CN104120183A - Mini-X-STR和Amelogenin基因座荧光标记复合扩增试剂盒 - Google Patents

Mini-X-STR和Amelogenin基因座荧光标记复合扩增试剂盒 Download PDF

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CN104120183A CN201410359425.1A CN201410359425A CN104120183A CN 104120183 A CN104120183 A CN 104120183A CN 201410359425 A CN201410359425 A CN 201410359425A CN 104120183 A CN104120183 A CN 104120183A
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mini
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吴微微
郝宏蕾
吕德坚
周怀谷
苏艳佳
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    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
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Abstract

本发明公开了一种Mini-X-STR和Amelogenin基因座荧光标记复合扩增试剂盒，该系统可以同时检测12个X染色体基因座，每个基因座的扩增片段均小于250bp；本发明将12个基因座分为4组，共涉及5种颜色的荧光标记；12个mini-X-STR基因座的荧光标记复合扩增检验体系方法简单、灵敏度高、结果可靠、稳定，可以解决祖母-孙女、姐妹或更远的亲缘关系的亲权鉴定，以及疑难降解生物检材等方面实际办案的需要。本复扩系统整个PCR程序控制在40-50min之间，可以达到快速检测的效果。

Description

Mini-X-STR和Amelogenin基因座荧光标记复合扩增试剂盒
技术领域
本发明公开一种Mini-X-STR和Amelogenin基因座荧光标记复合扩增试剂盒，共包括13个位点的荧光标记快速复合扩增检验，具体是涉及X染色体基因座的五色荧光标记快速复合扩增系统，可以解决祖母-孙女、姐妹或更远的亲缘关系的亲权鉴定，以及疑难降解生物检材等方面实际办案的需要。
背景技术
在人类的23对染色体中，其中一对为性染色体即X和Y染色体。在正常的体细胞中，女性有一对X染色体，核型为46XX；而男性只有一条X染色体，以半合子的状态存在，核型为46XY。性染色体在减数分裂中，与常染体一样，同样会发生分离，分配到配子中，在受精卵中又组合成XX或XY染色体对。含XX染色体的受精卵发育成女孩，含XY染色体的受精卵发育男孩。
女性的一对X染色体在卵子的生成过程中可以像常染色体那样发生互换和重组。但是在男性个体生成精子的过程中，X和Y染色体并不能随意互换和重组。非重组区的基因以性连锁的方式遗传。X染色体特异性的基因以X连锁的方式遗传，即X连锁遗传。父亲的X染色体基因只遗传且必须遗传给女儿，而母亲的X染色体基因既可以遗传给女儿也可以遗传给儿子。X染色体这种独特的遗传方式，使得X染色体的遗传标记在亲权鉴定中具有特殊的应用价值，在一些缺失双亲的鉴定中，如姐妹的认定，更是有着常染色体遗传标记难以比拟的优点。
随着STR复合扩技术的发展，X染色体STR的复合扩增也在发展。从最初的复合扩增银染法到荧光标记引物复合扩增，现在已报道最多可以同时复合扩增17、19个X-STR。并且国外有了检测X-STR的复合扩增的商品化试剂盒，其最多可以复合扩增12个X-STR(http://www.biotype.de/fileadmin/user/Flyer/Mentype_ArgusX-12.pdf)。国内也出现了基点认知17个X-STR。但Qiagen的ArgusX-12最大扩增子在375bp不适于降解检材的分型，且无法做到法医对快速的要求。基点认知最大片段达到330bp，且无法做到快速检测。
随着STR技术在法庭科学中的逐渐广泛应用，越来越多的微量疑难生物检材(如各类接触性脱落细胞、汗斑、)被提取送检要求进行DNA检验，这些疑难检材往往存在量微、腐败降解或含有较多抑制因素的等问题，采用常规的STR技术检验，尤其是大片段的基因座，经常不能扩增成功。本发明建立的mini-STR基因座位复合扩增体系，所有基因座扩增片段均不大于236bp，其中DXS7423基因座扩增片段为187-207bp，DXS10162基因座扩增片段为196-236bp，其余10个基因座扩增片段均不大于205bp，因此可以在一定程度上克服微量、因降解导致的小片段检材、含扩增抑制剂等常见难题，容易扩增成功，从而提高困难生物检材的检验成功率。
目前的STR分型技术，往往包括样本检材的DNA提取、PCR扩增和分型检测三项主要操作步骤，获得一个样本的最终分型结果往往需要8个小时以上。缩短样本DNA检验时间，在实际检案中将有利于快速锁定犯罪嫌疑人，或排除无辜人员，在案件侦破过程中具有重要意义，是法庭科学DNA分型技术发展的必然方向。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是X-STR基因座检测过程中检测时间时、扩增片段大、在小片段检材上检测效果不好，提供了一种Mini-X-STR和Amelogenin基因座荧光标记复合扩增试剂盒。
技术方案：
Mini-X-STR和Amelogenin基因座荧光标记扩增试剂盒，包括有用于扩增如下13个基因座的引物：DXS7133、DXS8378、DXS981、DXS7424、DXS6789、DXS10159、GATA165B12、DXS101、DXS7423、GATA31E08、DXS10164、DXS10162、Amelogenin。
上述的引物以及引物在扩增体系中优选浓度如表1所示：
表1优选引物序列以及其在扩增体系中的优选浓度
进一步地，上述的试剂盒中的引物是在同一个扩增体系中进行复合扩增的。
进一步地，试剂盒的扩增体系的组成如表2所示：
表2
组分 体积
Buffer 11μL
基因组DNA 0.1～10μl含量为0.04～5ng
权利要求1所述的引物 5.0μL
sdH2O 补足至25.0μL
其中所述的buffer的组成是：MgCl27.5mM、Tris-HCl buffer 125mM、KCl 125mM、dNTPs7.5m M、BSA 2mg/ml、Taq酶0.5μL，其余为水。
进一步地，所述的每个基因座对应的引物中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。
进一步地，所述的荧光染料标记物为6-FAM、HEX、TAMRA或ROX。
有益效果
1、建立了包含DXS101、DXS10159、DXS10162、DXS10164、DXS6789、DXS7133、DXS7423、DXS7424、DXS8378、DXS981、GATA165B12和GATA31E08这12个X-STR与Amelogenin基因座组合的荧光标记复合扩增体系；
2、建立的mini-STR复合扩增体系，扩增片段短，适合腐败生物检材的检验。在12个X-STR基因座中，DXS10162基因座扩增片段小于(含)236bp，DXS7423基因座扩增片段小于(含)207bp，其余10个STR基因座扩增片段均小于(含)205bp，在实际应用中可成功获得白骨化尸骨、牙齿、接触性脱落细胞等腐败微量生物检材的STR分型；
3、建立的mini-X-STR复合扩增体系检测灵敏度高，可对40pg的模板DNA成功检测，获得完整分型；
4、对前述12个X-STR基因座在浙江汉族人群中进行群体遗传学调查，累计DPF值与DPM值分别达1-1.62×10-11与1-3.5×10-7；累计MECT值与MECD值分别达0.999998与0.999891，所有X-STR基因座均属中高度多态性，适合法医学应用；
5、选择的X-STR基因座特点：既选择位于不同连锁群的STR(DXS6789、DXS7133、DXS7423、DXS8378、DXS981、GATA165B12、GATA31E08)，使得在计算法医学参数时有可能可以使用乘积规则以获得较高的值，同时又选择两组紧密连锁的STR(DXS7424-DXS101和DXS10159-DXS10162-DXS10164)，以便能够以单倍型的形式观察连锁基因座家系中的遗传传递。两者结合，可提高亲缘鉴定的鉴别率和准确性。
6、快速检测，整个扩增过程在40～50min，远远短于现在X-STR程序需要2-4h，且可以做到直接扩增，不需要提取过程，从扩增到检测只需要2h便可得到结果。
附图说明
图1：等位基因分型标准物分型结果；
图2：对标准品9947样品的STR分型结果；
图3：牙齿样本1检测结果图；
图4：牙齿样本2检测结果图；
图5：骨骼样本1检测结果图；
图6：骨骼样本2检测结果图；
图7：脱落细胞样本1检测结果图；
图8：脱落细胞样本2检测结果图；
图9：肋软骨样本2检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本文使用的近似语在整个说明书和权利要求书中可用于修饰任何数量表述，其可在不导致其相关的基本功能发生变化的条件下准许进行改变。因此，由诸如“约”的术语修饰的值并不局限于所指定的精确值。在至少一些情况下，近似语可与用于测量该值的仪器的精度相对应。除非上下文或语句中另有指出，否则范围界限可以进行组合和/或互换，并且这种范围被确定为且包括本文中所包括的所有子范围。除了在操作实施例中或其他地方中指明之外，说明书和权利要求书中所使用的所有表示成分的量、反应条件等等的数字或表达在所有情况下都应被理解为受到词语“约”的修饰。
本发明结合了X-STR和miniSTR的优点，利用快速扩增技术研发了一套所有基因座扩增片段均小于240bp(其中DXS7423基因座扩增片段为187-207bp，DXS10162基因座扩增片段为196-236bp，其余10个基因座扩增片段均不大于205bp)的12个X-STR和Amelogenin的快速复合扩增检测系统，其扩增时间在40-50min，以解决祖母-孙女、姐妹以及一些亲缘关系更加疏远的亲权鉴定，与腐败降解生物检材的DNA检验问题。
实施例1基因座的确定、复合扩增的引物和扩增体系的设计
为解决祖母-孙女、姐妹等隔代关系的亲权鉴定以及腐败降解生物检材的检验难题，对X-STR基因座的选择，主要依据下列原则：
1.具有较好的多态性：选择多个基因座位，筛选出人群的多态性较高的基因座位，提高个体识别率；
2.考虑连锁和重组关系：由于X染色体STR位于同一染色体上，须要考虑连锁和重组。在本复合扩增体系中，我们既选择位于不同连锁群的STR，使得在计算法医学参数时有可能可以使用乘积规则以获得较高的值，同时又选择两组紧密连锁的STR(DXS7424-DXS101和DXS10159-DXS10162-DXS10164)，以便能够以单倍型的形式观察其中家系的遗传传递。两者结合，可提高亲缘鉴定的鉴别率和准确性；
3、基因座的扩增片段长度：在法医学案件，很多案件现场检材的DNA都会发生不同程度的降解，miniSTR有助提高降解检材检出成功率。本研究中选择的基因座扩增片段在70-250bp之间，而且绝大多数的基因座扩增片段长度小于200bp，适用于降解生物检材的检测。
在确定了基因座之后，进行扩增引物设计。当采用13个基因座对应的引物扩增，其在同一反应体系中进行，随着复合扩增体系中基因座数目的增加，由于竞争的影响，各基因座的相对平衡控制难度加大，难以达到平衡的难题。在引物设计的时候，要考虑基因座排布的问题，排布越合理，在有限的空间才能多放基因座。在一个多引物复合扩增的体系中，必然遇到引物相互作用，相互竞争的关系，理论上每任意两条引物之间都可能产生引物二聚体、非特异扩增的情况，每增加一个基因座，工作量都是成倍增长。另外，引物设计还要兼顾基因座的排布，而对不同基因座的引物，以及由引物设计产生的基因座排布，都需要做大量实验摸索获得。先对13个位点的单个基因座引物进行反复调整测试，退火温度特异性达到标准后，研究13个位点复合扩增PCR反应条件，通过大量的反复实验确定了复合扩增中的各个参数，如，循环参数、退火温度、缓冲液离子强度、酶量、复合扩增反应体积的变化以及模板DNA量等，使扩增产物达到平衡、特异的要求，建立起复合扩增体系，同时扩增出13个位点。考虑快速扩增程序对引物的效率要求很高，需要反复进行引物设计，调试，最终确定复扩体系，具体的引物和引物浓度如表1所示，扩增体系组成如表2所示。
另外，还确定了分组荧光标记的方案，本研究对荧光染料进行了鉴别、遴选，选用了蓝、绿、黄、红、橙五种荧光标记物，优选了5色荧光组合方案。选择DXS7133、DXS8378、DXS981、DXS7424、DXS6789、DXS10159、GATA165B12、DXS101、DXS7423、GATA31E08、DXS10164和DXS10162这12个基因座，以及部分备用基因座位(DXS6803、HPRTB、DXS6801、DXS10165、GATA172D05、DXS7132、DXS7130等)；其中DXS7424和DXS101为3碱基重复，DXS10164为5碱基重复，其余9个X-STR基因座是4碱基重复。另外为甄别性别，增加了Amelogenin基因座。自行设计各基因座引物，并在引物5’端标记上荧光染料，举例其中一种优选组合和标记方式。DXS7133、DXS8378、DXS981为第一组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为6-FAM；DXS7424、DXS6789、DXS10159为第二组，采用绿色荧光染料标记，荧光标记物为HEX；GATA165B12、DXS101、DXS7423为第三组，采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA；GATA31E08、DXS10164和DXS10162为第四组；扩增片段控制在250bp以内。
该试剂盒还设有内标，为AGCU Marker SIZ-500(无锡中德美联生物技术有限公司)和对标准品9947A(Promega公司美国)。
该试剂盒的扩增程序如下：
1、扩增热循环
(l)将PCR扩增管置于热循环仪上；
(2)选择表3的程序进行扩增；
(3)扩增后的样品应避光保存；
表3热循环仪的扩增程序
2、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物〔(0.5μlAGCU Marker SIZ-500(无锡中德美联生物技术有限公司))×(进样数)+(12μl去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μl上样混合物与1μl扩增产物或系统中等位基因分析标准物AllelicLadder混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析；电泳采用多道或单道毛细管电泳。
3、分型分析
用片段分析软件GeneMapper分析步骤2中遗传分析仪检测收集的数据。其中基因组DNA样品来源于唾液斑、组织、血痕或血液。
实施例2试剂盒的应用
采用实施例1中最终确定的试剂盒对等位基因分型标准物和9947标准品进行分型试验，用片段分析软件GeneMapper分析步骤3中遗传分析仪检测收集的数据，等位基因分型结果如图1所示，从图中可以明显看出，各个基因座的扩增峰之间相互无干扰、无杂峰出现。另外再将标准品9947的样品分析数据和分型标准物的分型结果比较，得到9947实际样品的分型数据，结果如图2，等位基因分型结果与其样品一致，且无杂峰出现。
在此基础上，对日常检案中涉及的疑难生物检材，经硅珠法提取所得的模板DNA：包括牙齿样本，骨骼样本及脱落细胞，同样采用该试剂盒进行分型分析，用片段分析软件GeneMapper分析遗传分析仪检测收集的数据，将样品分析数据和等位基因分型标准物(图1)比较，得到实际样品的分型数据，结果图3～9，从图中可以看出，本发明提供的试剂盒可以对较难扩增的检材进行扩增，各基因座都有扩增峰出现，且相互之间无干扰、无杂峰出现。
本发明提供的试剂盒的应用范围
1.亲权鉴定
(1)隔代亲缘鉴定(kinship testing)
对于一些隔代的亲缘鉴定，如父/母没有参加检测的缺失案(Deficiency paternity cases)，但有与父/母有亲缘关系的个体参与检测，像祖母-孙女、姐妹之间的特殊鉴定，X染色体遗传标记比常染色体更具有优势。对于没有双亲参与检测的姐妹鉴定，常染色体遗传标记不能排除亲缘关系，但X染色体遗传则可以鉴别是否为同一父亲所生。有关同父异母，叔侄、堂兄弟姊妹、表兄弟姊妹家系多个个体参与检测的案例均已有报道。
除非是被父-子关系所隔断，X染色体的遗传标记的分型在相隔几代的家系成员中仍可以追踪。在争议父不参与检测的案件中，争议父的母亲(即孩子祖母)的基因型对案件起重要作用，如果她参与检测则可以获得其所有基因分型信息；若其不参与检测，则可以通过其同胞或其所生的子女来推断基因型；如果有其所生的几个儿子参与检测，则能推断出祖母基因型的机会较高。
(2)三联体和二联体亲子鉴定
X染色体的遗传标记还可以用于亲权鉴定，但由于遗传方式有别于常染体，相关的法医学参数与常染色体遗传标记也有所不同。在等位基因频率分布相同的条件下，X染色体的遗传标记非父排除率要高于常染色体遗传标记。
(3)鉴别亲缘关系个体与真正生父
在有的案件中，争议父不参与检测，而与其有亲缘关系的个体顶替参与检验。对于这类案件，在一些情况下X染色体标记比常染色体标记更有应用价值。假设有两个争议父，如果他们是父子关系，则他们之间等位基因同源概率为0；如果是兄弟关系则等位基因同源概率为0.5，相当于常染色体标记正好有一个等位基因同源的概率。排除假父的概率比常染体标记要高。此外，在鉴别是父亲突变还是近亲个体顶替争议父，X染色体标记也很有用。
(4)突变的证实
常染色体STR的突变率可高达2/1000，在亲子鉴定中常会发生常染色体STR突变的情况，此时，鉴别是突变或无亲子关系就会成为难题。可以用X染色体STR辅助证实这类突变。
2.性别鉴定
在正常情况下，女性有两条X染色体，男性只有一条X染色体。因此，如果检测多个X染色体的STR，每个STR均只有一个等位基因，则可能是男性DNA；如果有基因座检出两个等位基因，则应该是女性。X染色体的STR可作为性别鉴定的辅助标记，尤其是在目前常用的Amelogenin基因座出现异常时，采用X-STR检验判断性别意义较大。
3.个体识别
X染色体遗传标记与常染色体一样，同样可以用于个体识别。本试剂盒针对降解DNA的X染色体minSTR复合扩增作了优化。对于X染色体遗传标记的基因分型结果，需要分别以男性和女性样本来评估证据力。
在法医学DNA分析实际检案中，经常碰到腐败生物检材，由于其中的DNA已降解而无法用常规STR方法检测出。通过缩短扩增片段，长度约在250个碱基对(bp)以下，称为miniSTR。miniSTR因其扩增的片段明显缩短，可以大大提高对腐败降解生物检材的DNA检出率，具有更高的灵敏。
                         SEQUENCE LISTING
<110>  浙江省公安物证鉴定中心
 <120>  Mini-X-STR和Amelogenin基因座荧光标记复合扩增试剂盒
<130>  无
<160>  26   
<170>  PatentIn version 3.5
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gtcttcctgt catctcccaa c                                                 21
<210>  18
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  18
gcagtaccca gctagcttag cg                                                22
<210>  19
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  19
cagagctggt gatgatagat ga                                                22
<210>  20
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  20
gctcactttt atgtgtgtat gtatctcc                                          28
<210>  21
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  21
gtatttggtt ttatttcttg cattc                                             25
<210>  22
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  22
gacttcaaac tgtactacaa ggcagtat                                          28
<210>  23
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  23
attttgtaag ttgattccac cc                                                22
<210>  24
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  24
gaagcaggtt tgaaacatta tttttta                                           27
<210>  25
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  25
cctgggctct gtaaagaata gt                                                22
<210>  26
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  26
gctggtggta ggaactgtaa aat                                               23
 
 

Claims (8)

1.Mini-X-STR和Amelogenin基因座荧光标记扩增试剂盒，其特征在于，包括有用于扩增如下13个基因座的引物：DXS7133、DXS8378、DXS981、DXS7424、DXS6789、DXS10159、GATA165B12、DXS101、DXS7423、GATA31E08、DXS10164、DXS10162、Amelogenin。
2.根据权利要求1所述的Mini-X-STR和Amelogenin基因座荧光标记扩增试剂盒，其特征在于：上述的试剂盒中的引物是在同一个扩增体系中进行复合扩增的。
3.根据权利要求2所述的Mini-X-STR和Amelogenin基因座荧光标记扩增试剂盒，其特征在于：所述的引物的序列如下所示：DXS7133，SEQ ID NO.1～2；DXS8378，SEQ ID NO. 3～4；DXS981，SEQ ID NO. 5～6；DXS7424，SEQ ID NO. 7～8；DXS6789，SEQ ID NO. 9～10；DXS10159，SEQ ID NO. 11～12；GATA165B12，SEQ ID NO. 13～14；DXS101，SEQ ID NO. 15～16；DXS7423，SEQ ID NO. 17～18；DATA31E08，SEQ ID NO. 19～20；DXS10164，SEQ ID NO. 21～22；DXS10162，SEQ ID NO. 23～24；Amelogenin，SEQ ID NO. 25～26。
4.根据权利要求2所述的Mini-X-STR和Amelogenin基因座荧光标记扩增试剂盒，其特征在于：扩增体系的组成如下所示：Buffer，11 μL；基因组DNA，0.1～10μl，DNA的含量为0.04～5ng；引物混合物，5.0 μL；sdH2O，补足至25.0μL；其中，所述的Buffer的组成是：MgCl2 7.5mM、Tris-HCl buffer 125mM、KCl 125mM、dNTPs 7.5m M、BSA 2mg/ml、Taq酶0.5μL，其余为水。
5.根据权利要求2所述的Mini-X-STR和Amelogenin基因座荧光标记扩增试剂盒，其特征在于：每个基因座对应的引物中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。
6.根据权利要求5所述的Mini-X-STR和Amelogenin基因座荧光标记扩增试剂盒，其特征在于：每个基因座对应的引物之间为分组标记的，分组是：DXS7133、DXS8378、DXS981为第一组；DXS7424、DXS6789、DXS10159为第二组；GATA165B12、DXS101、DXS7423为第三组；GATA31E08、DXS10164和DXS10162为第四组。
7.根据权利要求6所述的Mini-X-STR和Amelogenin基因座荧光标记扩增试剂盒，其特征在于：各组采用的荧光染料标记物选自6-FAM、HEX、TAMRA或ROX，且每组的标记色都不相同。
8.根据权利要求2所述的Mini-X-STR和Amelogenin基因座荧光标记扩增试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒的扩增程序如下：初始变性，95℃，2分钟；热循环，94℃ 5秒，60℃ 15秒，72℃ 10秒，共27～30个循环；终延伸，72℃，6分钟；保温，4℃。
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Title
吴微微: "《12个mini-X-STR和Amel基因座荧光标记复合扩增体系的初步研究》", 《刑事技术》 *

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