CN101797266B

CN101797266B - 一种含有槲皮苷的药物组合物及用途

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Publication number: CN101797266B
Application number: CN2010101519510A
Authority: CN
Inventors: 张登科
Original assignee: Individual
Current assignee: XI'AN XINTONG PHARMACEUTICAL RESEARCH CO LTD
Priority date: 2010-04-21
Filing date: 2010-04-21
Publication date: 2011-08-03
Anticipated expiration: 2030-04-21
Also published as: CN101797266A

Abstract

本发明提供了槲皮苷在制备用于预防或治疗流行性感冒病毒、腺病毒、金黄色葡萄球菌、和/或溶血性链球菌等引起的疾病的药物中的应用以及其药物组合物，该药物组合物抗流行性感冒病毒的活性与达菲(奥司他韦)相当。

Description

一种含有槲皮苷的药物组合物及用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及槲皮苷在制备用于预防或治疗流行性感冒病毒、腺病毒、金黄色葡萄球菌和/或溶血性链球菌等引起的疾病的药物中的应用以及其药物组合物。

背景技术

槲皮苷是槲皮素的结构类似物，其分子结构式为：

尽管槲皮素及其衍生物有许多文献报道，但是槲皮苷本身的研究却很少，而且槲皮苷本身的研究基本上都集中于中药提取物质量控制的研究方面。例如，中国专利申请第99120216.3号公开了槲皮素的制备方法及其在预防或治疗抑郁或焦虑中的应用；

中国专利申请99812942.9号公开了槲皮素和异槲皮素(槲皮素-7-鼠李糖苷)的方法及在化妆品中的应用；

中国专利申请第200410099268号公开了包含槲皮苷、异槲皮苷以及田基黄双呫吨酮等成分的中药组合物，用于治疗肝脏疾病；

中国专利申请200610118154.6号公开了槲皮素-7-O-葡萄糖甙在柁木或其制剂质量控制中的应用；

中国专利申请号200610045292.6公开了槲皮素的制备方法及应用；

中国专利申请号200410062585.6公开了槲皮素衍生物三羟乙基槲皮素在治疗或预防心脑血管或预防脑卒中疾病；

中国专利申请号200580045205.0公开了α-糖基异槲皮苷的新型组合物，该化合物具有抗氧化活性；

中国专利申请号200810038858.1公开了芦丁和异槲皮苷(槲皮素-7-鼠李糖苷)在制备抗炎药物的应用。

然而，槲皮苷对来自哺乳动物(特别是人)的流行性感冒病毒和腺病毒，尤其是甲型流行性感冒病毒，特别是新近出现的H1N1型流行性感冒病毒的预防和治疗功效，没有报道；对人常见伤口感染的元凶——金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的抗菌作用，也没有报道。这些病毒和细菌严重威胁了人类的健康，甚至世界面临着它们大爆发的威胁。尽管达菲等药物对H1N1型流行性感冒病毒的治疗有效，但是其价格昂贵，在广大第三世界国家全面推广使用并不容易。

为此，本发明人经过艰苦努力，制得了含有槲皮苷作为唯一有效成分的药物组合物，其成本低廉，适合推广，而且在抗流行性感冒病毒、腺病毒、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌等病菌方面有着良好的作用。另外，当前公众和医药监管部门对药物的副作用和不良反应日益重视，为此本发明人特别研究了槲皮苷的安全剂量，令人意外的是，本发明人经过艰苦的动物实验后发现，尽管高剂量的槲皮苷会带来较大的用药安全隐患，但是优选出的治疗剂量不但能够在动物实验中起到有效治疗的作用，而且远远低于可能会带来用药安全隐患的剂量，确保了用药安全和治疗有效性。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供槲皮苷作为唯一有效成分以安全、有效的剂量用于预防和/或治疗流行性感冒病毒、腺病毒、金黄色葡萄球菌和/或溶血性链球菌引起的疾病，并提供相应的药物组合物和体外施用方法。

本发明取得的有益效果包括：使用单一有效成分，比如中草药提取物等中的多种有效成分的混合物更容易控制药物生产质量，从而更大程度地保证了用药安全；安全剂量和有效剂量相适应，从而能够实际用于预防和/或治疗流行性感冒病毒、腺病毒、金黄色葡萄球菌和/或溶血性链球菌引起的疾病，并且对哺乳动物取得了很好的疗效，如在抗流行性感冒病毒的疗效上与达菲相当；成本相对相同或相近疗效的药物(如，达菲)要低得多，因此适合推广应用，尤其适合在第三世界国家推广；制剂配方可靠，不干扰有效成份活性的发挥，而且经过优化的制备方法不易引入杂质，更大限度地减少了安全隐患。

在本发明中，槲皮苷可以是从植物中提取、纯化出来的，也可以是化学合成的。这两者在化学结构上没有区别，出于成本的考虑，本发明优选采用从植物中提取、纯化出来的槲皮苷。例如，宋亚丽等人在“合欢花中槲皮苷提取工艺的试验研究”一文中，采用甲醇回流提取3次，每次提取8h或者70％甲醇超声提取三次，每次提取20min的方法提取出高纯度的槲皮苷；又如，杨秀利等人在“荨麻疹槲皮苷提取工艺的研究”一文中，采用70％乙醇80℃提取3h，提取率可达到211mg/kg，大大降低了槲皮苷的成本。

在本发明中，药物、药物组合物和药物制剂等名词可以互换使用，均是指由有药用作用的有效成份和药学上可接受的辅料组成的组合物。本发明的药物制剂优选为单位剂量形式的制剂(在本文中，简称为单位制剂)，如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释释放形式)、粉剂、混悬剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液、针剂等剂型以及各种缓释剂型，从而适合各种给药方式，例如口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等的给药形式。优选每一单位剂量的制剂(如，一片、一粒、一针等可以一次给药的制剂)中有效成分的含量是对哺乳动物安全并有效的，最优选是对成人安全并有效的，由此可以让医生、护士或者患者自己在给药时方便地一次给药完成。某一有效成分对哺乳动物的安全剂量和有效剂量是否能够相适应(如，有效剂量必须大大低于安全剂量的高限才有药用的可能)通常无法根据化学结构来直接预测，需要进行动物实验等实验并得出结果后才能判断。根据实验动物与人的等效剂量换算关系(通常可参见FDA、SFDA等药品管理机构的指导意见，也可参见“黄继汉等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算.中国临床药理学与治疗学，2004 Sep；9(9)：1069-1072”)，可从实验动物的剂量推导出成人的剂量，并根据成人的平均体重来换算出每一单位剂量的制剂中有效成分的含量。

在本发明中，槲皮苷是药物中的唯一有效成分，从而可以单独作为有效成分来制备药物，如与药学上可接受的辅料组成药物组合物。尽管有许多中药组合物或中药提取物中含有槲皮苷，但是其不是唯一的有效成份，通常还包括含量大到不可忽视甚至超过槲皮苷含量的槲皮素和异槲皮素等潜在的有效成份，这样含多种潜在有效成分的药物使得药物生产更为复杂，质量控制要求更高，因此本发明不适用这样的技术方案，从而简化了药物生产和质控流程。需要特别指出的是，由于中药组合物或中药提取物中潜在的不同的有效成分有可能会带来协同效应、叠加效应和/或抵消效应，甚至不能确定不同的有效成分是否带来了带来协同效应、叠加效应和/或抵消效应，更不清楚各种效应的程度，因此当前难以根据中药组合物或中药提取物中的含量来推算唯一有效成分的安全剂量和有效剂量，甚至由于动物实验等实验成本的高昂，本领域技术人员在没有效益预期的情况下，也不会贸然选择任一个有效成分去尝试。

在本发明中，药学上可接受的辅料包括药学上可接受的载体、赋形剂、和/或稀释剂等，它们与活性成分相容。运用药学上可接受的辅料制备药物组合物对本领域普通技术人员来说是公知的，如将槲皮苷和药学上可接受的辅料(如本领域技术人员所知的载体、赋形剂、和/或稀释剂等)混合在一起，配制成各种制剂，优选为固体制剂和液体制剂，如口服制剂或注射制剂。然而，由于本领域技术人员所知的载体、赋形剂、和/或稀释剂数量众多，某些载体、赋形剂、和/或稀释剂甚至可能加速水解掉槲皮苷上的鼠李糖部分等，造成制剂不稳定，因此辅料的选择也需要进行摸索，根据实验结果来判断，而无法事先预测。本发明的药学上可接受的辅料优选选自乳糖、微晶纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮K₃₀、硬脂酸镁、吐温80、蔗糖、山梨酸、阿斯巴坦、丙二醇、甘露醇和泊洛沙姆188之一种或多种。经过本发明人的艰苦研究，上述辅料都可以有效地与槲皮苷组成药物组合物。最优选本发明的药物自己是按照本发明的具体实施方式制备的，其制备过程也没有产生影响制剂质量的降解杂质，例如：

可以是槲皮苷口服片剂，其通过以下方法制备：

称取50重量份的槲皮苷、100重量份的乳糖、30重量份的微晶纤维素和10重量份的交联聚乙烯吡咯烷酮，充分混合均匀，然后加入20重量份水所对应体积的3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K₃₀乙醇溶液，制成软材，过20目筛制粒，45℃鼓风干燥，18目筛整粒，最后加入0.5重量份的硬脂酸镁，混合均匀后压片；

还可以是槲皮苷口服液，其通过以下方法制备：

先将100重量份的槲皮苷和20重量份的吐温80混合均匀后，加入到8000重量份的水中溶解(任选是加热溶解)，然后加入100重量份的蔗糖、10重量份的山梨酸和1重量份的阿斯巴坦，调节pH值至4～6，最后加水定容至10000重量份水所对应的体积，混匀均匀后分装；

还可以是槲皮苷液体注射剂，其通过以下方法制备：

称取20重量份的槲皮苷，加入50％(V/V)丙二醇溶液4000重量份水所对应的体积，溶解(任选是加热溶解)，然后加入活性炭并于70℃下搅拌15min，过0.45μm滤膜过滤以去除活性炭，然后加入50％(V/V)丙二醇溶液定容至5000重量份水所对应的体积，混匀均匀后分装；

也可以是槲皮苷注射用冻干剂，其通过以下方法制备：

称取5重量份的泊洛沙姆188，加入到2500重量份的注射用水中溶解，然后加入20重量份的甘露醇，溶解后，再加入20重量份的槲皮苷，完全溶解(任选是加热溶解)后，加入活性炭并于60℃下搅拌15min，过滤以去除活性炭，然后冷至室温，用注射用水定容至3000重量份水所对应的体积，混匀均匀后分装并放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，其中冷冻干燥的条件为：预冷冻4h，板层温度为-40℃，制品温度为-20℃，开启真空泵开始升华，升华阶段制品温度控制在-15℃，待水线到底后，制品温度缓缓升至35℃，板层温度为40℃，保温6小时。

具体而言，在第一方面，本发明提供了槲皮苷单独作为有效成分在制备用于预防或治疗流行性感冒病毒和/或腺病毒引起的疾病的药物中的应用。

优选在本发明的第一方面中，药物是口服型药物或注射型药物，即是口服制剂或注射制剂。根据本发明实施例中的实验结果判断，其中每单位制剂中的槲皮苷的含量不超过200mg，优选含量是1～150mg，更优选含量是5～100mg，更优选含量是10～50mg，最优选含量是10～30mg，如10mg、15mg、20mg、25mg、或30mg。按制剂类型来细分，优选每单位口服制剂中的槲皮苷的含量是5～100mg，更优选含量是10～50mg，如10mg、20mg、30mg、或50mg；优选每单位注射制剂中的槲皮苷的含量是5～50mg，更优选含量是10～30mg，如15mg、20mg、或25mg。

优选在本发明的第一方面中，流行性感冒病毒是哺乳动物流行性感冒病毒，优选是人、猪、牛、羊、狗、猫或鼠的流行性感冒病毒，最优选是人流行性感冒病毒。也优选在本发明的第一方面中，流行性感冒病毒是甲型流行性感冒病毒或A/WS/33流行性感冒病毒，尤其是H1N1型流行性感冒病毒。在本发明的具体实施方式中，尽管槲皮苷针对H1N1型流行性感冒病毒的效果较达菲稍弱，但是考虑到槲皮苷的成本，其应用的前景非常广阔；更令人意想不到的是，槲皮苷针对A/WS/33流行性感冒病毒的效果还大大优于达菲。另外，优选在本发明的第一方面中，腺病毒是3型腺病毒。

在第二方面，本发明提供了槲皮苷单独作为有效成分在制备用于预防或治疗金黄色葡萄球菌和/或溶血性链球菌引起的疾病的药物中的应用。

优选在本发明的第二方面中，药物是口服型药物或注射型药物，即是口服制剂或注射制剂。根据本发明实施例中的实验结果判断，其中每单位制剂中的槲皮苷的含量不超过200mg，优选含量是1～150mg，更优选含量是5～100mg，更优选含量是10～50mg，最优选含量是10～30mg，如10mg、15mg、20mg、25mg、或30mg。按制剂类型来细分，优选每单位口服制剂中的槲皮苷的含量是5～100mg，更优选含量是10～50mg，如10mg、20mg、30mg、或50mg；优选每单位注射制剂中的槲皮苷的含量是5～50mg，更优选含量是10～30mg，如15mg、20mg、或25mg。

优选在本发明的第二方面中，疾病是感染，如败血症。金黄色葡萄球菌和/或溶血性链球菌(优选是乙型溶血性链球菌)是造成多种感染(如，外伤感染、手术感染等)的病原体，而根据本发明具体实施方式的实验，槲皮苷单独作为有效成分就可以有效治疗感染上述细菌的小鼠。

在第三方面，本发明提供了抗病毒和/或抗菌的药物组合物，其由槲皮苷和药学上可接受的辅料组成。优选所述药物组合物抗流行性感冒病毒、腺病毒、抗金黄色葡萄球菌、和/或抗溶血性链球菌，例如可以抗甲型流行性感冒病毒(如，H1N1型流行性感冒病毒)、A/WS/33流行性感冒病毒、和/或乙型溶血性链球菌。

优选在本发明的第三方面中，药物组合物是口服制剂或注射制剂。根据本发明实施例中的实验结果判断，其中每单位制剂中的槲皮苷的含量不超过200mg，优选含量是1～150mg，更优选含量是5～100mg，更优选含量是10～50mg，最优选含量是10～30mg，如10mg、15mg、20mg、25mg、或30mg。按制剂类型来细分，优选每单位口服制剂中的槲皮苷的含量是5～100mg，更优选含量是10～50mg，如10mg、20mg、30mg、或50mg；优选每单位注射制剂中的槲皮苷的含量是5～50mg，更优选含量是10～30mg，如15mg、20mg、或25mg。最优选，本发明第三方面的药物组合物是如本发明的具体实施方式之任一制备的，尤其是槲皮苷口服液或槲皮苷注射用冻干剂。

在第四方面，本发明提供了制备本发明第三方面的药物组合物的方法，其包括将槲皮苷和药学上可接受的辅料混合在一起的步骤。优选其中，药学上可接受的辅料优选选自乳糖、微晶纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮K₃₀、硬脂酸镁、吐温80、蔗糖、山梨酸、阿斯巴坦、丙二醇、甘露醇和泊洛沙姆188之一种或多种。

优选在本发明的第四方面中，所述方法包括，将重量为每单位制剂中的槲皮苷的含量的N倍的槲皮苷和药学上可接受的辅料混合在一起，将混合产物封装成N份，其中N是正整数。根据本发明实施例中的实验结果判断，其中每单位制剂中的槲皮苷的含量不超过200mg，优选含量是1～150mg，更优选含量是5～100mg，更优选含量是10～50mg，最优选含量是10～30mg，如10mg、15mg、20mg、25mg、或30mg。按制剂类型来细分，优选每单位口服制剂中的槲皮苷的含量是5～100mg，更优选含量是10～50mg，如10mg、20mg、30mg、或50mg；优选每单位注射制剂中的槲皮苷的含量是5～50mg，更优选含量是10～30mg，如15mg、20mg、或25mg。最优选，本发明第四方面的方法是本发明的具体实施方式之任一。

在第五方面，本发明提供了在体外抗病毒或杀菌的方法，其包括，在疑似存在流行性感冒病毒、腺病毒、金黄色葡萄球菌、和/或溶血性链球菌的非体内地方施放浓度为0.1～5mg/mL的槲皮苷溶液，优选浓度为0.5～3mg/mL，更优选浓度为1mg/mL。优选本发明第五方面的方法包括，在疑似存在流行性感冒病毒(如甲型流行性感冒病毒，优选如H1N1型流行性感冒病毒等)的非体内地方施放浓度为0.1～5mg/mL的槲皮苷溶液，优选浓度为0.5～3mg/mL，更优选浓度为1mg/mL。根据本发明具体实施方式的实验结果，以上浓度可以在体外有效抑制流行性感冒病毒。

为了便于理解，以下将通过具体实施例对本发明进行描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。另外，本发明引用了现有文献，它们全部纳入本文参考，就好像它们在本文中全部重复叙述过一样。

附图说明

图1为本发明实施例1中槲皮苷注射用冻干剂的冻干曲线图。

图2为本发明实施例2中槲皮苷片抗病毒(流感A/WS/33病毒)活性试验图。

具体实施方式

实施例1槲皮苷药物制剂的制备和安全性测试

1.1槲皮苷口服片剂的制备

处方：槲皮苷 50g

乳糖 100g

微晶纤维素 30g

交联聚乙烯吡咯烷酮 10g

3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K₃₀乙醇溶液 20ml

硬脂酸镁 0.5g

制成1000片

具体制备方法：称取处方量的槲皮苷和辅料，将之充分混合均匀，加入3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K₃₀乙醇溶液制成软材，20目筛制粒，45℃鼓风干燥，18目筛整粒，加入处方量的硬脂酸镁，混合均匀，压片，包薄膜衣，即得。

1.2槲皮苷口服液的制备

处方：槲皮苷 100g

吐温80 20g

蔗糖 100g

山梨酸 10g

阿斯巴坦 1g

加水 10000ml

制成1000支

具体制备方法：先将处方量的槲皮苷和吐温80混合均匀后，加入到8000ml水中，加热至溶解，加入处方量的蔗糖、阿斯巴坦、山梨酸，调节pH值4～6，加水至10000ml，混匀，分装，灭菌即得。

1.3槲皮苷液体注射剂的制备

处方：槲皮苷 20g

活性炭 1g

50％丙二醇加至5000ml

制成1000支

具体制备方法：

称取处方量的槲皮苷，加入50％丙二醇4000ml，加热至60℃搅拌溶解，加入1g活性炭，70℃下搅拌15min，0.45μm滤膜过滤，冷至室温，加入50％丙二醇稀释至刻度，搅匀，灌封，每支2ml，流通蒸汽100℃灭菌30min，灯检，即得。

1.4槲皮苷注射用冻干剂的制备

处方：槲皮苷 20g

甘露醇 20g

泊洛沙姆188 5g

活性炭 1.5g

注射用水加至3000ml

制成 1000支

具体制备方法：

称取处方量的泊洛沙姆188，加入到2500ml注射用水中，搅拌溶解，加入处方量的甘露醇，搅拌溶解后，再加入处方量的槲皮苷，加热至60℃，搅拌至完全溶解，加入1.5g活性炭，60℃下搅拌15min，过滤，冷至室温，注射用水加至3000ml。分装，每支3ml，放入冷冻干燥机中，进行冷冻干燥(冻干曲线如图1所示)，进箱后，预冷冻4h，板层温度为-40℃，制品温度为-20℃，开启真空泵开始升华，升华阶段制品温度控制在-15℃(制品共熔点约在-6℃)，待水线到底后，制品温度缓缓升至35℃，板层温度为40℃，保温6小时，压塞，轧盖。

1.5注射用槲皮苷的安全性检测

1)急性毒性试验

按照国家食品监督管理局药品审评中心的中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则，以实施例1.4方法制备的制剂对小鼠进行安全性检测，发现小鼠静脉注射的LD₅₀：830mg/kg(以槲皮苷计)。

2)溶血、全身过敏刺激试验

将实施例1.4方法制备的制剂以生理盐水配成1％(g/ml)(以槲皮苷计)的浓度，豚鼠以1ml/只腹腔注射给药，隔日一次，连续三次，给药后第14天及21天以2ml/只静脉注射给药进行攻击性试验，结果未见豚鼠有明显的全身过敏反应；溶血试验结果表明该药无溶血现象发生。将实施例1.4方法制备的制剂以生理盐水配成1％(g/ml)(以槲皮苷计)的浓度，以1ml/kg兔耳缘静脉滴注给药每天一次，连续7天，给药后对注射部位进行肉眼观察及病理学切片检查，检查结果表明该剂量槲皮苷对血管无明显的刺激作用。

实施例2槲皮苷的药效学试验

1、试验材料

1.1动物：ICR品系小鼠，♀

各半，体重18-22g，质量合格证：陕医动字200-006号；新西兰大白兔，♀

兼用，体重2-2.5g，合格证为SCXK(陕)2009-001号，购自西安交通大学医学院实验动物中心。

1.2受试药物

试验药品：实施例1.2方法制备的槲皮苷口服液(以槲皮苷计：10mg/ml)

阳性药：环磷酰胺(CTX)注射干粉，200mg/支。上海华联制药有限公司，批号091020。

乳糖红霉素注射液。西安利君制药公司，批号20090410

病毒唑注射液规格：0.1g/支。郑州永和制药有限公司，批号：0910056

达菲规格：75mg 宜昌长江药业有限公司(四川)批号：091221

(一)体外抗流感病毒(FM1株)作用结果

对甲型流感病毒FM1株的抑制作用

设受试药物槲皮苷口服液梯度浓度实验组、阳性药物对照组、病毒对照组和正常对照组。A组：测定药液对病毒的最小直接灭活浓度

用Hank’s液将流感病毒FM1株病毒液稀释为2000血凝单位/ml，分别与各梯度稀释的槲皮苷口服液或对照药液(2mg/ml病毒唑)等体积混合，室温作用4h；用Hank’s液将作用液稀释50倍后接种鸡胚尿囊腔，0.2ml/胚，每一作用液平行接种6个鸡胚。病毒对照组接种40血凝单位/ml FM1病毒液0.2ml/胚。37℃孵育72h，收获鸡胚尿囊液，用血球凝集试验测定FM1滴度。与病毒对照组比较，能明显降低病毒滴度的最小药物浓度为对病毒的最小直接灭活浓度。

B组：测定药液对病毒在鸡胚内增殖的最小抑制浓度

用Hank’s液将流感病毒FM1株病毒液稀释为40血凝单位/ml，接种鸡胚尿囊腔，0.2ml/胚。2小时后，将不同梯度稀释的槲皮苷口服液或对照药液(2mg/ml病毒唑)再接种于已接种过病毒的鸡胚尿囊腔，0.2ml/胚，同一浓度药液平行接种6个鸡胚。病毒对照组接种Hank’s液。37℃孵育72h，收获鸡胚尿囊液，用血球凝集试验测定FM1滴度。与病毒对照组比较，能明显降低病毒滴度的最小药物浓度为对病毒增殖的最小抑制浓度。

C组：测定药液对病毒在鸡胚内增殖的最小有效预防浓度

先将各梯度稀释的槲皮苷口服液或对照药液(2mg/ml病毒唑)接种于鸡胚尿囊腔，0.2ml/胚，同一浓度药液平行接种6个鸡胚。病毒对照组接种Hank’s液。37℃孵育12小时后，接种40血凝单位/ml FM1病毒液，0.2ml/胚。37℃孵育72h，收获鸡胚尿囊液，用血球凝集试验测定FM1滴度。与病毒对照组比较，能明显降低病毒滴度的最小药物浓度为对病毒增殖的最小有效预防浓度。

试验结果：

(1)药物对鸡胚的最大无毒浓度

接种药物后每日观察鸡胚发育存活情况，24h内死亡属于非特异性死亡。72h后取胚观察。正常对照组鸡胚全部存活，发育良好。每胚接种0.2ml槲皮苷浓度为10mg/ml实验组中鸡胚死亡，胚体小，并有明显出血斑点，表明该药液浓度对鸡胚有毒性作用。每胚接种0.2ml槲皮苷的浓度为5mg/ml以及以下各浓度组中的鸡胚发育正常。

槲皮苷口服液对9日龄鸡胚的最大无毒浓度为1mg/胚(以槲皮苷计)。

(2)对甲型流感病毒FM1株的抑制作用见表1。

*P＜0.05vs病毒对照组

表1槲皮苷口服液对流感病毒FM1株的作用

从表1可以看出，槲皮苷片对流感病毒FM1的最小直接灭活浓度、对FM1在鸡胚内增殖的最小抑制浓度以及对FM1在鸡胚内增殖的最小有效预防浓度均为0.5mg/ml。

(二)体外抗病毒(A/WS/33病毒)活性试验

按照国家食品药品监管理局药品审评中心中的中药、天然药物一般药理学研究技术指导原则，以达菲为对照，进行体外抗病毒测试，试验结果见附图2。结果表明，槲皮苷和达菲浓度在浓度为100μg/ml时抗病毒(流感A/WS/33病毒)活性分别为85％和60％，在浓度为10μg/ml时抗病毒活性分别为68％和49％。

(三)体外结合H1N1膜蛋白的试验结果

将实施例1.2方法制备的槲皮苷口服液与达菲不同浓度体外结合H1N1膜蛋白的试验结果见表2。

表2槲皮苷口服液结合结合H1N1膜蛋白的试验结果

试验结果表明槲皮苷对甲型H1N1病毒有明显的抑制作用，效果较达菲稍弱。

(四)体内抗病毒实验报告

实验病毒株：甲型流行性感冒病毒鼠肺适应株(RNA病毒)FM1株、3型腺病毒(DNA病毒)株：可购自中国医学科学院北京病毒研究所。

实验方法及结果参照《卫生部药政局新药临床前研究指导》中“体内抗病毒试验原则”和《中药药理研究方法学》，以ICR小鼠为实试验动物，采用孙氏综合法测定槲皮苷对甲型流行性感冒病毒FM1株、3型腺病毒标准株感染小鼠的半数保护量，计算其95％可信限。结果如下：

槲皮苷对甲型流感病毒FM1株感染小鼠的ED₅₀及其95％可信限见表3，对3型腺病毒标准株感染小鼠的ED₅₀及其95％可信限见表4。

表3对甲型流感病毒FM1株感染小鼠体内保护试验结果

表4对3型腺病毒标准株感染小鼠体内保护试验结果

实验结果表明，槲皮苷口服液对甲型流行性感冒病毒FM1株、3型腺病毒标准株感染的小鼠有明显的保护作用，可以用于呼吸道病毒感染的预防和治疗。

(五)体内抗菌实验报告

实验菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25925株、乙型溶血性链球菌32210株：冻干菌株均可购自中国预防医学科学院北京药品生物制品研究所。

实验方法：参照《卫生部药政局新药临床前研究指导》中“体内抗菌试验原则”和《中药药理研究方法学》，以ICR小鼠为试验动物，采用孙氏综合法测定槲皮苷口服液对金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌感染ICR小鼠的半数保护量，计算其95％可信限。结果见表5、表6。

表5对金黄色葡萄球菌ATCC25925株感染小鼠体内保护试验结果

表6对乙型溶血性链球菌32210株感染小鼠体内保护试验结果

结果表明，槲皮苷口服液对金黄色葡萄球菌感染小鼠的ED₅₀为1.9539mg/kg，95％可信限为1.2071～3.1627mg/kg。对乙型溶血性链球菌感染小鼠的ED₅₀为1.1616mg/kg，95％可信限为1.5951～3.9183mg/kg。