CN110237308A - 一种用于修复肿瘤性骨缺损的人工骨及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于修复肿瘤性骨缺损的人工骨，它由聚乳酸粉末（PLA）、羟基磷灰石粉末（HA）、二甲双胍粉末（MET）按质量比（8—10）:1:（3—5）组成。本发明用二甲双胍作为主要增效组分，达到既抑制肿瘤细胞，又增强骨修复能力的目的，解决目前肿瘤性骨缺损局部易复发的缺陷，尤其是良性或交界性肿瘤，如骨巨细胞瘤；同时优良的骨修复性能又解决肿瘤切除后巨大骨缺损自我修复困难的挑战。
Description
技术领域
本发明属于生物医药材料领域，涉及一种用于修复肿瘤性骨缺损的人工骨及其制备方法。
背景技术
肿瘤性骨缺损是良、恶性骨肿瘤等疾病手术所致的巨大骨缺损，面临着修复困难及肿瘤复发的巨大挑战。目前常用骨修复材料有自体骨、同种异体骨及人工骨。其中自体骨来源有限，且造成取骨部位二次创伤，同种异体骨有感染疾病风险，因此人工骨是一个重要选择。羟基磷灰石（HA）抗压强度良好、骨传导性能优异，是人体骨骼主要成分，聚乳酸（PLA）的生物相容性和降解性能优良，二甲双胍既具有促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，又同时具有抑制肿瘤细胞的双重功效，三者结合制备复合人工骨实现优势互补，可用于临床肿瘤性骨缺损的修复或替换。
目前，不管自体骨、同种异体骨，还是常规人工骨均不具备抑制肿瘤作用。常用抗肿瘤化疗药物及局部放疗毒副作用巨大，同时临床上肿瘤化疗药物耐药性问题愈发突出，且临床常用人工骨很难做到兼具骨修复与抗肿瘤的双重功效。开发抗肿瘤人工骨修复肿瘤性骨缺损，可以有效减少化疗药物剂量，且减轻化疗药物耐药性。目前仅少数载细胞毒性化疗药物的人工骨的研究报道。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种用于抗肿瘤作用的人工骨；另一个目的在于提供上述具有抗肿瘤作用人工骨的制备方法。所述骨修复材料具有强度高、力学性质接近人骨，具有良好骨诱导性、骨传导性、生物相容性、抗肿瘤作用以及稳定的药物释放能力。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述用于修复肿瘤性骨缺损的人工骨由聚乳酸粉末（PLA）、羟基磷灰石粉末（HA）、二甲双胍粉末（MET）按质量比（8—10）:1:（3—5），优选为9:1:4组成。
优选地，所述聚乳酸粉末粒径为20—80μm，黏度为1.5—3.0dL/g，熔点为170—185℃；所述羟基磷灰石粉末粒径＜200nm；所述二甲双胍为生物医药级。
优选地，所述聚乳酸粉末为左旋聚乳酸粉末（PLLA），所述羟基磷灰石粉末为纳米复合羟基磷灰石粉末（nHA）。
上述用于修复肿瘤性骨缺损的人工骨的制备方法包括如下步骤：
（1）混合：将聚乳酸粉末、羟基磷灰石粉末、二甲双胍粉末混合后，于无水乙醇中超声搅拌分散成悬浮液，所述的超声分散时间为30—60min，超声分散温度为40—60℃；无水乙醇作为溶剂；悬浮液中聚乳酸的质量百分比含量为50—80%，羟基磷灰石的质量百分比含量为5—15%，二甲双胍的质量百分比含量为10—45%，其余为无水乙醇
（2）过滤：将步骤（1）所得的悬浮液用微孔滤膜过滤，获得聚乳酸粉末、羟基磷灰石粉末、二甲双胍粉末的粉末混合材料；
（3）干燥：将粉末混合材料于60—100℃干燥；
（4）预热：将干燥后的粉末混合材料铺在激光烧结模板上面，每层铺粉厚度为0.1—0.2mm，预热至低于176℃（聚乳酸的熔融温度）；
（5）激光烧结：按预设的人工骨的截面形状，在激光烧结模板上对铺设的第一层粉末混合材料选择性分层扫描使粉末混合材料烧结；当一层烧结完成后，继续下一层铺粉，再扫描烧结，后一层和前一层烧结在一起，循环往复，直至人工骨烧至预设的高度（高度可以根据需要任意设置），即得用于修复肿瘤性骨缺损的人工骨。
优选地，步骤（5）中激光烧结时设置的激光烧结条件为标刻速度80—400mm/s，激光功率2—3W，激光频率2—10kHz，占空比1.5—2.5。
下面对本发明作进一步说明：
针对肿瘤性骨缺损修复困难这一难题，本发明将材料PLLA、nHA、MET三种组分复合，采用选择性激光烧结方法，加工温度在170—200℃之间，将MET、nHA组分添加进入PLLA基体材料，制备的支架力学强度好，药物分布均匀，随基体材料的降解逐步释放，避免采用涂层方法难以避免的药物突释作用。MET毒副作用小，除具有抑制肿瘤细胞增殖作用外，兼具促进成骨的双重功效，非常适合用于肿瘤性骨缺损的修复过程，既能提高骨修复能力，又能抑制肿瘤细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、首次提出利用药物二甲双胍增强人工骨骨修复能力及赋予人工骨抗肿瘤功效，从而可能为肿瘤性骨缺损的治疗提供一种新的治疗选择。
2、通过选择性激光烧结，药物MET被均匀融合进入PLLA基质，药物伴随支架的降解而逐步释放，PLLA降解速率较慢，从而避免了以往其他方法制备的载药人工骨较普遍存在的药物突释现象，该人工骨实现了药物长周期释放，保证了药物的可持续作用。
本发明用二甲双胍作为主要增效组分，达到既抑制肿瘤细胞，又增强骨修复能力的目的，解决目前肿瘤性骨缺损局部易复发的缺陷，尤其是良性或交界性肿瘤，如骨巨细胞瘤；同时优良的骨修复性能又解决肿瘤切除后巨大骨缺损自我修复困难的挑战。
本发明的价值在于：
（1）本发明所有采用原料均是已批准在用的生物医用材料或药物，通过选择性激光烧结工艺使得三种成分优势互补，实现功能的最优化；
（2）本发明制备的骨修复材料具有抗肿瘤功能，能够解决骨肿瘤术后局部残留肿瘤细胞复发的问题；同时PLLA优良的生物相容性、可降解性，支架的三维多孔结构，纳米羟基磷灰石优异的骨传导功能、二甲双胍促进骨髓间充质干细胞向成骨分化的性能，均有利骨缺损部位修复，加快骨修复速度，并提供缺损修复质量；
（3）本发明制备的骨修复材料最适用于肿瘤性骨缺损部位的填充治疗，制备方法简单，生物力学性能接近正常骨，降解速率跟骨修复速率匹配，药物稳定释放，符合临床使用的需求，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为骨支架外观图；
图2为骨支架激光共聚焦下观察的活死细胞染色图；
图3为支架电镜观察图；
图4为不同二甲双胍含量支架的傅里叶红外光谱图。
具体实施方式
实施例1
1.复合粉末制备
（1）混料：按9:1称取PLLA、nHA，物理混合后，置于装有无水乙醇的烧杯中，将混合物超声搅拌分散成悬浮液。所述的PLLA粉末颗粒尺寸为20—80μm，粘度1.8—2.5dL/g，熔点为170—185℃，所述的超声分散时间为30—60min，超声分散温度为40—60℃；
（2）过滤：用微孔滤膜过滤悬浮液，获得混合材料；
（3）干燥：将混合材料于旋转干燥仪干燥得到nHA/PLLA混合粉末。所述干燥温度为60—100℃。混合粉末中聚乳酸的质量百分比含量为90%，羟基磷灰石的质量百分比含量为10%。
2.选择性激光烧结
（1）预热：将PLLA/nHA混合粉末铺在激光烧结模板上面，每次铺粉厚度0.1—0.2mm，预热至略低于PLLA的熔融稳度；
（2）选择性激光烧结：利用软件选择合适的光斑直径、激光功率及扫描速度等工艺参数，其中标刻速度80—400mm/s，激光功率2—3W，激光频率2—10kHz，占空比1.5—2.5之间；按照设置好的人工骨的截面形状，对混合粉末选择性分层扫描从使粉末材料烧结；
（3）重复烧结成型：一层烧结完成后，继续下一层铺粉，再扫描烧结，后一层和前一层烧结在一起，循环往复，直至人工骨烧至相应高度；
（4）辐照消毒：将成型的PLLA/nHA支架及MET/PLLA/nHA样品真空封装，送至辐照中心，行Co60辐照照射消毒后，常温下保存待用。
3.性能评估：
（1）物相结构：骨支架经XRD、傅里叶红外光谱等物相检测分析发现支架的主要组分为PLLA、且能检测到nHA的存在；
（2）弹性模量及细胞毒性：抗压缩实验测得复合骨支架的弹性模量为28MPa，CCK—8细胞毒性试验显示：相对于未接种至支架的细胞组，该支架对骨肉瘤MG63及骨髓间充质干细胞细胞活力无明显影响。
实施例2
1.复合粉末制备
（1）混料：按9:1:2称取PLLA、nHA、MET，物理混合后，置于装有无水乙醇的烧杯中，将混合物超声搅拌分散成悬浮液。所述的PLLA粉末颗粒尺寸为20—80μm，粘度1.8—2.5dL/g，熔点为170—185℃，所述的超声分散时间为30—60min，超声分散温度为40—60℃；
（2）过滤：用微孔滤膜过滤悬浮液，获得混合材料；
（3）干燥：将混合材料于旋转干燥仪干燥得到MET/nHA/PLLA混合粉末。所述干燥温度为60—100℃。混合粉末中聚乳酸的质量百分比含量为75%，羟基磷灰石的质量百分比含量为8.3%，二甲双胍的质量百分比含量为16.7%。
2.选择性激光烧结
（1）预热：将MET/PLLA/nHA混合粉末铺在激光烧结模板上面，每次铺粉厚度0.1—0.2mm，预热至略低于PLLA的熔融稳度；
（2）选择性激光烧结：利用软件选择合适的光斑直径、激光功率及扫描速度等工艺参数，其中标刻速度80—400mm/s，激光功率2—3W，激光频率2—10kHz，占空比1.5—2.5之间；按照设置好的人工骨的截面形状，对混合粉末选择性分层扫描从使粉末材料烧结；
（3）重复烧结成型：一层烧结完成后，继续下一层铺粉，再扫描烧结，后一层和前一层烧结在一起，循环往复，直至人工骨烧至相应高度；
（4）辐照消毒：将成型的PLLA/nHA支架及MET/PLLA/nHA样品真空封装，送至辐照中心，行Co60辐照照射消毒后，常温下保存待用。
3.性能评估：
（1）物相结构：骨支架经XRD、傅里叶红外光谱等物相检测分析发现支架的主要组分为PLLA、且均能检测到nHA、MET的存在，且药物波峰高度跟支架中MET剂量成正相关；
（2）弹性模量及细胞毒性：抗压缩实验测得复合骨支架的弹性模量为26.5MPa，CCK—8细胞毒性试验显示：相对于空白对照组，该支架抑制骨肉瘤MG63细胞活力，对骨髓间充质干细胞细胞活力无显著差异。
相对于空白组，该支架力学强度稍低，跟药物的掺入导致PLLA比例下降有关。
实施例3
1.复合粉末制备
（1）混料：按9:1:4称取PLLA、nHA、MET，物理混合后，置于装有无水乙醇的烧杯中，将混合物超声搅拌分散成悬浮液。所述的PLLA粉末颗粒尺寸为20—80μm，粘度1.8—2.5dL/g，熔点为170—185℃，所述的超声分散时间为30—60min，超声分散温度为40—60℃；；
（2）过滤：用微孔滤膜过滤悬浮液，获得混合材料；
（3）干燥：将混合材料于旋转干燥仪干燥得到MET/nHA/PLLA混合粉末。所述干燥温度为60—100℃。混合粉末中聚乳酸的质量百分比含量为64.3%，羟基磷灰石的质量百分比含量为7.1%，二甲双胍的质量百分比含量为28.6%。
2.选择性激光烧结
（1）预热：将MET/PLLA/nHA混合粉末铺在激光烧结模板上面，每次铺粉厚度0.1—0.2mm，预热至略低于PLLA的熔融稳度；
（2）选择性激光烧结：利用软件选择合适的光斑直径、激光功率及扫描速度等工艺参数，其中标刻速度80—400mm/s，激光功率2—3W，激光频率2—10kHz，占空比1.5—2.5之间；按照设置好的人工骨的截面形状，对混合粉末选择性分层扫描从使粉末材料烧结；
（3）重复烧结成型：一层烧结完成后，继续下一层铺粉，再扫描烧结，后一层和前一层烧结在一起，循环往复，直至人工骨烧至相应高度；
（4）辐照消毒：将成型的PLLA/nHA支架及MET/PLLA/nHA样品真空封装，送至辐照中心，行Co60辐照照射消毒后，常温下保存待用。
3.性能评估：
（1）物相结构：骨支架经XRD、傅里叶红外光谱等物相检测分析发现支架的主要组分为PLLA、且均能检测到nHA、MET的存在，且药物波峰高度跟支架中MET剂量成正相关；
（2）弹性模量及细胞毒性：抗压缩实验测得复合骨支架的弹性模量为23MPa，CCK—8细胞毒性试验显示：相对于空白对照组，该支架抑制骨肉瘤MG63细胞活力，对骨髓间充质干细胞细胞活力无显著差异。
相对于空白组，该支架力学强度稍低，跟药物的掺入导致PLLA比例下降有关。
实施例4
1.复合粉末制备
（1）混料：按9:1:8称取PLLA、nHA、MET，物理混合后，置于装有无水乙醇的烧杯中，将混合物超声搅拌分散成悬浮液。所述的PLLA粉末颗粒尺寸为20—80μm，粘度1.8—2.5dL/g，熔点为170—185℃，所述的超声分散时间为30—60min，超声分散温度为40—60℃；
（2）过滤：用微孔滤膜过滤悬浮液，获得混合材料；
（3）干燥：将混合材料于旋转干燥仪干燥得到MET/nHA/PLLA混合粉末。所述干燥温度为60—100℃。混合粉末中聚乳酸的质量百分比含量为50%，羟基磷灰石的质量百分比含量为5.6%，二甲双胍的质量百分比含量为44.4%。
2.选择性激光烧结
（1）预热：将MET/PLLA/nHA混合粉末铺在激光烧结模板上面，每次铺粉厚度0.1—0.2mm，预热至略低于PLLA的熔融稳度；
（2）选择性激光烧结：利用软件选择合适的光斑直径、激光功率及扫描速度等工艺参数，其中标刻速度80—400mm/s，激光功率2—3W，激光频率2—10kHz，占空比1.5—2.5之间；按照设置好的人工骨的截面形状，对混合粉末选择性分层扫描从使粉末材料烧结；
（3）重复烧结成型：一层烧结完成后，继续下一层铺粉，再扫描烧结，后一层和前一层烧结在一起，循环往复，直至人工骨烧至相应高度；
（4）辐照消毒：将成型的PLLA/nHA支架及MET/PLLA/nHA样品真空封装，送至辐照中心，行Co60辐照照射消毒后，常温下保存待用。
3.性能评估：
（1）物相结构：骨支架经XRD、傅里叶红外光谱等物相检测分析发现支架的主要组分为PLLA、且均能检测到nHA、MET的存在，且药物波峰高度跟支架中MET剂量成正相关；
（2）弹性模量及细胞毒性：抗压缩实验测得复合骨支架的弹性模量为20MPa，CCK—8细胞毒性试验显示：相对于空白对照组，该支架抑制骨肉瘤MG63细胞活力，同时对骨髓间充质干细胞细胞活力亦产生抑制。
相对于空白组，该支架力学强度稍低，跟药物的掺入导致PLLA比例下降有关，该支架同时对骨肉瘤MG63细胞及骨髓间充质干细胞产生抑制与支架二甲双胍药物浓度过高有关，因此实验得出9：1：4的最佳材料配比。
对比例1
1.复合粉末制备
（1）混料：按9:1称取PLLA、nHA，其中nHA质量百分比含量为10%—20%，物理混合后，置于装有无水乙醇的烧杯中，将混合物超声搅拌分散成悬浮液。所述的PLLA粉末颗粒尺寸为20—80μm，熔点为170—185℃。所述的超声分散时间为30—60min，超声分散温度为40—60℃。
（2）过滤：用微孔滤膜过滤悬浮液，获得混合材料。
（3）干燥：将混合材料于旋转干燥仪干燥得到nHA/PLLA混合粉末。所述干燥温度为60—100℃。
2.选择性激光烧结
（1）预热：将PLLA/nHA混合粉末铺在激光烧结模板上面，每次铺粉厚度0.1—0.2mm，预热至略低于PLLA的熔融稳度。
（2）选择性激光烧结：利用软件选择合适的光斑直径、激光功率及扫描速度等工艺参数，其中标刻速度80—400mm/s，激光功率2—3W，激光频率2—10kHz，占空比1.5—2.5之间。按照设置好的人工骨的截面形状，对混合粉末选择性分层扫描从使粉末材料烧结。
（3）重复烧结成型：一层烧结完成后，继续下一层铺粉，再扫描烧结，后一层和前一层烧结在一起，循环往复，直至人工骨烧至相应高度。
3.二甲双胍涂层制备
（1）称量：按配方分别称取壳聚糖及二甲双胍粉末重量，配置1.5%醋酸溶液。
（2）混合搅拌：将二甲双胍粉末加入1.5%醋酸溶液，使各组二甲双胍浓度在0.1mM—30mM之间，将壳聚糖加入上述二甲双胍浓度溶液，使用磁力搅拌仪及超声清洗仪分散形成均匀水凝胶备用，二甲双胍浓度为1—4%，壳聚糖浓度均为1—5%。所述的磁力搅拌时间为20—60min，磁力搅拌速度为400—100r/min，搅拌温度为40—60℃，超声分散时间为30—60min，超声分散温度为40—60℃；
4.MET药物涂层PLLA/nHA纳米人工骨的制备
（1） 将PLLA/nHA纳米复合人工骨浸泡至不同浓度二甲双胍/壳聚糖水凝胶中，浸泡时间6—24小时，转移至真空冷冻干燥机干燥成形，重复三次，最后药物涂层厚度约1—2mm。
（2）辐照消毒：将成型的PLLA/nHA支架及MET/PLLA/nHA样品真空封装，送至辐照中心，行Co60辐照照射消毒后，常温下保存待用。
3.性能评估：
（1）物相结构：骨支架经XRD、傅里叶红外光谱等物相检测分析发现支架的主要组分为PLLA、且均能检测到nHA、MET的存在，且药物波峰高度跟支架中MET剂量成正相关。
（2）弹性模量及细胞毒性：抗压缩实验测得复合骨支架的弹性模量为20MPa，CCK—8细胞毒性试验显示：相对于空白对照组，低浓度二甲双胍涂层支架对骨肉瘤MG63细胞、骨髓间充质干细胞均不能产生抑制。
相对于直接烧结药物，药物涂层支架的力学强度要高，跟药物并未直接掺入直接基体有关，二甲双胍药物涂层支架对骨肉瘤MG63、骨髓间充质干细胞不能产生抑制跟药物突释、涂层载药量低有关。
Claims (6)
1.一种用于修复肿瘤性骨缺损的人工骨，其特征在于，所述人工骨由聚乳酸粉末、羟基磷灰石粉末、二甲双胍粉末按质量比（8—10）:1:（3—5）组成。
2.如权利要求1所述的用于修复肿瘤性骨缺损的人工骨，其特征在于，所述人工骨由聚乳酸粉末、羟基磷灰石粉末、二甲双胍粉末按质量比9:1:4组成。
3.如权利要求1所述的用于修复肿瘤性骨缺损的人工骨，其特征在于，所述聚乳酸粉末粒径为20—80μm，黏度为1.5—3.0dL/g，熔点为170—185℃；所述羟基磷灰石粉末粒径＜200nm；所述二甲双胍为生物医药级。
4.如权利要求1所述的用于修复肿瘤性骨缺损的人工骨，其特征在于，所述聚乳酸粉末为左旋聚乳酸粉末，所述羟基磷灰石粉末为纳米复合羟基磷灰石粉末。
5.如权利要求1至4任一项所述人工骨的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）混合：将聚乳酸粉末、羟基磷灰石粉末、二甲双胍粉末混合后，于无水乙醇中超声搅拌分散成悬浮液，所述的超声分散时间为30—60min，超声分散温度为40—60℃；
（2）过滤：将步骤（1）所得的悬浮液用微孔滤膜过滤，获得聚乳酸粉末、羟基磷灰石粉末、二甲双胍粉末的粉末混合材料；
（3）干燥：将粉末混合材料于60—100℃干燥；
（4）预热：将干燥后的粉末混合材料铺在激光烧结模板上面，每层铺粉厚度为0.1—0.2mm，预热至低于176℃；
（5）激光烧结：按预设的人工骨的截面形状，在激光烧结模板上对铺设的第一层粉末混合材料选择性分层扫描使粉末混合材料烧结；当一层烧结完成后，继续下一层铺粉，再扫描烧结，后一层和前一层烧结在一起，循环往复，直至人工骨烧至预设的高度，即得用于修复肿瘤性骨缺损的人工骨。
6.如权利要求5所述人工骨的制备方法，其特征在于，步骤（5）中激光烧结时设置的激光烧结条件为标刻速度80—400mm/s，激光功率2—3W，激光频率2—10kHz，占空比1.5—2.5。
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