CN101795570A - 用于灭活形成孢子的和/或未形成孢子的球虫亚纲寄生虫的水性组合物 - Google Patents

用于灭活形成孢子的和/或未形成孢子的球虫亚纲寄生虫的水性组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于灭活形成孢子的和/或未形成孢子的球虫亚纲寄生虫的水性组合物，其含有15至115ppm二氧化氯和0.01至1wt％的具有一个或多个C6至C18烷基和一个或多个芳基的阴离子表面活性剂。本发明进一步涉及制备该组合物的方法和通过施用该组合物来灭活形成孢子的和/或未形成孢子的球虫亚纲的方法。

Description

用于灭活形成孢子的和/或未形成孢子的球虫亚纲寄生虫的水性组合物
本发明的技术领域涉及用于灭活形成孢子的和/或未形成孢子的球虫亚纲寄生虫的水性组合物。本发明的另外的目的是制备该水性组合物的方法和通过应用该组合物来灭活形成孢子的和/或未形成孢子的球虫的方法。
球虫是形成孢子的寄生虫，其感染动物的肠道。球虫是专性胞内寄生虫，这意味着它们必须在动物细胞内生活和繁殖。
由球虫感染引起的疾病称为球虫病。这是通过接触受感染的粪便在动物与动物之间传播的寄生虫病。该疾病的主要症状是腹泻，在严重的病例中腹泻是带血的。老年受感染的动物是无症状的，这意味着它们显示无该疾病的症状。然而，年幼或免疫受损的动物可能遭受严重的症状，包括死亡。
球虫可以感染多种动物，包括人类和家畜。
球虫病可以被认为是主要的寄生虫病，对家禽、猪肉和牛肉的生产具有重大的经济影响。这些经济影响由以下事实引起：为避免球虫病在家畜中的传播，预防性饲料投药是必需的。如果预防性投药失败和饲料转化率差，对于受侵袭的种禽的影响是有害的。对于预防性饲料投药，目前使用球虫抑制剂或疫苗。然而，还知道的是球虫亚纲寄生虫对这些产品的抗性日益增大。
其中，球虫目(Coccidiae)包括艾美耳球虫科(Eimeriidae)和Lankesterellidae。在家畜中引起疾病的球虫是艾美耳球虫属(Eimeria)、泰泽球虫属(Tyzzeria)和等孢球虫属(Isospora)；球虫目的所有属。这些目还包括其他引起人类疾病的病原体(环孢子球虫属(Cyclospora)、隐孢子球虫属(Cryptosporidium)和弓形虫属(Toxoplasma))。禽类球虫病主要是由艾美耳球虫属种引起的：柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)、毒害艾美耳球虫(Eimerianecatrix)、Eimeria macima、布氏艾美耳球虫(Eimeria brunetti)、堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)、变位艾美耳球虫(Eimeriamivati)、早熟艾美耳球虫(Eimeria praecox)和和缓艾美耳球虫(Eimeria mitis)在小鸡(肉用种鸡)中引起疾病，鸭艾美耳球虫(Eimeria anatis)和丹氏艾美耳球虫(Eimeria danailovi)在鸭中引起疾病，腺型艾美耳球虫(Eimeria adenoides)、火鸡孔雀艾美耳球虫(Eimeria gallopavoris)、火鸡艾美耳球虫(Eimeriameleagridis)和火鸡和缓艾美耳球虫(Eimeria meleagrimitis)在火鸡中引起疾病。存在许多其他的艾美耳球虫属种，在其他禽类(鹅、雉、山鹑等)中特异性地引起疾病。艾美耳球虫属种在猪(Eimeriadebliechi)和牛(牛艾美耳球虫(Eimeriab bovis)、邱氏艾美耳球虫(Eimeria zuernii)和椭圆艾美耳球虫(Eimeria ellipsoidalis))中发现并在其中引起疾病。
在所有提及的宿主物种中，临床症状可能不同。致病性取决于宿主身体状况、年龄和免疫状态。在宿主内，每个艾美耳球虫属种的致病性水平可能不同。在雏鸡、断奶的猪和小牛内，临床体征主要是性能和FCR(食物转化率)的损失。艾美耳球虫引起肠道的坏死性炎症，这导致盲肠损伤，粪便带血，肠道损伤或死亡。再者，肠炎的水平在物种范围内可能不同。柔嫩艾美耳球虫在雏鸡中引起严重的盲肠损伤，粪便带血。堆型艾美耳球虫在雏鸡中引起肠道损伤，这通过坏死性肠炎导致死亡。毒害艾美耳球虫在肉用种鸡等中引起猝死。
禽类艾美耳球虫属是具有复杂生命周期的定向寄生虫。通常，在产生孢子后24小时，卵母细胞(卵)在环境中经历孢子形成。卵母细胞含有四个孢母细胞，其含有两个孢子体。在摄入干草污染的水或饲料后，在摄入肠道内后，将成熟成完整的孢子体。通过胰蛋白酶、胆汁和CO2增强在肠道内的成熟过程。根据物种，孢子体进入肠道上皮或肠道隐窝上皮细胞，用于进一步的胞内成熟。在宿主细胞内，孢子体经历无性生殖(裂殖生殖)，形成裂殖子，其从细胞中脱离出来并感染其他肠道细胞。裂殖子进入细胞并分化成雄性(小配子母体)或雌性(大配子母体)生物体。大配子母体随着卵囊从受感染细胞中脱离出来，其可以在肠腔中受精并随后排出肠腔，其有效地重新开始艾美耳球虫的生活周期。潜伏期前阶段可以在感染后4至5天。最大卵囊产出在感染后6至9天。坏死性肠的作用只有部分是由原生动物寄生虫引起的。孢子体和裂殖子可以认为是接种针，使其他可能的致病和非致病细菌(鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)、白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)、大肠杆菌(Escherichia coli)等)渗透盲肠道的组织并进入血液和淋巴器官，引起败血症和器官的炎症。
尽管球虫是宿主特异性的以及不是所有球虫都引起胃肠疾病(腹泻、血便、降低的FCR、产蛋差)，但其仍然是高度传染性的生物体，影响保持在温热、狭窄和潮湿环境中的家畜。主要取决于免疫状态和宿主特异性，球虫可以影响家畜、家禽、猪、兔子、人类，甚至是鱼。家禽中的球虫病是主要的威胁，同时密集的猪生产中的球虫病也日益增加。在雏鸡、火鸡中，定期替换饲料球虫抑制剂防止了临床疾病。这些球虫抑制剂的强烈缺陷是对于动物和人类的毒性。球虫抑制剂引起性能损失(体重减轻、产蛋)和降低的饲料转化，最终导致经济损失。此外还可能存在对人类的健康危害，因此，需要严格贯彻关于剂量和停止给药期的严格控制方案。
第二个缺陷是使用抗球虫药时的抗药性，以及当多个物种侵入肠道时，生物体特异性也是个问题。这些药物可以分成两类：第一类是改变或影响寄生虫代谢的化学药品，如安普罗利、氯吡多等，第二类是改变通过细胞膜的离子转运或破坏渗透平衡的聚醚离子载体，如莫能菌素、盐霉素等。由于抗药性的问题，使用了往返和旋转程序。在肉鸡种鸡中，在7-10天大时，通过饮用水给予活的减毒疫苗。和化疗剂相同，疫苗的使用也有缺陷。统一的剂量可能用量不足或用药过量，在使用毒性类型时，这在后一种情况中可能引起疾病。此外，活的减毒疫苗的使用引起亚临床感染和环境中卵囊的排出。一些农场主在峰值激发时期使用杀球虫水处理。因为卵囊是耐久的(在不利的条件下，它们可以存活两年)并且比例如病毒在环境中坚持更长时间，因此完全的激发根除是不可能的。这不是必然的，因为引起中度症状需要log2-log3或更多卵囊。然而，降低激发剂量对于提高免疫力和降低疾病体征是有益的。
球虫感染引起群体免疫力，这在农业中是公知的。然而，每个球虫物种具有其自身的特异性和抗原特性。和许多其他原生动物病原体相同，艾美耳球虫能够很快地改变抗原和/或遗传特性，因此引起重要的遗传异质性。这些特性对于存活是固有特征。另一个问题是卵囊的耐久性。大部分给予了消毒剂，除非由于卵囊结构。卵囊壁由致密的10nm外层和90nm内层组成。前者构成总壁质量的25％并含有两极有机分子(脂肪酸、脂肪醇、磷脂)和胆固醇作为流体稳定剂。细胞外层的结构只允许小的不带电荷的分子通过。内层主要由高分子糖蛋白构成，形成完整的难以渗透的、高强度膜。保护性外层有效地防止了较大的和/或带电荷的分子的渗透，因此大部分液体消毒剂将是无效的。
最后，最好的球虫根除方法可能是内部控制，这主要是基于预防。卵囊是通过干草传播的。因此，良好的干草管理有助于降低球虫激发。因为球虫卵囊遍布于任何的农场环境中并具有如此大的繁殖力，因此难以保持动物是无球虫的。卵囊很快形成孢子，但是通过高水平的氨在3周内降低了它们的生活力。基本上，农场主除去结块的垃圾并使房屋中的空气排放3周，随后在引入新的畜群之前铺上新的无卵囊的干草。在畜群之间的彻底清理，更换房屋之间的织物和其他卫生设施进一步降低了球虫感染的可能性。
完全的激发根除可能是不可能的并且对于提高畜群免疫力是不利的。在引起临床呈现中，大剂量的艾美耳球虫卵囊是强制性的(100-1000)。此外，球虫卵囊是坚固的并且抵抗大部分的消毒剂。研究已经表明以下的化学物质是无效的，并因此不适用于根除：过醋酸、甲醛、氢氧化钾、硫酸、重铬酸钾、碘化钾、福尔马林、碘递体、甲酚、次氯酸钠、苯扎氯铵、戊二醛、酚物质、季铵化合物和硫酸铜。
US5,985,875描述了1，2，4-三嗪-3，5-二酮衍生物，及其生产，和用于灭活寄生的寄生原生动物如球虫的用途。
JP2004-210726描述了基于氯的化学物质(如二氧化氯)在柠檬酸钠磷酸缓冲液的存在下用于灭活球虫的用途。该文献描述了使用浓度为100至6,400ppm的二氧化氯，优选200至800ppm。
二氧化氯是高反应性和有毒的气体。毒性是由化合物的强氧化力和反应时化合物释放氯和氧的事实引起的。根据德国研究基金会，任何工作环境中的气态二氧化氯气体的最大浓度不高于0.1ppm。
因此，JP2004-210726中所述方法的缺陷在于必须使用高浓度的二氧化氯，以充分地灭活球虫亚纲寄生虫。本发明的发明人已经进行了实验来降低溶液中二氧化氯浓度的极限，而该溶液仍然能有效地灭活球虫亚纲寄生虫。发现了低于120ppm浓度的二氧化氯对于根除球虫生物体是无效的。
因此，本发明的技术目的是提供用于灭活球虫亚纲寄生虫的组合物，其含有较少的二氧化氯，并因此对动物和使用者的毒性较低。
通过用于灭活形成孢子的和未形成孢子的球虫亚纲寄生虫的水性组合物解决了本发明的技术目的，该组合物含有15至115ppm的二氧化氯和0.01至1wt.％的具有一个或多个C6-C18烷基和一个或多个芳基的阴离子表面活性剂。
本发明的发明人已经令人惊讶地发现，将含有二氧化氯的水溶液与具有一个或多个C6-C18烷基和一个或多个芳基的阴离子表面活性剂混合时，该溶液能够灭活形成孢子的和/或未形成孢子的球虫亚纲寄生虫，即使溶液中的二氧化氯浓度低于120ppm。
该结果是未预料到的，因为已知只有超过200ppm并优选大约800ppm的高浓度二氧化氯能完全灭活形成孢子的和/或未形成孢子的球虫亚纲寄生虫。本发明人的实验表明如果溶液中二氧化氯的浓度低于120ppm，单独的二氧化氯不能灭活。
此外，本发明人还研究了二氧化氯和其他表面活性剂例如烷基磺酸盐、氧化胺、乙氧基化多元醇、季铵化合物、月桂酰羟基硫酸酯的组合物是否具有结合较低浓度的二氧化氯的效果。然而，在这些情况中，发现了不能灭活形成孢子的和/或未形成孢子的球虫亚纲寄生虫。
在优选的实施方案中，根据本发明的含水组合物含有20至100ppm二氧化氯，更优选25至50ppm二氧化氯。
更优选的是含有0.05至0.5wt％，优选0.1至0.3wt％表面活性剂的组合物。
在进一步优选的实施方案中，阴离子表面活性剂是具有一个或多个C6-C18烷基和一个或多个苯基的磺酸盐型表面活性剂。这些磺酸盐的实例是例如烷基芳基磺酸盐、硫代琥珀酸酯和羟乙基磺酸盐。因为可以使用烷基芳基磺酸盐枯烯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、萘基磺酸盐和烷基苯磺酸盐，其可以由一个或多个C6-C18烷基来取代。
在最优选的实施方案中，阴离子表面活性剂是C6-C18烷基二苯醚二磺酸盐和/或烷基(磺基苯氧基)苯磺酸盐。
将根据本发明的组合物施用于球虫污染的表面1分钟至1小时，优选15分钟至45分钟。优选通过喷雾将组合物施用至受污染的表面上。
在进一步优选的实施方案中，可以以泡沫的形式来应用根据本发明的组合物，使得使用者能够看到施用组合物的表面。在另一个优选的实施方案中，出于相同的目的，将组合物着色，即目的也是识别施用了该溶液的表面。
此外，本发明还涉及制备根据本发明的水性组合物的方法。通过将包括碱金属亚氯酸盐的亚氯酸盐部分和作为第二部分的酸溶液混合并用水稀释混合物来进行这，酸溶液包括1至5wt.％，优选1.5至3wt.％弱羧酸，2至10wt.％，优选3至8wt.％，更优选4至7wt.％磷酸和10至25wt.％，优选13至20wt.％，最优选15至18wt.％具有一个或多个C6-C18烷基和一个或多个苯基的阴离子表面活性剂。
在优选的实施方案中，将阴离子表面活性剂分开加入到亚氯酸盐部分和酸溶液中。
包括碱金属亚氯酸盐，优选亚氯酸钠的亚氯酸盐部分可以是包括2至15wt.％碱金属亚氯酸盐，优选5至10wt.％碱金属亚氯酸盐的水溶液。
亚氯酸盐部分还可以是包括碱金属亚氯酸盐和填充剂的固体。填充剂优选碳酸钠。如果亚氯酸盐部分是固体部分，可以是片剂、颗粒或粉末的形式。
酸溶液包括弱羧酸，其选自醋酸、柠檬酸、乳酸、乙醇酸、酒石酸和丙酸及其混合物。
此外，酸溶液包括磷酸。弱羧酸和磷酸的组合是通过碱金属亚氯酸盐与酸反应而持续并缓慢释放二氧化氯所需要的。
此外，酸溶液可以包括具有一个或多个C6-C18烷基和一个或多个苯基的阴离子表面活性剂。该阴离子表面活性剂优选是磺酸盐型表面活性剂，更优选芳香族磺酸盐型表面活性剂，且最优选C6-C18烷基二苯醚二磺酸盐和/或C6-C18烷基(磺基苯氧基)苯磺酸盐。
此外，用水稀释通过混合亚氯酸盐部分和酸溶液部分制得的组合物，以制备用于灭活形成孢子的和/或未形成孢子的球虫亚纲寄生虫的水性使用溶液。以1∶10至1∶1000，优选1∶50至1∶500的比例进行该稀释。
还可以使用其他方法来制备根据本发明的水性组合物，如例如，其他二氧化氯释放化合物或二氧化氯释放电解，盒子中亚氯酸钠流动的电流将在含水环境中释放二氧化氯。
酸溶液和/或包括阴离子表面活性剂的溶液可以进一步含有添加剂，如增稠剂、增溶剂和缓冲剂。然而，重要的是谨慎选择这些添加剂，使得它们与亚氯酸盐部分和溶液的酸部分混合后，不与溶液的亚氯酸盐部分反应。
提供以下实施例来进一步说明本发明。
实施例
材料和方法
为了实验，使用了20g雄性Balb/C-小鼠。关于寄生虫，使用了乳头状艾美耳球虫(Eimeria papillata)，其是小鼠特异性的球虫，因此适于该实验的目的。制得含有124.5g NaCl和435.8g糖的浮选介质，将其用水稀释并补足至1升。制得新鲜的未形成孢子的卵囊。随后，用20,000个形成孢子的卵囊感染Balb/C-小鼠。从感染后第四天开始，收集新鲜的小鼠排泄物并通过浮选来分离。通过用干净的水洗涤三次来除去剩余的浮选介质。
将形成孢子的感染卵囊在25℃下培养一周。完成孢子形成后，可以将卵囊进一步用于感染或者也可以将它们在4℃下贮存于2％的重铬酸钾溶液中。
通过将含有亚氯酸钠的溶液和酸溶液混合来制备二氧化氯溶液。通过反应，产生了二氧化氯。该溶液含有120ppm二氧化氯。通过进一步稀释，产生了40、20、10、4、1和0.5ppm的二氧化氯溶液，将其立即用于实验。
实施例1：在含有二氧化氯的溶液中培养新鲜的未形成孢子的卵 囊
从新鲜小鼠排泄物中过滤出乳头状艾美耳球虫的卵囊并用新鲜产生的浓度为40、20、10、4、1、0.5ppm的二氧化氯溶液在室温下培养60分钟。60分钟培养时间后，用水洗涤卵囊悬浮液并在1ml水中培养，用于形成孢子。将探测器在25℃下培养一周。作为对照，使用了未处理的、未形成孢子的卵囊样品，将其也在25℃下培养一周。七天后，检查是否发生了孢子形成(参见表1)。
表1：
  编号   ClO2浓度   培养时间   结果
  1   无，对照   -   完全孢子形成
  2   40ppm   60分钟   部分孢子形成
  3   20ppm   60分钟   完全孢子形成
  4   10ppm   60分钟   完全孢子形成
  5   4ppm   60分钟   完全孢子形成
  6   1ppm   60分钟   完全孢子形成
  编号   ClO2浓度   培养时间   结果
  7   0.5ppm   60分钟   完全孢子形成
实验的结果表明在低于40ppm的浓度下，发生了完全或部分的孢子形成。这意味着在低于40ppm浓度和60分钟的培养时间下只用二氧化氯是不可能完全灭活球虫的。对照实施例显示了未处理的样品发生了完全的孢子形成。
以相同的方式使用根据本发明的水性组合物进行了实验，该组合物包括二氧化氯和作为阴离子表面活性剂的Dofax 2A1(DowChemicals)，其为二(十二烷基苯磺酸)氧二钠和苯磺酸的十二烷基(磺基苯氧基)二钠盐的混合物。该组合物含有0.5至25ppm二氧化氯和0.2wt％阴离子表面活性剂(参见表2)。
表2：
  编号   ClO2浓度   培养时间   结果
  1   无，对照   -   完全孢子形成
  2   25ppm   60分钟   无孢子形成
  3   20ppm   60分钟   无孢子形成
  4   10ppm   60分钟   部分孢子形成
  5   4ppm   60分钟   完全孢子形成
  6   1ppm   60分钟   完全孢子形成
  7   0.5ppm   60分钟   完全孢子形成
结果表明当使用60分钟的培养时间时，根据本发明的组合物(含有低浓度的二氧化氯和烷基二苯醚二磺酸盐型表面活性剂)在20ppm或更高浓度下能有效对抗球虫。在10ppm浓度下，观察到部分孢子形成，而在低于4ppm浓度下，观察到完全的孢子形成。
根据这些实验得出在高于15ppm二氧化氯浓度下，球虫未形成孢子的卵囊可以得到完全灭活。因此，超过15ppm的二氧化氯浓度能够完全灭活卵囊。
实施例2：形成孢子的卵囊的感染
进行了另一个系列的实验，以评价形成孢子的卵囊的灭活模式。为此，用含有二氧化氯的组合物将30,000个卵囊培养60分钟，其中二氧化氯的水平为4至40ppm。此后，用水将卵囊悬浮液洗涤三次并将20,000个卵囊口服给予小鼠。每个浓度使用一只小鼠。此外，各自用20,000个未处理的形成孢子的卵囊处理两只小鼠，用于对照的目的。从感染后第四天开始，每日采集小鼠的排泄物样品，并检测乳头状艾美耳球虫卵囊的存在(参见表3)。
表3：
Figure GPA00001011129400101
dpi＝感染后的天数
+++卵囊大量排泄
++许多卵囊排泄
+少量卵囊排泄
-无可检测卵囊
结果表明使用4至40ppm的二氧化氯浓度，用这些浓度的二氧化氯在60分钟的培养时间下处理卵囊后，在Balb/C-小鼠中不能避免乳头状艾美耳球虫卵囊的排泄。
还在120ppm和240ppm浓度下进行了试验。在这些测试中，发现了没有找到可检测的卵囊。在这些浓度下，球虫得到有效根除。
使用根据本发明的水性组合物进行了相同的实验。使用了具有4ppm至25ppm二氧化氯浓度和实施例1中所述阴离子表面活性剂浓度的组合物(参见表4)。
表4：
Figure GPA00001011129400111
dpi＝感染后的天数
+++卵囊大量排泄
++许多卵囊排泄
+少量卵囊排泄
-无可检测卵囊
表4中的结果表明使用本发明所述的二氧化氯浓度高于20ppm的组合物，该组合物完全灭活了球虫，因为在小鼠排泄物中没有产生或检测到卵囊。在低于15ppm浓度下，从感染后第四天开始，排泄了许多卵囊。因此，在这些浓度下，没有完全灭活。

Claims (15)

1.用于灭活形成孢子的和/或未形成孢子的球虫亚纲寄生虫的水性组合物，其含有15至115ppm二氧化氯和0.01至1wt％具有一个或多个C6至C18烷基和一个或多个芳基的阴离子表面活性剂。
2.根据权利要求1的水性组合物，其中所述组合物含有20至100ppm二氧化氯。
3.根据权利要求1或2的水性组合物，其中所述组合物含有0.05至0.5wt％表面活性剂。
4.根据权利要求1至3的水性组合物，其中所述阴离子表面活性剂是磺酸盐型表面活性剂。
5.根据权利要求1至4的水性组合物，其中所述阴离子表面活性剂是含有一个或多个苯基的芳香族磺酸盐型表面活性剂。
6.根据权利要求1至5的水性组合物，其中所述阴离子表面活性剂是C6至C18烷基二苯醚二磺酸盐和/或C6-C18烷基(磺基苯氧基)苯磺酸盐。
7.制备根据权利要求1至6的水性组合物的方法，通过混合
(a)含有碱金属亚氯酸盐的亚氯酸盐部分，和
(b)酸溶液，其含有
(b1)1至5wt％的弱羧酸和
(b2)2至10wt％的磷酸
(c)10至25wt％的根据权利要求1至6的阴离子表面活性剂，
和用水稀释该混合物。
8.根据权利要求7的方法，其中所述亚氯酸盐部分是含有2至15wt％碱金属亚氯酸盐的水溶液。
9.根据权利要求7或8的方法，其中所述亚氯酸盐部分是含有碱金属亚氯酸盐和填充剂的固体。
10.根据权利要求9的方法，其中所述填充剂是碳酸钠。
11.根据权利要求9或10的方法，其中所述亚氯酸盐部分是片剂、颗粒或粉末形式的固体部分。
12.根据权利要求7或11的方法，其中所述弱羧酸选自醋酸、柠檬酸、乳酸、乙醇酸、酒石酸和丙酸或其混合物。
13.根据权利要求7至12的方法，其中所述碱金属亚氯酸盐是亚氯酸钠。
14.通过根据权利要求7至13的方法可获得的用于灭活形成孢子的和/或未形成孢子的球虫亚纲寄生虫的水性组合物。
15.通过将根据权利要求1至6的组合物施用至球虫亚纲污染表面1分钟至1小时，优选15分钟至45分钟来灭活形成孢子的和/或未形成孢子的球虫亚纲的方法。
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