CN101791436B - 具有多孔磷酸钙-壳聚糖复合涂层的生物医用材料 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种兼具良好抑菌，止血和成骨活性的具有多孔磷酸钙-壳聚糖复合涂层的生物医用材料及其制备方法。本发明中，首先利用等离子喷涂制备多孔磷酸钙涂层，再通过浸泡法，滴加法等直接在多孔涂层表面复合水溶性壳聚糖表面层。这样既可起到很好的手术后早期抗菌，止血的功能，又可使植入体表面生物活性，成骨性能的潜在不利影响最小化。本发明工艺简单，生产成本低，可以赋予植入器械止血，抑菌两大额外功效，可大幅度提高现有植入器械的安全性和成功率，减轻病人痛苦。
Description
技术领域
本发明涉及一种兼具良好抑菌、止血和成骨活性的多孔磷酸钙-壳聚糖复合涂层的制备方法，属于生物医用材料制备技术领域。
背景技术
生物医用材料是用于对生物体进行修复或替换其病损组织、器官或增进其功能的新型高技术材料，一般指对牙和骨骼进行修复和替换的生物医用材料植入体。现有牙种植体、人工关节等承载部位用植入器械采用有良好力学性能的钛合金作为基体，然后对其进行表面改性，沉积磷酸钙涂层以提高其生物活性。随着步入老龄社会和人类对健康要求的提高，对硬组织修复与替换用生物活性涂层材料提出了更高要求。除了需要进一步提高涂层生物活性和成骨能力之外，还应赋予植入器械与临床使用密切相关的多种功能，是现阶段生物活性涂层重要研究方向。
其中植入器械表面的抑菌性能和止血功能是两个与临床应用密切相关的重要性能。骨科手术中，注射抗生素已成为预防感染的固定措施，尽管这样，手术感染仍是手术失败的一个重要因素。Capanna报导，在骨科植入器械中，因感染造成的手术失败率为5％左右，在翻修手术中为6％，而在对感染有关的翻修手术更高达47％。【R.Capanna，H.G.Morris，D.Campanacci，M.Del Ben，and M.Campanacci，“Modular Uncemented Prosthetic Reconstructionafter Resection of Tumours of the Distal Femur”，J.Bone Joint Surg.Br.，1994，76B，p 178-186.】。实际上，感染问题在近年来不仅没有得到解决，还有逐渐上升的趋势。细菌如同细胞一样，容易在植入体表面粘附，由于植入手术实施时非绝对无菌条件，植入器械需暴露于有菌环境中，因此更容易受到病菌侵袭，引发种植体周围炎症甚至直接导致手术失败。因此，表面具有抑菌功能的生物活性涂层将有效降低植入体周围的感染，提高手术的成功率和植入器械的安全性。涂层表面的止血功能是抑菌性能外的另一个与临床应用相关的重要性能。一个关节置换手术的病人总失血量可能远超过1000毫升，其中隐性失血量占据相当比例。对于植入人工关节、牙种植体等硬组织修复、替代材料，减少骨创面渗血将提高手术的安全性，对病人的早期康复有重要的促进作用，所以兼具抑菌与止血功能的生物活性涂层在临床使用上具有重要的意义。
壳聚糖是一类具有良好的抑菌功能的天然多糖高分子材料，壳聚糖还包括一系列的衍生物，同时经改性后可形成水溶性壳聚糖，具有易被人体吸收，抗肿瘤、调血脂和能提高人体免疫等功能。壳聚糖具有良好的生物安全性和抑菌功能，作为抑菌材料的使用受到了广泛重视【Liu X.F.，Guan Y.L.，Yang D.Z.，Li Z.，Yao KD.，“Antibacterial action of chitosan andcarboxymethylated chitosan”，J.Appl.Polym.Sci.2001，79(7)，1324-1335.】，壳聚糖还具有良好的止血功能【Mi FL，Shyu SS，Wu YB，Lee ST，Shyong JY，Huang RN，“Fabrication andcharacterization of a sponge-like asymmetric chitosan membrane as a wound dressing”，Biomaterials 2001；22：165-73.】。壳聚糖材料本身也具有良好的生物相容性，被广泛用于组织工程支架材料【Alberto Di Martinoa，Michael Sittingerc，Makarand V.Risbud，“Chitosan：Aversatile biopolymer for orthopaedic tissue-engineering”，Biomaterials 26(2005)5983-5990.】和药物控释系统【Khor E，Lim LY，“Implantable applications of chitin and chitosan”，Biomaterials2003；24：2339-49】。
现有研究多集中在壳聚糖和磷酸钙、其它高分子的复合材料。如壳聚糖与磷酸钙复合中，首先按照需要的钙磷比将一定量的钙源、磷源、钛源和钠源混合反应，形成所需要的磷酸钙玻璃相，然后再混入β-TCP粉末和溶解在一定量乙酸中的壳聚糖，经过一定温度下的搅拌来使混合物溶解和消除其中的气泡，混合物经过迅速冷冻，来使混合物固定和形成分离的固相，最后是固相的混合物在低温下保存一段时间再经过冷冻干燥移去溶剂。【Zhang Y，Zhang M，“Synthesis and characterization of macroporous chitosan/calcium phosphate composite scaffolds fortissue engineering”，J Biomed Mater Res 2001；55：304-12.】与高分子材料的复合方式主要是将羟基磷灰石粉末，壳聚糖粉末和PMMA粉末复合，形成骨水泥。【Kim SB，Kim YJ，Yoon TL，Park SA，Cho IH，Kim EJ，Kim IA，Shin JW，“The characteristics of ahydroxyapatite-chitosan-PMMA bone cement”，Biomaterials 2004；25：5715-23.】
壳聚糖虽是一种很好的具有抑菌、止血功能的材料。但其作为植入材料尚有不足之处。一个问题是现有壳聚糖复合材料，其制备过程往往较为繁复，而且力学性能较差，往往仅能用在非承载部位，对其降解速率也很难控制。难以同时满足植入器械对生物学性能、力学性能、和降解速率等性能的综合要求，离临床使用尚有一段距离。现有壳聚糖复合材料多通过体内降解的方式在预期植入部位释放、消失，其降解时间较长。而且壳聚糖作为抑菌材料在一定程度上具有细胞毒性，过长的降解时间不但难以控制，也将直接影响植入器械的成骨活性和骨长入能力，与致力于提高植入体的表面生物活性、与骨的早期愈合及界面结合的发展趋势相对立。实际上，在临床应用中，最严重的炎症反应和感染危险期多在手术后一到三天，而对止血的要求作用时间更短，多在手术后的几个小时，所以植入器械的手术部位的局部早期止血(手术后6小时内)、抑菌功能(手术后2～3天内)更为关键，并不需要降解时间过长的材料。所以具有早期抑菌、止血功能的医疗植入器械才是满足临床实际需要的发展方向。
解决这些问题的一个思路是在其涂层表面直接复合水溶性壳聚糖表面层，这样既可起到很好的手术后早期抗菌、止血的功能，又由于壳聚糖将在相对较短时间内通过涂层表面的释放、溶解，被体液吸收的过程到体内其它部位，对植入体表面生物活性、成骨性能的潜在不利影响最小化，另外由于使用生物医用材料作为基底，即在植入器械表面直接复合多孔磷酸钙-壳聚糖生物活性涂层，这样作为植入材料具有很好的力学性能，可以应用在承载部位。同时满足植入器械对生物学性能、力学性能、和降解速率等性能的综合要求，具有很大的临床运用前景。此方法的关键是如何有效地将壳聚糖复合在生物活性涂层表面。现有植入生物工程器械材料表面的生物活性涂层多为致密结构，不能有效地将壳聚糖复合在生物活性涂层表面。
发明内容
本发明要解决的技术问题是现有的生物医用材料表面难以有效复合壳聚糖的。
本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种新的生物医用材料。该生物医用材料包括有基底材料，在基底材料的外表面上复合有多孔磷酸钙涂层，多孔磷酸钙涂层上还复合有壳聚糖层。
其中，上述多孔磷酸钙涂层为磷酸钙材料通过液相等离子喷涂法复合在基底材料上形成的。
其中，上述磷酸钙材料为羟基磷灰石或磷酸三钙。
进一步的，上述壳聚糖内还含有消炎药物、止血药物或抑菌药物中的至少一种。
其中，上述的基底材料为生物医用金属材料、生物医用陶瓷材料、含金属的生物医用复合材料或含陶瓷的生物医用复合材料中的至少一种。
其中，上述生物医用金属材料为生物医用钛合金材料、生物医用不锈钢材料、生物医用钴基合金材料中的至少一种。进一步的，所述生物医用陶瓷材料为氧化铝陶瓷或氧化锆陶瓷。
本发明还提供了一种制备上述生物医用材料的方法。该方法包括以下步骤：
a、配制磷酸钙悬浮液；
b、将步骤a得到的磷酸钙悬浮液注入到等离子火焰中心的高温区域，喷涂至基底材料的表面，生成具有多孔的磷酸钙涂层的生物医用材料；
c、将步骤b得到的具有的多孔磷酸钙涂层的生物医用材料浸入10g/L～100g/L壳聚糖水溶液中18～36小时或将壳聚糖溶液滴加在多孔磷酸钙涂层表面；然后将材料在无菌条件下风干，即得。
其中，上述方法步骤a所述的磷酸钙悬浮液的制备方法为：
边搅拌边将摩尔浓度为1.2～3.6mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为1～3mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液30℃～90℃，以氨水控制其pH保持在9～12，反应后静置5～15分钟，再陈化24～48小时。
其中，上述方法中步骤b所述的将磷酸钙悬浮液注入到等离子火焰中心的高温区域是采用雾化喷嘴进行；等离子喷涂功率为20～70千瓦，喷涂距离为80～180mm。
本发明还提供了使用上述的方法制备的生物医用材料。
常规生物活性涂层多为致密结构，不能有效地将壳聚糖复合在生物活性涂层表面。为解决这一难题，本发明采用液相等离子体喷涂技术制备具有多孔结构的涂层，其优点为涂层孔隙结构在较大范围可调(从接近完全致密～50％孔隙度)，可根据实际临床需要对壳聚糖的释放速率进行调控。
本发明产品可使用以下路线进行制备：
a、制备具有多孔结构的磷酸钙涂层的生物医用材料；
b、在具有多孔结构的磷酸钙涂层的生物医用材料上构建多孔磷酸钙-壳聚糖复合涂层。
其中a中所述的磷酸钙涂层为以羟基磷灰石为主的各种磷酸钙涂层，主要包括羟基磷灰石、磷酸三钙等。
其中上述步骤a中多孔磷酸钙涂层的制备采用液相等离子喷涂，利用现有的技术制备磷酸钙液相先驱液，比如通过磷酸氢二铵水溶液滴加到硝酸钙水溶液中，加入氨水控制pH值为9～12行进反应，静置，陈化得到。利用磷酸钙先驱液作为喷涂原料，通过雾化喷嘴将液体先驱液原料直接注入等离子火焰高温区域，在极短时间(小于1微秒)完成与火焰的热交换过程，随后经过原料中液滴的破碎、细化、蒸发、烧结、熔融，最后直接喷射在生物医用基底上形成涂层。
其中上述作为多孔磷酸钙涂层基底的材料需要能耐受等离子喷涂的高温。如，生物医用金属材料和生物医用陶瓷材料。作为基底的生物医用金属材料包括生物医用钛，或生物医用不锈钢，或生物医用钴基合金，或其他生物医用金属材料，或含金属的生物医用复合材料。作为基底的生物医用陶瓷材料包括氧化铝陶瓷，或氧化锆陶瓷，或其他生物医用陶瓷材料，或含陶瓷的生物医用复合材料。
其中上述b中采用的壳聚糖可以是本领域常用的材料，但必须溶于水，可以是不同分子量，脱乙酰度，ph值的壳聚糖。
其中上述b中是通过调节壳聚糖的浓度，ph值等方面来得到优化设计的水溶性壳聚糖材料参数，在兼具良好成骨活性的同时最大限度提高涂层的抑菌性能。
其中上述b中多孔磷酸钙-壳聚糖涂层的构建采用在涂层表面直接复合水溶性壳聚糖表面层的方法，包括浸泡法，滴加法等方法。
本发明制备方法的步骤具体可为以下几步进行：
A多孔磷酸钙涂层的制备
按羟基磷灰石、磷酸三钙等的钙磷摩尔比，在不断搅拌下将摩尔浓度为1.2-3.6mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为1-3mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液30～90℃，以质量百分比浓度10％-30％的氨水控制其pH保持在9～12，反应后静置5～15分钟，再陈化24～48小时。通过小角度雾化喷嘴将磷酸钙先驱液进行雾化，小角度雾化喷嘴的雾滴发散角度为10～25度，直接将先驱液注入等离子火焰中心的高温区域，喷涂液与等离子喷枪喷射的高温等离子火焰发生热交换，随后经过液滴的破碎和细化，溶剂的蒸发，造孔剂的分解和气化，喷涂原料的熔融，直接在作为基底的生物医用材料表面沉积生成多孔磷酸钙涂层。其中等离子喷涂功率为20～70千瓦，所述作为基底的生物医用材料与等离子喷嘴距离为8～18厘米。其中作为基底的生物医用金属材料包括生物医用钛，或生物医用不锈钢，或生物医用钴基合金，或其他生物医用金属材料，或含金属的生物医用复合材料。作为基底的生物医用陶瓷材料包括氧化铝陶瓷，或氧化锆陶瓷，或其他生物医用陶瓷材料，或含陶瓷的生物医用复合材料。涂层空隙结构在较大范围可调(从接近完全致密～50％孔隙度)。
B优化设计的水溶性壳聚糖材料的配制
壳聚糖不同分子量，脱乙酰度，浓度，ph值等因素对涂层抑菌性能都有一定的影响。通过调节壳聚糖的浓度，ph值，浓度范围10g/L～100g/L，ph值5～8，进行优化设计，最大限度提高涂层抑菌性能。在浓度范围10g/L～100g/L内，当壳聚糖浓度增大到20g/L时，涂层显示出明显的抑菌效果，并随溶度的增大，抑菌效果越好。总之，可根据具体临床应用需要，对壳聚糖材料的抑菌性能和细胞毒性进行优化设计。
为进一步提高材料的抑菌性能，可在壳聚糖中装载抗生素等药物。通过药物在创部局部释放，可更有效的提高复合涂层的抑菌性能，对防止病人术后感染、提高手术成功率有重要作用。
C多孔磷酸钙-壳聚糖涂层的构建
壳聚糖是一种具有良好抑菌功能的天然多糖高分子材料，常规状态下不溶于水，经过改性使其成为水溶性壳聚糖。采用浸泡法，滴加法等在多孔结构磷酸钙涂层表面涂覆水溶性壳聚糖。
将水溶性壳聚糖溶解于超纯水，配置成10g/L～100g/L不同浓度的壳聚糖溶液。再将涂层在无菌条件下浸没于壳聚糖水溶液中18-36小时，或将壳聚糖溶液滴加在涂层表面，之后在超净台内风干8～16小时。
表面多孔结构的纳米涂层比现今临床用商业化产品有更好的成骨细胞增殖，分化能力，并可装载骨生长因子以进一步促进骨生长，增强材料的组织修复能力。本发明创造性地在这种多孔涂层上面直接复合水溶性壳聚糖表面层，则可赋予植入器械早期止血，抑菌两种功效，可大幅度提高现有植入器械的安全性和成功率，更高效地为病人服务。壳聚糖在手术后早期相对黏稠，有助于手术后最早期的止血，随后其将较快释放、溶解最后被体液吸收，即能起到一定程度的早期抑菌作用，也不会影响随后的成骨进程。
本发明的针对手术后对植入器械早期抑菌及止血功能的临床实际需要，利用具有多孔结构的磷酸钙涂层有效直接复合壳聚糖涂层。这样既可赋予植入材料止血、抑菌两大额外功效，可大幅度提高现有植入器械的安全性和成功率，更高效地为病人服务。又由于壳聚糖的释放、溶解，被体液吸收相对较快，对植入体表面生物活性、成骨性能的潜在不利影响最小化。从而构建满足临床需要，具有良好的早期抑菌(2～3天内)，止血(6小时内)功能的多孔磷酸钙-壳聚糖涂层生物医用材料。
本发明与现有技术相比具有以下有益技术效果：
1、现有研究多集中在壳聚糖和磷酸钙或其他高分子的复合材料，而这些复合材料的强度较低，往往仅能用在非承载部位，其制备过程往往较为繁复，对其降解速率也很难控制。本发现制备过程通过在医用植入器械的生物活性涂层表面直接复合水溶性壳聚糖，方法简单，可直接用于承载植入部位。
2、常规生物活性涂层多为致密结构，不能有效地将壳聚糖装载在生物活性涂层表面。针对手术后早期抑菌及止血功能的临床实际需要，利用液相等离子喷涂新技术制备多孔生物活性涂层，并复合水溶性壳聚糖，赋予植入体在术后早期的抑菌及止血功能。而且涂层孔隙率结构在较大范围可调(从接近完全致密到～50％孔隙度)，可对壳聚糖的释放速率进行调控。
3、现有壳聚糖复合材料主要通过体内降解的方式在预期植入部位消失，其降解时间较长，也很难控制。由于壳聚糖作为一种抑菌材料在一定程度上具有细胞毒性，过长的降解时间，不但难以控制，也将直接影响植入器械表面的成骨活性和骨长入能力。本发明方法针对临床实际需要，将壳聚糖直接复合到涂层上，既能起到很好的手术后早期抗菌，止血功能，有助于提高植入手术的安全性和加快病人康复，同时复合在多孔磷酸钙涂层上的壳聚糖相对释放、溶解和被体液吸收较快，做到了对植入体表面生物活性、成骨性能的潜在不利影响最小化。
4、壳聚糖材料本身也具有良好的生物相容性，采用兼具良好成骨活性和抑菌性能的壳聚糖材料参数，有助于同时优化材料的成骨活性和抑菌性能。在壳聚糖里还可以装载抗生素、消炎药物、止血药物等药物，起到创部局部释放，可更有效的提高复合涂层的抑菌性能，对防止病人术后感染、提高手术成功率有重要作用。
附图说明
图1、多孔磷酸钙-壳聚糖复合涂层示意图，1为生物医学工程基底材料，2为液相等离子喷涂的多孔磷酸钙涂层，3为水溶性壳聚糖层。
图2、粉末等离子喷涂羟基磷灰石涂层(现临床用商业化产品)扫描电镜照片。
图3、液相等离子喷涂制备的具有多孔结构羟基磷灰石涂层扫描电镜照片。
图4、多孔磷酸钙--壳聚糖复合涂层(LPPS)与致密磷酸钙-壳聚糖复合涂层(APS)的早期(6h，12h，24h)抑菌性能比较：利用MTT法对金黄色葡萄球菌的增殖情况检测结果表明具有多孔结构的磷酸钙-壳聚糖复合涂层具有远为优异的抑菌性能。
图5、具有不同壳聚糖浓度的多孔磷酸钙-壳聚糖复合涂层的抑菌性能比较：利用MTT法在6h，12h，24h测得金黄色葡萄球菌的增殖速率(OD值)。
图6、MTT法对MG63细胞在具有不同浓度壳聚糖的多孔磷酸钙-壳聚糖复合涂层表面的增殖情况(2d，4d，6d)的检测。
图7、不同浓度壳聚糖的多孔磷酸钙--壳聚糖复合涂层在PBS中的释放行为。
具体实施方式
本发明的具体实施方案
本发明提供一种磷酸钙多孔涂层表面直接复合水溶性壳聚糖表面层的制备方法，该方法是以等离子喷涂为基础，制备出多孔磷酸钙涂层，直接在多孔涂层表面上复合水溶性壳聚糖表面层。
具体操作步骤为：
A多孔磷酸钙涂层的制备
按羟基磷灰石、磷酸三钙等的钙磷摩尔比，在不断搅拌下将摩尔浓度为1.2-3.6mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为1～3mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液30-90℃，以质量百分比浓度10％～30％的氨水控制其pH保持在9-12，反应后静置5-15分钟，再陈化24-48小时，为了获得多孔结构，可以通过加入造孔剂，如去离子水，碳酸氢铵。通过小角度雾化喷嘴将羟基磷灰石先驱液进行雾化，小角度雾化喷嘴的雾滴发散角度为10-25度，直接将先驱液雾化注入等离子火焰中心的高温区域，喷涂液与等离子喷枪喷射的高温等离子火焰发生热交换，随后经过液滴的破碎和细化，溶剂的蒸发，造孔剂的分解和气化，喷涂原料的熔融，直接在作为基底的生物医用材料表面沉积生成多孔磷酸钙涂层。所述的等离子喷涂功率为20～70千瓦，所述作为基底的生物医用材料与等离子喷嘴距离为8～18厘米。其中作为基底的生物医用金属材料包括生物医用钛，或生物医用不锈钢，或生物医用钴基合金，或其他生物医用金属材料，或含金属的生物医用复合材料。作为基底的生物医用陶瓷材料包括氧化铝陶瓷，或氧化锆陶瓷，或其他生物医用陶瓷材料，或含陶瓷的生物医用复合材料。涂层空隙结构在较大范围可调(从接近完全致密到～50％孔隙度)。
B水溶性壳聚糖材料的设计
壳聚糖不同分子量，脱乙酰度，浓度，ph值等因素对涂层抑菌性能都有一定的影响。通过调节壳聚糖的浓度，ph值进行优化设计。一般浓度范围10g/L～100g/L，ph值5～8，最大限度提高涂层抑菌性能。在浓度范围10g/L～100g/L内，当壳聚糖浓度增大到20g/L时，涂层显示出明显的抑菌效果，并随溶度的增大，抑菌效果越好。
C多孔磷酸钙-壳聚糖涂层的构建
在涂层表面直接复合水溶性壳聚糖表面层，采用浸泡法，滴加法在多孔结构羟基磷灰石涂层表面涂覆壳聚糖。将水溶性壳聚糖溶解于超纯水，配置成10g/L-100g/L不同浓度的壳聚糖溶液。再将涂层在无菌条件下浸没于壳聚糖水溶液中18-36小时，之后在超净台内风干8-16小时。形成多孔磷酸钙-壳聚糖复合涂层。
以下通过具体实施例的方式对本发明做进一步详述，但不应理解为是对本发明的限制。凡基于本发明上述思想做出的修改，替换，变更均属于本发明。
实施例一粉末等离子喷涂的羟基磷灰石涂层上复合壳聚糖涂层
直接利用羟基磷灰石粉末。通过等离子喷涂设备，喷涂采用粉末喷嘴，使用大气等离子喷涂设备，最后在生物医用金属基底上形成涂层，喷涂厚度为120微米。涂层表面形貌采用扫描电镜进行观察。扫描电镜照片见图二。将壳聚糖溶解于超纯水，浓度为100g/L，在将涂层样品在无菌的条件下浸泡于壳聚糖水溶液中24小时，之后在超净台内风干12小时。其复合涂层(壳聚糖浓度100g/L)早期抑菌性能与多孔磷酸钙-壳聚糖复合涂层(壳聚糖浓度100g/L)比较(MTT法对金黄色葡萄球菌的增殖情况检测)见图4。利用MTT法对金黄色葡萄球菌的增殖情况检测结果表明具有多孔结构的磷酸钙-壳聚糖复合涂层具有远为优异的抑菌性能。
实施例二在液相等离子喷涂的羟基磷灰石涂层上复合壳聚糖涂层
按Ca10(PO4)6(OH)2的钙磷摩尔比(1.67)，在不断搅拌下将摩尔浓度为2.8mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为2.4mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液70℃，以质量百分比浓度25％的氨水控制其pH保持在10.5，反应后静置10分钟，再陈化24小时，即得固含量为34％的羟基磷灰石悬浮液备用。利用等离子喷涂设备，喷嘴采用雾化喷嘴，使用液相等离子喷涂方法，经过先驱液中液滴的破碎、细化、蒸发、烧结、熔融，最后在生物医用金属基底上形成涂层，喷涂厚度为120微米。涂层表面形貌采用扫描电镜进行观察。扫描电镜照片见图三。将壳聚糖溶解于超纯水，浓度依次为10g/L、20g/L、50g/L、100g/L，再将四组涂层样品在无菌的条件下分别浸泡于这四种浓度不同的壳聚糖水溶液中25小时，之后在超净台内风干12小时。其复合涂层(壳聚糖浓度100g/L)与致密磷酸钙-壳聚糖复合涂层(壳聚糖浓度100g/L)早期抑菌性能比较见图四，其四种壳聚糖浓度不同的复合涂层早期抑菌性能(MMT法对金黄色葡萄球菌的增殖速率检测)见图五，MG63细胞在此四种复合涂层表面的增殖情况见图六，四种复合涂层在PBS溶液中的释放情况见图七。
实施例三在液相等离子喷涂的羟基磷灰石涂层上复合壳聚糖涂层
按Ca10(PO4)6(OH)2的钙磷摩尔比(1.67)，在不断搅拌下将摩尔浓度为2.5mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为2.1mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液65℃，以质量百分比浓度20％的氨水控制其pH保持在11，反应后静置7分钟，再陈化30小时，即得固含量为31％的羟基磷灰石悬浮液备用。将去离子水添加到羟基磷灰石悬浮液中，将其稀释成固含量为15％的羟基磷灰石悬浮液。利用等离子喷涂设备，喷嘴采用雾化喷嘴，使用液相等离子喷涂方法，经过先驱液中液滴的破碎、细化、蒸发、烧结、熔融，最后在生物医用金属基底上形成涂层，喷涂厚度为150微米。将壳聚糖溶解于超纯水，浓度为15g/L，在将涂层样品在无菌的条件下浸泡于壳聚糖水溶液中18小时，之后在超净台内风干10小时。
实施例四在液相等离子喷涂的羟基磷灰石涂层上复合壳聚糖涂层
按Ca10(PO4)6(OH)2的钙磷摩尔比(1.67)，在不断搅拌下将摩尔浓度为1.7mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为1.4mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液65℃，以质量百分比浓度23％的氨水控制其pH保持在11.5，反应后静置12分钟，再陈化35小时，即得固含量为21％的羟基磷灰石悬浮液备用。将造孔剂碳酸氢铵加入到羟基磷灰石悬浮液中，添加量以悬浮液的固含量为100％计，碳酸氢铵为30％。利用等离子喷涂设备，喷嘴采用雾化喷嘴，使用液相等离子喷涂方法，经过先驱液中液滴的破碎、细化、蒸发、烧结、熔融，最后在生物医用金属基底上形成涂层，喷涂厚度为130微米。将壳聚糖溶解于超纯水，浓度为25g/L，在将涂层样品在无菌的条件下浸泡于壳聚糖水溶液中20小时，之后在超净台内风干15小时。实施例五在液相等离子喷涂的羟基磷灰石涂层上复合壳聚糖涂层
按Ca10(PO4)6(OH)2的钙磷摩尔比(1.67)，在不断搅拌下将摩尔浓度为1.6mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为1.3mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液50℃，以质量百分比浓度22％的氨水控制其pH保持在9，反应后静置5分钟，再陈化45小时，即得固含量为20％的羟基磷灰石悬浮液备用。利用等离子喷涂设备，喷嘴采用雾化喷嘴，使用液相等离子喷涂方法，经过先驱液中液滴的破碎、细化、蒸发、烧结、熔融，最后在生物医用金属基底上形成涂层，喷涂厚度为150微米。将壳聚糖溶解于超纯水，浓度为30g/L，在将涂层样品在无菌的条件下浸泡于壳聚糖水溶液中32小时，之后在超净台内风干16小时。
实施例六在液相等离子喷涂的磷酸三钙涂层上复合壳聚糖涂层
按Ca3(PO4)2的钙磷摩尔比(1.5)，在不断搅拌下将摩尔浓度为3.0mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为3.0mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液55℃，以质量百分比浓度35％的氨水控制其pH保持在9.5，反应后静置5分钟，再陈化25小时，即得固含量为25％的磷酸三钙悬浮液备用。利用等离子喷涂设备，喷嘴采用雾化喷嘴，使用液相等离子喷涂方法，经过先驱液中液滴的破碎、细化、蒸发、烧结、熔融，最后在生物医用金属基底上形成涂层，喷涂厚度为110微米。将壳聚糖溶解于超纯水，浓度为60g/L，在将涂层样品在无菌的条件下浸泡于壳聚糖水溶液中35小时，之后在超净台内风干15小时。
实施例七在液相等离子喷涂的磷酸三钙涂层上复合壳聚糖涂层
按Ca3(PO4)2的钙磷摩尔比(1.5)，在不断搅拌下将摩尔浓度为2.4mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为2.4mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液60℃，以质量百分比浓度33％的氨水控制其pH保持在10，反应后静置10分钟，再陈化48小时，即得固含量为30％的磷酸三钙悬浮液备用。利用等离子喷涂设备，喷嘴采用雾化喷嘴，使用液相等离子喷涂方法，经过先驱液中液滴的破碎、细化、蒸发、烧结、熔融，最后在生物医用金属基底上形成涂层，喷涂厚度为160微米。将壳聚糖溶解于超纯水，浓度为70g/L，在将涂层样品在无菌的条件下浸泡于壳聚糖水溶液中30小时，之后在超净台内风干10小时。
实施例八在液相等离子喷涂的磷酸三钙涂层上复合壳聚糖涂层
按Ca3(PO4)2的钙磷摩尔比(1.5)，在不断搅拌下将摩尔浓度为2mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为1.7mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液75℃，以质量百分比浓度20％的氨水控制其pH保持在10.5，反应后静置15分钟，再陈化40小时，即得固含量为25％的磷酸三钙悬浮液备用。利用等离子喷涂设备，喷嘴采用雾化喷嘴，使用液相等离子喷涂方法，经过先驱液中液滴的破碎、细化、蒸发、烧结、熔融，最后在生物医用金属基底上形成涂层，喷涂厚度为150微米。将壳聚糖溶解于超纯水，浓度为80g/L，在将涂层样品在无菌的条件下浸泡于壳聚糖水溶液中28小时，之后在超净台内风干11小时。
试验例一本发明生物医用材料的抑菌对比实验
本研究中使用了金黄色葡萄球菌(ATCC25923)来测试材料的抑菌性能。冻存的菌株经快速解冻并在37℃恒温摇床内震荡增菌16小时，用增菌液进行平板涂布，经过24-38小时培养后，挑选出生长良好的菌落进行二次增菌，在LB(Luria broth)中培养，培养16-18小时并将菌液浓度调至1-2*106CFUs/mL。将浓度为100g/L的壳聚糖分别与致密羟基磷灰石涂层和多孔羟基磷灰石涂层复合。之后将材料依次放入24孔板，接种金黄色葡萄球菌，分别培养6h，12h，和24h。使用MTT法测得材料对细菌的抑制情况。抑菌结果见图4。利用MTT法对金黄色葡萄球菌的增殖情况检测结果表明具有多孔结构的磷酸钙-壳聚糖复合涂层具有远为优异的抑菌性能。
试验例二由不同浓度壳聚糖制备的本发明生物医用材料的抑菌试验
本研究中使用了金黄色葡萄球菌(ATCC25923)来测试材料的抑菌性能。冻存的菌株经快速解冻并在37℃恒温摇床内震荡增菌16小时，用菌液进行平板涂布，经过24-28小时培养后，挑选出生长良好的菌落进行二次增菌，在LB(Luria broth)中培养，培养16-18小时并将菌液浓度调至1-2*106CFUs/mL。将浓度分别为10g/L，20g/L，50g/L，100g/L壳聚糖与羟基磷灰石的复合材料依次放入24孔板，接种金黄色葡萄球菌，分别培养6h，12h和24h。使用MTT法测得材料对细菌的抑制情况。抑菌结果见图5。
图5显示了使用MTT法测得抑菌实验的OD值，在6h时未见到显著区别，在12h时，多孔空白对照样品细菌大量繁殖，而其余装载了壳聚糖的则显示出明显的抑菌效果。在24h，不同种类的材料抑菌性能显示出巨大的差异，多孔以及装载10g/l壳聚糖在24小时几乎没有抑菌的效果，当壳聚糖含量增大到20g/l时，涂层显示出明显的抑菌效果，并且20g/l，50g/l，100g/l壳聚糖的抑菌效果随着装载量的加大而增加。
试验例三本发明生物医用材料的细胞毒性试验
复苏冻存的MG63细胞，取第二代生长旺盛的细胞制得浓度为1*104的细胞悬液，按1ml/孔的量接种于材料(壳聚糖浓度分别为10g/L，20g/L，50g/L，100g/L)表面，最后将培养板放入CO2恒温培养箱中，分别培养2天，4天和6天。最后用酶联免疫检测仪在570nm处测得各样品的OD值。结果见图6。
如图所示装载10g/l和20g/l壳聚糖的材料细胞增殖数量显著高于装载50g/l和100g/l壳聚糖的材料。相比空白的多孔HA涂层，50g/l和100g/l壳聚糖的两组显示出一定的细胞毒性，而10g/l和20g/l壳聚糖不仅没有细胞毒性，反而更是促进了细胞在材料表面的增殖。
试验例四本发明生物医用材料的体外释放试验
将制备好的多孔磷酸钙-壳聚糖生物活性涂层置入离心管中并加入16ml的PBS溶液。将离心管放入恒温摇床，摇速和温度分布保持在50rpm和37℃。每个时间点取出离心管内的溶液来计算壳聚糖从涂层中释放的总量。释放值使用紫外分光光度计进行测量。结果见图7。
在初期，壳聚糖从涂层中释放到PBS中的量出现快速增加的趋势，并且各种浓度壳聚糖在初期的释放量并没有见到显著区别。经过大约24小时，壳聚糖释放速率开始放缓，且各组分间释放量出现了明显的区别，在24小时，装载10g/L，20g/L，50g/L和100g/L壳聚糖的释放量分别为586mg/ml，682mg/ml，707mg/ml和732mg/ml。
Claims (7)
1.生物医用材料，其特征在于：所述生物医用材料包括有基底材料，在基底材料的外表面上复合有多孔磷酸钙涂层，多孔磷酸钙涂层上还复合有壳聚糖层；
所述生物医用材料是使用以下步骤制得的：
a、配制磷酸钙悬浮液；
b、将步骤a得到的磷酸钙悬浮液注入到等离子火焰中心的高温区域，喷涂至基底材料的表面，生成具有多孔的羟基磷灰石涂层的生物医用材料；
c、将步骤b得到的具有的多孔羟基磷灰石涂层的生物医用材料浸入10g/L～20g/L壳聚糖水溶液中18～36小时或将壳聚糖水溶液滴加在多孔羟基磷灰石涂层表面；然后将材料在无菌条件下风干，即得；
所述基底材料为生物医用金属材料、生物医用陶瓷材料、含金属的生物医用复合材料或含陶瓷的生物医用复合材料中的至少一种；
所述生物医用金属材料为生物医用钛合金材料、生物医用不锈钢材料、生物医用钴基合金材料中的至少一种；所述生物医用陶瓷材料为氧化铝陶瓷或氧化锆陶瓷。
2.根据权利要求1所述的生物医用材料，其特征在于：所述多孔磷酸钙涂层为磷酸钙材料通过液相等离子喷涂法复合在基底材料上形成的。
3.根据权利要求1所述的生物医用材料，其特征在于：所述磷酸钙材料为羟基磷灰石或磷酸三钙。
4.根据权利要求1所述的生物医用材料，其特征在于：所述壳聚糖内还含有消炎药物、止血药物或抑菌药物中的至少一种。
5.制备权利要求1～4任一项所述的生物医用材料的方法，其特征在于包括以下步骤：
a、配制磷酸钙悬浮液；
b、将步骤a得到的磷酸钙悬浮液注入到等离子火焰中心的高温区域，喷涂至基底材料的表面，生成具有多孔的羟基磷灰石涂层的生物医用材料；
c、将步骤b得到的具有的多孔羟基磷灰石涂层的生物医用材料浸入10g/L～20g/L壳聚糖水溶液中18～36小时或将壳聚糖溶液滴加在多孔羟基磷灰石涂层表面；然后将材料在无菌条件下风干，即得。
6.根据权利要求5所述的制备生物医用材料的方法，其特征在于制备步骤a所述的磷酸钙悬浮液的方法为：
边搅拌边将摩尔浓度为1.2～3.6mol/L的磷酸氢二铵水溶液滴加到摩尔浓度为1～3mol/L的硝酸钙水溶液中，保持反应液30℃～90℃，以氨水控制其pH保持在9～12，反应后静置5～15分钟，再陈化24～48小时。
7.根据权利要求5所述的制备生物医用材料的方法，其特征在于步骤b所述的中将磷酸钙悬浮液注入到等离子火焰中心的高温区域是采用雾化喷嘴进行；等离子喷涂功率为20～70千瓦，喷涂距离为80～180mm。
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