EpiLife(KURABO)添加含有在HCGS生长添加剂套件(KURABO)中的胰岛素、氢化可的松和铁传递蛋白而得到的培养基(基础培养基)。
3.试验方法1)细胞培养和化合物A的添加将冷冻保藏于液氮中的正常人角膜上皮细胞解冻并对细胞数计数。将其总量转移至添加有全部HCGS生长添加剂套件(胰岛素、小鼠来源的表皮生长因子mEGF、氢化可的松、铁传递蛋白、牛脑下垂体提取物)的EpiLife(4mL，完全培养基)中，并于其中良好地悬浮。将该细胞悬浮液以2×104细胞/500μL/孔的细胞数接种于涂覆了纤连蛋白的24孔板(Becton Dickinson)上(由于底面积为2cm2，故为1×104细胞/cm2)。细胞接种结束后，将培养板在设定为37℃、5％CO2、95％空气和100％湿度的培养箱中孵育24小时，将培养基更换为400μL的基础培养基(添加有来自HCGS生长添加剂的胰岛素、氢化可的松和铁传递蛋白的EpiLife)。之后24小时后，将培养基更换为以下培养基(各400μL)。[1]仅基础培养基(无添加组)[2]基础培养基+mEGF(终浓度：1ng/mL；阳性对照组)[3]基础培养基+化合物A(终浓度：0.1nM、1nM、0.01μM、0.1μM；化合物A添加组)向培养基[1]和[2]各1mL加入乙醇(5μL)以使所有培养基的乙醇浓度都等于0.5％。2)细胞数量的测量从化合物A刺激起24小时后，从各孔除去培养上清，并向各孔分配200μL添加有10％Cell Counting Kit-8(DOJINDO)的基础培养基。分配后，将培养板转移至设定为37℃、5％CO2、95％空气和100％湿度的培养箱，孵育2hr。将上清(100μL)转移至组织培养用96孔板培养板(Corning)中，并使用微量培养板读出器(Dainippon Sumitomo PharmaCo.，Ltd.)测量各孔在450nm处的吸光度，并将此用作细胞数量增加的指标。
4.统计分析基于作为100％的无添加组的平均吸光度，计算了阳性对照组和化合物A添加组的值，并根据Dunnett多重比较检验法(单侧)比较了无添加组与化合物A添加组和阳性对照组。作为试验结果，小于5％的临界值被判定为显著的。
5.试验结果每组的细胞数量增加作用示于表1。测得的吸光度显示，阳性对照组和化合物A添加组的细胞数量显著高于无添加组的细胞数量为100％的无添加组，并且暗示了这些组中细胞数量的增加(p＜0.01)。从该试验结果可知，化合物A增加了正常人角膜上皮细胞的细胞数量。
表1
    组 细胞数量增加率(％) 显著差异(与无添加组比较)
    无添加组     100.0±7.7
    mEGF     147.5±47.2     **
    10-10M化合物A     177.4±20.8     **
    10-9M化合物A     169.0±8.2     **
    10-8M化合物A     187.4±10.2     **
    10-7M化合物A     172.6±16.0     **
当化合物A被添加至培养的正常人角膜上皮细胞时的细胞数量的变化被显示为为100％的无添加组的均值的相对值(平均值±标准偏差，N＝3-4)。表中的**表示与无添加组比较有显著差异(p＜0.01)。
(试验实施例2)对角膜上皮创伤愈合的促进作用的研究1.使用的动物使用雄性日本白兔(KITAYAMA LABES Co.，Ltd.)。根据用于涉及动物的生物医学研究的国际指导准则(International GuidingPrinciples for Biomedical Research Involving Animals)使用实验动物。
2.试验物质滴剂的制备方法使用了化合物A作为试验物质。将化合物A以0.0005％溶解于以下载体，或以0.005％混悬于以下载体，用作滴剂。磷酸二氢钠二水合物        0.05g氯化钠                    0.45g超纯水                    e.q.聚山梨醇酯80              0.05mL氢氧化钠                  e.q.总量                      50mL(pH 7.0)                                                     作为化合物A给药组的对照，使用了不含药剂的上述载体滴剂组。
3.试验方法1)角膜上皮刮擦动物接受了用于全身麻醉的Selactal(2％甲苯噻嗪；Bayer，Ltd.)∶Ketalar(5％氯胺酮；DAIICHI SANKYO COMPANY，LIMITED)＝1∶1混合物的肌肉注射(1mL/kg)，以及奥布卡因盐酸盐滴注(Benoxil滴注0.4％；Santen Pharmaceutical CO.，Ltd.)，然后露出眼球。使用10mm直径的环锯，在角膜中间部的角膜上皮上印上标记(直径10mm)，并在立体显微镜下，用打磨器(handy rooter)刮擦掉标记的环内的整个角膜上皮层。刮擦后，用生理盐水(OTSUKAPHARMACEUTICAL FACTORY，INC.)洗涤角膜表面，通过将眼球放回眶而结束角膜上皮刮擦处理。2)给药使用微型移液器，角膜上皮刮擦之日一天两次，其后至试验结束一天4次，将化合物A滴剂或滴剂载体每次滴注50μL至经处理的眼中。3)评价使用所有动物中结束角膜上皮刮擦的时间点为试验起始时间(0hr)，定量了40、48、56和64hr后的角膜上皮缺陷的面积，以此为基础评价了角膜上皮的创伤愈合。准确地说，在各时间点将0.1％荧光素钠(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)溶液(10μL)滴注至经处理的眼中，并使用带有蓝色滤光器的裂隙灯立即对动物的前眼部进行拍照，由此记录荧光素染色的角膜上皮缺陷区域。将显影的相片作为数码图像存储于电脑上，并使用图像分析软件(Image-Pro Plus)测量荧光素染色的角膜上皮缺陷的面积。
4.统计分析基于为100％的各动物的初始值，计算了各时间点测量的荧光素染色的角膜上皮缺陷的面积，并将其作为残存角膜上皮缺陷的比率。使用t-检验在载体滴注组与化合物A滴注组之间比较各时间点处的残存角膜上皮缺陷的比率。作为试验结果，小于5％的临界值被判定为显著的。
5.试验结果测量的各时间点处的载体滴剂组、和0.0005％与0.005％化合物A滴剂组中的残存角膜上皮缺陷的比率示于表2。其显示了在0.005％化合物A滴剂组中，在从角膜上皮刮擦起的40小时内，角膜上皮缺陷的比率显著减小。48小时后的0.0005％与0.005％化合物A滴剂组中，该比率显著减小。由该试验结果可知化合物A的滴剂促进角膜上皮缺陷的创伤愈合。
表2
组 载体滴剂组(％)   0.0005％化合物A滴剂组(％)  0.005％化合物A滴剂组(％)
  0hr(起始值)   100.0±0.0   100.0±0.0   100.0±0.0
  40hr后   28.1±5.3   24.8±2.7   18.6±8.0*
  48hr后   18.1±6.1   11.8±2.9*   9.1±6.4*
  56hr后   11.1±8.1   3.8±2.8   3.4±3.7
  64hr后   5.1±6.9   0.8±1.4   0.9±1.3
基于100％的起始值对每只动物计算了兔眼的角膜上皮刮擦处理后的残存角膜上皮缺陷的比例(％)(平均值±标准偏差，N＝6)。表中的*表示显著不同于载体滴剂组(p＜0.05)。
(试验实施例3)对睑板腺上皮细胞中细胞数量增加的作用1.猴睑板腺上皮细胞的制备将分离并保存在D-PBS中的猴眼睑转移至净化台，并在无菌条件下进行如下细胞制备。将分离的眼睑浸泡在80％乙醇中30秒，用添加有1％青霉素-链霉素(Invitrogen)的D-PBS洗涤三次，并转移至最低基础培养基(minimum essential medium)(MEM；Invitrogen)。在立体显微镜下除去眼睑的围绕睑板腺组织的脂肪组织和肌肉组织。将它们转移至含有0.3U/mL胶原酶A(Roche Diagnostics)和2.4U/mL分散酶II(RocheDiagnostics)的MEM中，在37℃振摇4hr并在4℃下过夜。将经酶处理的组织置于立体显微镜下，并除去睫毛和眼睑结缔组织以分离出睑板腺组织。向分离的腺体组织加入胰蛋白酶-EDTA(4mL Invitrogen)，并将混合物在37℃下孵育10分钟。孵育后，向其添加含有10％FBS(Invitrogen)的MEM(5mL)以终止酶反应，并且通过配备有21G注射针头的注射器重复抽排该混合物5次而分散构成组织的细胞。将细胞分散体通过100μm和40μm尼龙滤器(Cell Strainer；Falcon)，以除去包含于其中的无法被酶处理的细胞团等。将已通过滤器的细胞分散体收集于离心管中(50mL)并在室温下以1,500rpm离心5分钟。向含有通过离心获得的目的细胞的细胞层添加80μL含有0.5％牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich)的D-PBS，并于其中充分悬浮细胞。向其中添加抗成纤维细胞微珠(Militenyi Biotec，20μL)，并将该混合物在室温下静置30分钟。完成与抗体的反应后，向其中加入2mL含有0.5％BSA的D-PBS，并再次在室温下以1,500rpm离心5分钟。向含有通过离心获得的目的细胞的细胞层添加1mL含有0.5％BSA的D-PBS并于其中充分悬浮细胞，将该悬浮液滴加至预先采用柱洗液(含有2mM EDTA(DOJINDO LABORATORIES)和0.5％BSA的D-PBS)平衡的LD柱(Militenyi Biotec)。然后，向该LD柱滴加2mL的柱洗液。在刚滴加细胞悬液后到完成滴加柱洗液的期间，在50mL离心管中回收未被吸附至柱上的未被抗体标记的目的细胞(非成纤维细胞)。将收集在离心管中的细胞在室温下以1,500rpm离心5分钟，并除去上清液。将沉淀混悬于Defined Keratinocyte Serum Free Medium(成分明确的角质细胞无血清培养基)(5mL)，在室温下以1,500rpm离心5分钟，并除去上清液。将残渣再次混悬于DK-SFM(3mL)，在室温下以1,500rpm离心5分钟，并除去上清液。将细胞混悬于DK-SFM(2mL)，并接种于已用胶原处理的6孔细胞培养用多孔板上。接种的细胞培养于Defined Keratinocyte Serum Free Medium(DK-SFM；Invitrogen，按照制备方案所教导添加所附的补充物)，在设定为37℃、5％CO2、95％空气、100％湿度的培养箱(SANYO)中培养，并且培养基每48小时以新鲜培养基替换直至细胞变为亚汇合(subconfluent)。
2.试验物质溶液的制备方法作为试验物质，使用化合物A、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸(以下称作化合物B)或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸(以下称作化合物C)。将试验物质溶解于乙醇(Nacalai Tesque)至培养基中终浓度的200倍的浓度，并将该溶液保存于-80℃直到即将使用前。为考虑试验物质所致的细胞增殖促进作用，使用通过从DK-SFM中除去所附于DK-SFM的补充物而得的培养基作为基础培养基(基础DK-SFM)。作为用于证实细胞增殖促进作用的阳性对照，使用了通过向基础培养基添加所附补充物而得的培养基(完全DK-SFM)。
3.试验方法1)培养板的胶原处理在使用培养板前一天，向培养板的每孔分配50μL的0.01％I型胶原(Nitta Gelatin Inc.)，在4℃包被孔直至即将进行试验前。在试验当天，除去I型胶原溶液并用D-PBS洗涤培养板的底部3次，将此作为经胶原处理的培养板用在试验中。2)细胞培养和试验物质的添加对于试验，使用猴睑板腺上皮细胞，其已经在培养板(直径3.5cm)中培养至亚汇合并在液氮中冷冻保藏。将悬浮于Cellbanker(NipponZenyaku Kogyo Co.，Ltd.)并冷冻保藏的细胞融解，并转移至50mL离心管，添加10倍量的完全DK-SFM。通过在室温下以1,500rpm离心5分钟而收集细胞层。添加合适量的完全DK-SFM以得到3×106细胞/mL的所获细胞浓度。向每孔分配64μL的这种细胞悬浮液，使得用于组织培养的经胶原处理的96-孔培养板单位底部面积(0.32cm2)的细胞数量为6×104细胞/cm2。细胞接种结束后，将培养板转移至设定为37℃、5％CO2、95％空气、100％湿度的培养箱并培养24hr。将培养基替换为基础DK-SFM(100μL)并进一步培养24hr。然后将培养板的每孔中的培养基替换为100μL的以下各培养基，将培养板放回培养箱中并开始细胞刺激。[1]仅基础培养基(基础DK-SFM，无添加组)[2]基础培养基+补加物(完全DK-SFM，阳性对照组)[3]基础培养基+化合物A(终浓度：0.01μM、0.1μM和1μM；化合物A添加组)[4]基础培养基+化合物B(终浓度：0.01μM、0.1μM和1μM；化合物B添加组)[5]基础培养基+化合物C(终浓度：0.01μM、0.1μM和1μM；化合物C添加组)向培养基[1]和[2]各1mL加入乙醇(5μL)以使所有培养基的乙醇浓度都等于0.5％。2)细胞数的测量第一次细胞刺激起48小时后，用上述[1]-[5]的新制备的培养基替换培养基。48小时后，再次用上述[1]-[5]的新制备的培养基替换培养基。48小时后，从各孔除去培养上清，并向每孔加入100μL的添加有10％Cell Counting Kit-8(DOJINDO)的基础培养基。分配后，将培养板转移至设定为37℃、5％CO2、95％空气、100％湿度的培养箱中并孵育2hr。孵育2hr后，采用微量培养板读出器(DainipponPharmaceutical Co.，Ltd.)测量450nm处的吸光度，将此用作细胞数量增加的指标。
4.统计分析基于为100％的无添加组的平均吸光度，计算了阳性对照组和试验物质添加组的值，并根据Dunnett多重比较检验法(单侧)比较了无添加组与试验物质添加组和阳性对照组。作为试验结果，小于5％的临界值被判定为显著的。
5.试验结果每组的细胞数量增加促进作用示于表3。测得的吸光度显示，各试验物质添加组的细胞数量的增加显著高于无添加组的细胞数量为100％的无添加组，并且暗示了细胞数量的增加。在用于证实细胞数量增加促进作用的阳性对照组中，虽无显著性，但仍观测到了细胞数量增加的趋势。从该试验结果可知，各试验物质增加了猴睑板腺上皮细胞的数量。
表3
  组   细胞数量增加率(％)   显著差异(与无添加组比较)
  无添加组   100.0±7.1
  补充物   114.2±6.7
  10-8M化合物A   175.3±9.0   **
  10-7M化合物A   177.1±9.7   **
  10-6M化合物A   189.8±13.1   **
  10-8M化合物B   155.0±28.0   **
  10-7M化合物B   174.4±8.9   **
  10-6M化合物B   158.8±15.2   **
  10-8M化合物C   155.0±11.6   **
  10-7化合物C   175.2±7.8   **
  10-6M化合物C   179.4±7.5   **
当各试验物质或补充物(阳性对照)被添加至培养的猴睑板腺上皮细胞时的细胞数量的变化被显示为基于为100％的无添加组的均值的值(平均值±标准偏差，N＝5或10)。表中的**表示与无添加组比较有显著差异(p＜0.01)。
(试验实施例4)对增加正常人角膜上皮细胞的细胞数量的作用1.使用的细胞使用了正常人角膜上皮细胞(KURABO)。2.试验物质和制备方法作为试验物质，使用了化合物B或化合物C。将化合物B和化合物C溶解于乙醇(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)至培养基中终浓度的200倍的浓度，并将该溶液保存于-80℃直到即将使用前。作为用于考虑化合物B和化合物C所致细胞数量增加作用的细胞培养基，使用了通过向EpiLife(KURABO)添加含有在HCGS生长添加剂套件(KURABO)中的胰岛素、氢化可的松和铁传递蛋白而得到的培养基(基础培养基)。
3.试验方法1)细胞培养和试验物质的添加将冷冻保藏于液氮中的正常人角膜上皮细胞融解并对细胞数计数。将其总量转移至添加有全部HCGS生长添加剂套件(胰岛素、小鼠来源的表皮生长因子mEGF、氢化可的松、铁传递蛋白、牛脑下垂体提取物)的EpiLife(4mL，完全培养基)中，并于其中良好地悬浮。将该细胞悬浮液以2×104细胞/500μL/孔的细胞数接种于涂覆了纤连蛋白的24孔板(Becton Dickinson)上(由于底面积为2cm2，故为1×104细胞/cm2)。细胞接种结束后，将培养板在设定为37℃、5％CO2、95％空气和100％湿度的培养箱中孵育24小时，将培养基更换为400μL的基础培养基(添加有来自HCGS生长添加剂的胰岛素、氢化可的松和铁传递蛋白的EpiLife)。其后24小时后，将培养基更换为以下培养基(各400μL)。[1]仅基础培养基(无添加组)[2]基础培养基+mEGF(终浓度：1ng/mL；阳性对照组)[3]基础培养基+化合物B(终浓度：0.01μM、0.1μM、1μM；化合物B添加组)[4]基础培养基+化合物C(终浓度：0.01μM、0.1μM、1μM；化合物C添加组)向培养基[1]和[2]各1mL加入乙醇(5μL)以使所有培养基的乙醇浓度都等于0.5％。2)细胞数量的测量从化合物B或化合物C刺激起24小时后，从各孔除去培养上清，并向各孔加入200μL添加有10％Cell Counting Kit-8(DOJINDO)的基础培养基。加入后，将培养板转移至设定为37℃、5％CO2、95％空气和100％湿度的培养箱，孵育2hr。将上清(100μL)转移至组织培养用96孔培养板(Corning)中，并使用微量培养板读出器(DainipponSumitomo Pharma Co.，Ltd.)测量各孔在450nm处的吸光度，并将此用作细胞数量增加的指标。
4.统计分析基于为100％的无添加组的平均吸光度，计算了阳性对照组和化合物B或化合物C添加组的值，并根据Dunnett多重比较检验法(单侧)将无添加组与化合物B或化合物C添加组以及阳性对照组进行了比较。作为试验结果，小于5％的临界值被判定为显著的。
5.试验结果每组的细胞数量增加作用示于表4。测得的吸光度显示，阳性对照组、化合物B添加组和化合物C添加组的细胞数量显著高于无添加组的细胞数量为100％的无添加组，并且暗示了这些组中细胞数量的增加(p＜0.01)。从该试验结果可知，化合物B和化合物C两者均增加了正常人角膜上皮细胞的细胞数量。
表4
  组   细胞数量增加率(％)   显著差异(与无添加组比较)
  无添加组   100.0±32.2
  mEGF   232.8±22.5   **
  10-8M化合物B   252.4±34.7   **
  10-7M化合物B   256.4±11.0   **
  10-6M化合物B   254.3±11.7   **
  10-8M化合物C   243.3±6.6   **
  10-7M化合物C   247.5±14.1   **
  10-6M化合物C   260.2±2.5   **
当化合物B或化合物C被添加至培养的人角膜上皮细胞时的细胞数量的变化被显示为相对于为100％的无添加组的均值的值(平均值±标准偏差，N＝4)。表中的**表示与无添加组比较有显著差异(p＜0.01)。
(试验实施例5)PPARs在角膜上皮细胞和睑板腺上皮细胞中的表达1.使用的细胞使用的猴睑板腺上皮细胞是通过与(试验实施例3)类似的方法制备并培养的那些。使用的人角膜上皮细胞(KURABO)是培养于设定为37℃、5％CO2、95％空气、100％湿度的培养箱中以用于正常人角膜上皮细胞增殖的无血清基础培养基(EpiLife；Kurabo)培养的那些。使用的兔角膜上皮细胞是通过下述方法制备并培养的那些。从分离自无痛致死的兔的眼球切下角膜，保存在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(D-PBS；Invitrogen)中，并将其转移至净化台。以下的细胞制备操作均无菌地进行。将分离的角膜瓣(corneal button)用向其中添加有1％青霉素-链霉素(Invitrogen)的D-PBS洗涤三次，并将其转移至最低基础培养基(MEM；Invitrogen)。用眼手术刀(Alcon)将浸泡在MEM中的角膜瓣的角膜内皮细胞和Descemet膜剥离，并将剥离后的角膜瓣(角膜基质和角膜上皮)转移至添加有2.4U/mL分散酶II(Roche Diagnostics)的MEM中。将其在37℃孵育1小时，将经分散酶II处理的角膜瓣转移至MEM。采用眼手术刀将浸泡在MEM中的角膜瓣的角膜上皮剥离，并从MEM中去除角膜瓣残渣(角膜基质)。将含有剥离的角膜上皮细胞的MEM收集在50mL离心管中，在室温下以1,500rpm离心5分钟并弃去上清以得到角膜上皮细胞层。向该角膜上皮细胞层加入1mL胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)，充分混合混合物并在37℃下孵育5分钟以消除细胞-细胞粘合。向其中加入含有10％胎牛血清(FBS；Invitrogen)的9mL MEM以终止酶反应，再次在室温下以1,500rpm离心5分钟以获得角膜上皮细胞层。向得到的角膜上皮细胞层添加1mL的无血清液体培养基用于正常兔角膜上皮细胞生长(RCGM2；KURABO)以悬浮其中的细胞，将该细胞接种于添加有9mL的RCGM2的细胞培养板(直径10cm、IWAKI)中。接种的细胞培养在设置为37℃、5％CO2、95％空气、100％湿度的培养箱(SANYO)中。培养基每48小时用新鲜培养基替换直至试验日。2.试验方法1)从细胞提取总RNA根据TRizol试剂(Invitrogen)常规方法从各细胞提取总RNA。2)从提取的总RNA制备cDNA根据DNA-free(Ambion)常规方法将提取的总RNA用DNA酶在37℃处理30分钟，以除去基因组DNA。根据Superscript II逆转录酶(Invitrogen)常规方法从提取的总RNA制备cDNA。即，使用随机引物(Invitrogen)从1μg的总RNA制备与经DNA酶处理的该总RNA互补的cDNA。3)扩增PPARs基因(聚合酶链式反应；PCR)根据Platinum PCR SuperMix(Invitrogen)常规方法进行PPARs基因的PCR。参考人、猩猩、食蟹猴(macaca fascicularis)、牛、小鼠等的已知序列，设计PPARs引物以使PCR产物变得约200bps。PPARα：GTAGAATCTGCGGGGACAAG  (有义)(SEQ ID No.：1)：GTTGTGTGACATCCCGACAG  (反义)(SEQ ID No.：2)PPARδ：TTCCTTCCAGCAGCTACACA  (有义)(SEQ ID No.：3)：GATCGTACGACGGAAGAAGC  (反义)(SEQ ID No.：4)PPARγ：CTCCGTGGATCTCTCCGTAA    (有义)(SEQ ID No.：5)：GATGCAGGCTCCACTTTGAT    (反义)(SEQ ID No.：6)通过在94℃反应2分15秒，继之以94℃30秒、55℃30秒和72℃30秒的3-步反应35个循环，从而完成该PCR反应。将PCR反应后的样品在2％琼脂糖凝胶上电泳，并用SYBR Gold(Molecular Probes)对在凝胶中分离的DNA染色。将在UV透射仪上发光的经染色DNA的图像存储为数字数据。
3.试验结果电泳后的DNA条带示于图1。作为该试验的结果，证实所有PPARα、PPARδ和PPARγ均在人角膜上皮细胞和猴睑板腺上皮细胞中表达。在兔角膜上皮细胞中，仅证实了PPARδ的表达。Bonazzi等人报道，来自PPARs的PPARα和PPARβ(＝δ)在兔角膜上皮细胞中表达(Bonazzi A.et al.，J.Biol.Chem.(2000)；275(4)：2837-2844)，在该报告中，他们使用了特殊方法以检测PPARα，暗示PPARα在兔角膜上皮细胞中的表达水平极其小。产业实用性
根据本发明，提供了促进睑板腺上皮细胞增殖的新型试剂或促进角膜上皮细胞增殖的新型试剂，所述试剂促进睑板腺上皮细胞或角膜上皮细胞增殖。此外，本发明的治疗剂可有效用于治疗或改善疾病比如睑板腺功能异常、角膜上皮病症、干眼等。
本申请基于在日本提交的专利申请No.2007-134183(提交日：2007年5月21日)，在此通过引用将其内容全部并入本文。
序列表
<110>Senju Pharmaceutical Co.，Ltd.
     Nippon Chemiphar Co.，Ltd.
<120>含有PPARΔ激动剂的药物
<130>091238
<150>JP 2007-134183
<151>2007-05-21
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
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ttccttccag cagctacaca                                20
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<223>引物
<400>6
gatgcaggct ccactttgat                                20

Claims (6)

1.[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐的用途，用于生产促进睑板腺上皮细胞增殖的试剂。
2.[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐的用途，用于生产促进角膜上皮细胞增殖的试剂。
3.[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐的用途，用于生产治疗睑板腺功能异常的试剂。
4.[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐的用途，用于生产治疗角膜上皮病症的试剂。
5.[3-[2-[4-异丙基-2-(4-三氟甲基)苯基-5-噻唑基]乙基]-5-甲基-1，2-苯并异噁唑-6-基]乙醇酸、[4-[3-[2-(4-三氟甲基)苯基-4-异丙基-5-噻唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸或[4-[3-[2-(2-羟基-4-氯苯基)-5-异丙基-4-噁唑基]丙酰基]-2-甲基苯氧基]乙酸、或它们的可药用盐的用途，用于生产治疗干眼的试剂。
6.权利要求5的用途，其中所述干眼是蒸发过强型干眼。 
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