CN101787396B - 荧光标记14个x染色体str基因座复合扩增检测系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种X-STR基因座荧光标记复合扩增体系及其应用，该复合扩增体系共包含14个基因座：DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS6809、DXS7424、DXS6789、DXS9898、DXS7132、GATA165B12、DXS101、DXS10075、GATA31E08、DXS10074和DXS10079。本发明的14个X-STR基因座是在一个复合扩增体系中同时扩增，快速、方便，PCR产物经遗传分析仪电泳，结果自动分析，能标准化、国际化，保证不同实验室数据比较的正确性。
Description
技术领域
本发明涉及检测人体基因组中具有多态性的遗传标记，尤其涉及X染色体遗传标记技术，具体涉及一种X-STR基因座荧光标记复合扩增体系及其应用。
背景技术
短串联重复序列(short tandem repeats，简称STR)是由2～7个碱基对作为核心单位，串联重复形成的一类微卫星DNA序列，其片段可采用PCR技术扩增。STR主要由于核心重复单位数目的变化形成了STR基因位点的遗传多态性，其等位基因可用银染、荧光标记和放射自显影等技术分型。人类基因组中，平均每6～10kb就存在有一个STR基因位点，为法医个人识别和亲子鉴定提供了高信息基因位点的丰富来源。
X染色体是人类性染色体，X染色体短串联重复(X-chromosomalShort Tandem Repeat，X-STR)是性染色体上一类多态性遗传标记，男性的X-STR以单倍型形式存在只能从其母亲中得到，且只能遗传给女儿，因此同父所生的姐妹在X-STR基因座上有1个相同的等位基因，孙女X-STR基因座有1个等位基因与其祖母相同。X染色体这种独特的遗传方式，使得X-STR在亲缘鉴定中有特殊的应用价值。
在亲缘鉴定中，有些没有父母双亲参与检测的特殊案件，如：姐妹认亲、同父异母的半同胞姐妹认亲、隔代认亲(祖母-孙女)等，用常染色体、Y染色体或线粒体的遗传标记无法排除或认定，此时只有依靠X染色体STR才能起到直接排除或认定的作用。
此外在有先天性缺陷的遗传病中，可通过检测X染色体STR来诊断有无X染色体多倍体、X染色体重复、X-STR重复序列长短等，同时，X染色体STR检测可应用于X连锁遗传病、X染色体单亲二倍体、X染色体失活的亲源性等鉴定。从而为伴X染色体遗传病提供产前诊断方法。
因此，可以通过分析X染色体上的STR基因座的等位基因分型来确定亲缘关系和用于伴X染色体遗传病的产前诊断。
X染色体STR位点广泛存在真核细胞基因组中，高度稳定且具有较高的遗传多态性，然而与常染色体和Y染色体STR相比，迄今发现和应用的X-STR位点数量较少，群体分布、突变率、连锁平衡、基因结构等方面的信息尚不够丰富，在法医学、医学等领域的应用受限，远不及其他DNA遗传标记广泛。
X染色体遗传标记的研究在国内还处于初期，目前国际上商品化检测试剂盒仅有德国Argus X-8和
Argus X-12，该类试剂盒在法医学应用实践中存在以下问题：
(1)采用这类试剂盒需要增加遗传标记时遇到困难；
(2)这些X-STR基因位点都是基于中国群体以外的群体(主要是白人群体)资料而开发的，其中有些基因位点，在中国群体的基因频率分布较差，个人识别能力较低；
(3)国外商品化试剂盒价格昂贵。
这些缺点限制了X染色体遗传标记在国内的应用，不利于进一步在基层推广。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种适合于中国人群的，可以快速、方便针对常染色体STR、Y-STR难以排除或认定亲缘关系的特殊检案(姐妹认亲、同父异母的半同胸姐妹认亲、隔代认亲等)进行鉴定的X-STR基因座荧光标记复合扩增体系。
本发明的另一个目的在于提供上述X-STR基因座荧光标记复合扩增体系在为伴X连锁遗传病、X染色体单亲二倍体、X染色体失活的亲源性鉴定等提供产前诊断，以及姐妹认亲、同父异母的半姐妹认亲、隔代认亲等亲缘鉴定中的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
一种X-STR基因座荧光标记复合扩增体系，该复合扩增体系共包含14个基因座：DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS6809、DXS7424、DXS6789、DXS9898、DXS7132、GATA165B12、DXS101、DXS10075、GATA31E08、DXS10074和DXS10079。
本发明对上述14个X-STR基因座进行了研究，表明这14个基因座在中国人群中有高度的遗传多态性和良好的等位基因频率分布。
一、本发明复合扩增体系中14个基因座的选择
(1)位于同一连锁群内
作为位于同一染色体的基因座，必须考虑到连锁遗传的问题。各基因座位于同一个连锁群之内，呈连锁遗传，便于以单倍型观察多态性。除GATA31E08外其余13个基因座DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS6809、DXS7424、DXS6789、DXS7132、GATA165B12、DXS101、DXS10075、DXS10074和DXS10079均位于第二连锁群内，应呈连锁遗传。
本发明的14个基因座分布于同一染色体上不同的位置，既有紧密连锁者，也有遗传距离相距较远者。紧密连锁的DXS7132-DXS10075-DXS10074-DXS10079；DXS7133-DXS7424-DXS101和DXS6801-DXS6809-DXS6789。它们分别位于Xq12、Xq21和Xq22区。紧密连锁的基因座构成单倍型，在亲缘鉴定中有利于分析亲代与子代之间的遗传关系。
(2)易于扩增
除上述14个基因座外，实验初期发明人还选择了另外一些位于X染色体第二连锁群内的基因座，如ARA、DXS6800、DXS9905、DXS7130、DXS6797、DXS9895等。但单基因座扩增结果发现，这些基因座的扩增存在着一些问题，有的扩增的产物量少，显带过浅，甚至有时很难得到扩增产物，如DXS7130；有的很容易出现非特异带(如影子带)，如DXS6797；而上述14个基因座易于扩增稳定性好，结果清晰，非特异性带很少。
因此最后选择了DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS6809、DXS7424、DXS6789、DXS9898、DXS7132、GATA165B12、DXS101、DXS10075、GATA31E08、DXS10074和DXS10079这14个易于扩增，分型较好的基因座进行复合扩增。
(3)扩增产物片段长度不重叠
复合扩增各基因座片段大小的差距应大于20bp，各基因座的等位基因之间才不会发生重叠，干扰分型。
本发明的X-STR基因座复合扩增体系根据各基因座扩增产物片段长度大小，用同一荧光标记不同扩增产物片段长度(相差大于20bp)的基因座，保证复合扩增各基因座的等位基因之间不会发生重叠，不会干扰分型。用四种不同颜色的荧光标记多个基因座的引物，保证同一反应体系能同时扩增多个基因座，而不影响各基因座的分型。本发明的14个基因座引物分别用FAM、HEX、TAM、ROX四种不同颜色的荧光标记。体系中14个X-STR基因座其荧光组合方式为FAM荧光素标记DXS7133、DXS6801、DXS981和DXS6809，HEX荧光素标记DXS7424、DXS6789、DXS9898和DXS7132，TAMRA荧光素标记DXS165B12、DXS101和DXS10075，ROX荧光素标记GATA31E08、DXS10074和DXS10079。
本发明提供一种同时分析多个X染色体STR基因座的荧光标记复合扩增体系，包括用于复合扩增分析的14个X-STR基因座的引物，全部14个基因座的引物混合在一个试管内。复合扩增体系中的基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中的引物正链的5’端用相应的荧光素标记。
二、本发明复合扩增基因座的扩增
本发明的X-STR基因座荧光标记复合扩增体系是采用复合PCR技术在同一反应管中同时扩增14个X-STR基因座。
(1)PCR反应体系
反应总体积为25μl：PCR反应缓冲液5.0μl，引物混合物5.0μlDNA聚合酶0.3μl，模板DNA 2.0μl，消毒纯净水12.7μl。
上述DNA聚合酶可选用本领域技术人员常用的DNA聚合酶，如金牌DNA聚合酶(Ampli Taq)。
(2)PCR扩增参数：
95℃ 11min
60℃ 45min
(3)ABI PRISM 3100遗传分析仪电泳分型扩增产物
a.样品准备：
混匀后瞬时离心，每管加10.0μl混合物，再加PCR产物1.0μl，瞬时离心。95℃变性4min，放置冰盒中冷却3min，取10.0μl变性后的样品转移至96孔样品板，装载入ABI PRISM 3100遗传分析仪进行电泳。
b.电泳条件：14.7kV，130μA，14.8mW。
c.结果分析：GeneMapperIDv3.1软件。
本发明的14个基因座已在发明人实验室应用于群体学调查并获得中国群体的分型结果，结果证明这些基因座多态性较高，适合于中国人群的检测，并应用于实际检案取得理想的结果。
本发明的X-STR基因座荧光标记复合扩增体系也可以制成试剂盒，为姐妹认亲和隔代认亲提供新的检测系统，为X染色体相关性遗传病进行产前诊断。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.灵敏度高：本发明的X-STR基因座荧光标记复合扩增体系在模板量为0.1ng时可检出全部14个基因座；
2.个体识别率高：本发明的X-STR基因座荧光标记复合扩增体系中的14个X-STR基因座单倍型个体识别率达到0.9999992；
3.本发明的X-STR基因座荧光标记复合扩增体系已在发明人实验室用于检测多代家系和多个小孩家系的样本。结果在120例姐妹样本中14个X-STR基因座分型均有1个相同等位基因。58例祖母-父亲-孙女的三代家系中祖母的X-STR均通过父亲稳定地传递给孙女。这结果表明本研究所选的基因座稳定性好，突变率低，分型结果准确，能满足实际检案的需要；
4.本发明在国内首先研制出一组14个X-STR基因座同时在单一反应管中的复合扩增的五色荧光标记X-STR复合扩增检测体系，达到目前国际上荧光标记X-STR基因座复合扩增试剂盒的最高水平；
5.本发明的荧光标记引物复合扩增技术快速、方便，PCR产物可用310、377、ABI PRISM 3100、3130等遗传分析仪电泳，结果自动分析，能标准化、国际化，保证不同实验室数据比较的正确性；
6.本发明可制备一套试剂盒，可进行商品化，可以填补国内没有X-STR基因座荧光复合扩增试剂盒的空白，也可补充国际X-STR基因座荧光复合扩增试剂盒的不足，作为具有中国特色的X-STR基因座复合扩增试剂盒，可用于亲子鉴定、个体识别、性别鉴定、X连锁遗传病的基因定位，特别是用于产前诊断和姐妹认亲、同父异母的半姐妹认亲、隔代认亲等亲缘鉴定；
7.本发明的X-STR基因座荧光标记复合扩增体系可以为伴X连锁遗传病、X染色体单亲二倍体、X染色体失活的亲源性鉴定等提供产前诊断方法，也为解决仅靠常染色体STR、Y-STR难以排除或认定亲缘关系的某些特殊检案(姐妹认亲、同父异母的半同胞姐妹认亲、隔代认亲等)的亲缘鉴定提供新的鉴定方法，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为实施例中祖母样本的14个X-STR基因座复合扩增图谱；
图2为实施例中孙女样本的14个X-STR基因座复合扩增图谱。
具体实施方式
实施例1 应用含有14个基因座的X-STR基因座荧光标记复合扩增体系进行姐妹认定和祖母与孙女的鉴定。
原理：X染色体是人类性染色体，X-STR是性染色体上一类多态性遗传标记，男性的X-STR以单倍型形式存在只能从其母亲中得到，且只能遗传给女儿，因此同父所生的姐妹在X-STR基因座上有1个相同的等位基因。如果可疑姐妹样本中所有X-STR基因座中有1个相同的等位基因，则不能排除其来自同一父亲，如果有3个以上的X-STR基因座中无相同等位基因，则可以排除其来自同一父亲。同样孙女X-STR基因座有1个等位基因与其祖母相同，故可疑奶奶与孙女样本中所有X-STR基因座中有1个相同的等位基因，则不能排除她们的亲缘关系，如果有3个以上的X-STR基因座中无相同等位基因，则可以排除她们的亲缘关系。
操作步骤：
1.DNA提取
Chelex-100法：剪取4X4mm的血痕或唾液斑，加200μl 10％Chelex-100，56℃烤箱过夜，置于PCR仪中100℃10min，振荡30sec，10000r/min离心2min，4℃保存备用。
2.PCR扩增
PCR扩增反应总体系为25μl：PCR反应缓冲液(Buffer)5.0μl，引物混合物(Primer Pair Mix)5.0μl，金牌DNA聚合酶(Ampli Taq
)0.3μl，模板DNA 2.0μl，消毒纯净水12.7μl。
上述PCR缓冲液的配方为：dNTP 200μmol/L，MgCl21.5mmol/L，1×Buffer。
上述引物混合物中，各个基因座的引物序列及其荧光标记如表1所示。
表1 14个X-STR基因座引物序列和荧光标记
| 基因座 | 引物序列 | 荧光标记 |
| DXS7133 | F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示 | FAM |
| R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示 | ||
| DXS6801 | F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示 | FAM |
| R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示 | ||
| DXS981 | F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示 | FAM |
| R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示 | ||
| DXS6809 | F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示 | FAM |
| R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示 | ||
| DXS7424 | F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示 | HEX |
| R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示 | ||
| DXS6789 | F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示 | HEX |
| R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示 | ||
| DXS9898 | F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示 | HEX |
| R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示 | ||
| DXS7132 | F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示 | HEX |
| R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示 | ||
| GATA165B12 | F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示 | TAMRA |
| R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示 | ||
| DXS101 | F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示 | TAMRA |
| R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示 | ||
| DXS10075 | F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示 | TAMRA |
| R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示 | ||
| GATA31E08 | F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示 | ROX |
| R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示 | ||
| DXS10074 | F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示 | ROX |
| R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示 | ||
| DXS10079 | F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示 | ROX |
| R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示 |
3.PCR扩增参数：95℃预变性11min，94℃变性1min，61℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环，再60℃延伸45min。
4.ABI PRISM 3100遗传分析仪电泳
1)开机：开启稳压电源→打开电脑(进入Win2000系统)→开启3100主机电源(仪器进入自检状态)→启动3100DATACollection数据采集软件。
2)装置准备：定期清洗和安装
把注射器、毛细管、Buffer糟等拆下，用纯水清洗，晾干，灌胶：注射器里注入相当体积的POP-4胶，排出空气。Buffer糟里盛1×Buffer溶液。双击Run 3100Data CollectionVersion2.0软件→点击菜单栏中的Wizards→点击Fill Capillary wizards，对毛细管注胶→毛细管定位和样品编辑。
3)样品准备：
混匀后瞬时离心，每管加10.0μl混合物，再加PCR产物1.0μl，瞬时离心。95℃变性4min，放置冰盒中冷却3min，取10.0μl变性后的样品转移至96孔样品板，装载入3100遗传分析仪进行电泳。
4)电泳条件：14.7kV，130μA，14.8mW。
5)结果分析：用GeneMapperIDv3.1软件进行基因分型。
分析结果如图1和2所示，从图中可以看出孙女样本14个X-STR基因座的分型均有1个等位基因与争议祖母相同，故支持争议祖母与女孩存在祖母与孙女关系。
具体案例：
案情：2009年12月，某女士带1个小女孩进行鉴定，检点是否为她的孙女。
具体鉴定过程采用前述的操作步骤：DNA提取——PCR扩增——PCR扩增产物电泳——结果分析。
结果解析如图1和2所示，从图可知，争议祖母与女孩样本DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS6809、DXS7424、DXS6789、DXS9898、DXS7132、GATA165B12、DXS101、DXS10075、GATA31E08、DXS10074和DXS1007914个X-STR基因座的分型均有1个相同等位基因。即孙女样本14个X-STR基因座的分型结果均有1个等位基因能从争议祖母中找到，且14个基因座(DXS7133/DXS6801/DXS981/DXS6809/DXS7424/DXS6789/DXS9898/DXS7132/GATA165B12/DXS101/DXS10075/GATA31E08/DXS10074/DXS10079)的单倍型9/11/13/36/15/15/12/14/10/23/17/10/16/18或9/11/13/36/15/19/12/14/10/23/17/10/16/18尚未见报道，在本实验室检测500个无关个体仍未出现，故其频率小于0.2％，LR值＞500。支持争议祖母与女孩存在祖母与孙女关系。
一种X-STR基因座荧光标记复合扩增体系及其应用序列表
<110>中山大学
<120>一种X-STR基因座荧光标记复合扩增体系及其应用
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<170>PatentIn version 3.5
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Claims (4)
1.一种X-STR基因座荧光标记检测试剂盒，其特征在于，包含检测14个基因座的引物，所述的14个基因座为DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS6809、DXS7424、DXS6789、DXS9898、DXS7132、GATA165B12、DXS101、DXS10075、GATA31E08、DXS10074和DXS10079；所述引物序列如SEQ ID NO：1～28所示。
2.根据权利要求1所述X-STR基因座荧光标记检测试剂盒，其特征在于所述14个基因座引物分别用FAM、HEX、TAM或ROX四种荧光素标记。
3.根据权利要求2所述X-STR基因座荧光标记检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒中，DXS7133、DXS6801、DXS981和DXS6809相应的引物由FAM荧光素标记，DXS7424、DXS6789、DXS9898和DXS7132相应的引物由HEX荧光素标记，DXS165B12、DXS101和DXS10075相应的引物由TAMRA荧光素标记，GATA31E08、DXS10074和DXS10079相应的引物由ROX荧光素标记。
4.权利要求1～3所述的任一X-STR基因座荧光标记检测试剂盒在姐妹亲缘关系和祖母-孙女亲缘关系鉴定中的应用。
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