CN104059980B - 人x染色体dna19个基因座复合扩增试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

人X染色体DNA19个基因座复合扩增试剂盒及应用，该试剂盒可以同时检测19个X染色体基因座；本发明将19个基因座分为4组，共涉及5种颜色的荧光标记；采用本发明的试剂盒位点与目前国际通用试剂盒兼容又增加了在中国人群有较高研究基础的连锁群，有效应用于产前诊断、双亲缺失姐妹关系认定、父女关系认定、祖母与孙女关系认定及隔代认亲、人群迁移研究等方面；本发明的荧光标记复合扩增系统的灵敏度高，在DNA模板量为0.15ng的条件下，可检出全部19个基因座。

Description

人X染色体DNA19个基因座复合扩增试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及一种19个基因座的荧光标记复合扩增检验系统，具体涉及一种人X染色体DNA19个基因座复合扩增试剂盒及应用，该系统可应用于产前诊断、双亲缺失姐妹关系认定、父女关系认定、祖母与孙女关系认定、隔代认亲及人群迁移的研究。
背景技术
短串联重复序列基因座(STR)是目前普遍应用的遗传标记，是2-6个bp长的串联重复序列，其长度在几十到几百bp之间。这种串联重复形成的DNA序列可以产生数以亿计的基因型组合，而每一种组合在群体中出现的频率都非常低，STR分型是现今国内外法医个体识别和亲子鉴定最主要的技术。
在日常检案过程中，若遇到单个基因座不符合遗传规律的单亲案例，必须增加检测更多的STR基因座，以明确鉴定意见。普通三联体的亲子鉴定利用常染色体就能很好的解决，不需要增加性染色体遗传标记。然而在二联体的检测中，在母子、父女关系鉴定中，X-STR则比常染色体STR更加直观有效。尤其是父亲女儿的遗传关系鉴定中，可以很好的应用X染色体STR遗传标记。男性含有一条X染色体，X-STR以单倍型形式存在，其完全来源母亲且完全遗传给女儿。在母女遗传关系中，X染色体与常染色相同，不会发挥更多的作用。但在特殊案例中，比如，两人并非母女但常染色体并不能排除的情况下，加X染色体遗传标记有很好的排除作用。同样根据X染色体独特的遗传方式，X染色体STR在双亲缺失的姐妹关系认定，同父异母的姐妹关系认定，祖母-孙女的关系认定中起重要作用。X染色体STR由于其单个位点的位点平均排除率优于常染色体，在腐败降解检材检测中有一定作用，前面小片段的基因座能提供一定的信息。
X染色体全长155Mb，X染色体各基因座的物理距离和遗传距离已经有很详细的绘制，网站http://www.chrx-str.org/。X染色体分为四个连锁群，目前对于X染色体的研究也发现了大量的连锁的位点群组。检验多个X染色体的STR基因座时，需要考虑连锁的可能性,若存在连锁则要以单倍型来统计各种概率，不能简单地将各个基因座的概率相乘。如果一组数据中含有来自同一连锁群的多个基因座的信息，就需要将它们整合成一个单倍型进行分析。各个连锁群可认为是相互独立的，各个连锁群的数据可以运用乘积原理。
X染色体连锁群组单倍型在不同人种中不一样，可以反应不同种族间的联系和人口迁徙，吕德坚等人测试X染色体STR六个连锁群组单倍型分型共1522个样本，其中876个男性样本，646个女性样本，包括汉、维吾尔、哈萨克、蒙古族四个民族。测试结果显示X染色体STR基因座的等位基因频率分布有很强的人群特异性，六个连锁群组的单倍型多态性为亲缘关系的鉴定提供了强有力的工具，例如连锁群组DXS7132-DXS10079-DXS10074-DXS10075-DXS981中82％的单倍型只出现一次，而连锁群组DXS6801-DXS6809-DXS6789-DXS6799中94％的单倍型频率低于1％。
选择连锁位点不仅仅在于关于连锁位点单倍型可以反映人群区别，还有利于隔代的亲缘鉴定。X染色体由于长度为155Mb，整个染色体除了四个连锁群可以保证彼此不连锁以外其他再增加的任何位点都不能保证不连锁，最终结果的计算都是相当复杂，需要考虑连锁/不连锁、遗传距离等因素的影响。选择连锁位点可以不用计算，可以直接通过连锁位点的单倍型进行排除。尽可能多的选择不同组的连锁位点不仅仅是提高分辨率，且在判断为同胞或半同胞关系中具有重要意义。增加不同组的连锁位点的意义与Y染色体增加基因座的意义一样，可以提高分辨率，每组包含2个及以上位点才有实际意义。同时在实际应用过程中增加不同组的连锁位点在姐妹关系认定中判断为同父异母还是同父同母有非常重要的意义，可以避免由于连锁群少造成的错误排除。
X染色体以其独特的遗传方式，在法医学上有特殊的应用价值。过去十几年中大量的X-STR被研究，目前已有四十多个XSTR基因座的特征及遗传学信息。但是对X染色体STR基因座的研究远不如常染色体和Y染色体。
随着对X染色体STR研究的深入，X染色体STR作为常染色体的辅助手段，在双亲缺失姐妹关系认定、父女关系认定、祖母与孙女关系认定及隔代认亲、人群迁移方面研究将会发挥越来越大的作用。在连锁群中增加基因座可以提高连锁群作为单倍型在隔代亲缘鉴定上的作用，增加不同连锁群组来提高试剂盒整体的个体识别率。随着对X染色体STR研究的深入，连锁基因座的应用越来越受到专家学者的重视。
目前X染色体STR应用于法医的试剂盒较少，国外主要有Qiagen公司的ArgusX-8和ArgusX-12试剂盒。分别在四个连锁群里面选择了8个位点和12个位点。Qiagen的X染色体STR试剂盒整体的分辨能力较低，X-12相比较X-8增加了4个位点，但依然在四个连锁群中，在连锁群内增加位点相当于Y染色体上增加位点，可以提高其分辨率，但是由于位点的连锁性亲属间的区别能力不强，且不利于反推父母的X分型。
国内主要有浙江省公安厅刑侦总队与无锡中德美联生物技术有限公司研发的Mini-X-STR荧光检测试剂盒，及北京基点认知的X-17荧光检测试剂盒。Mini-X-STR包括为12个X染色体STR基因座，紧密连锁的两组DXS101-DXS7424与DXS10159-DXS10162-DXS10164和其他位于不同连锁群的7个基因座，在特殊亲子鉴定及亲缘认定中降解生物检材的检测中得到很好的应用。同一复扩体系包含紧密连锁与不连锁两种类型的基因座，在实际案件应用中，亲权指数等计算比较麻烦。北京基点认知虽然达到17个X-STR位点，但其选择的位点来自于不同的连锁群组，X染色体由于长度为155Mb，整个染色体除了四个连锁群可以保证彼此不连锁以外其他再增加的任何位点都不能保证不连锁，最终结果计算复杂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足提供一种人X染色体DNA19个基因座复合扩增试剂盒及应用，该系统可应用于产前诊断、双亲缺失姐妹关系认定、父女关系认定、祖母与孙女关系认定、隔代认亲及人群迁移的研究。
本发明选择6个连锁群组共19个STR基因座，在四个连锁群的基础上增加了群组DXS7424-DXS101和DXS6809-DXS6789，且在连锁群组2中增加了DXS10159-DXS10162-DXS10164-DXS10075。确定最终复扩体系包括DXS10135-DXS10148-DXS8378，DXS10159-DXS10162-DXS10164-DXS7132-DXS10074-DXS10075-DXS10079，DXS10103-HPRTB-DXS10101，DXS10134-DXS7423四个连锁群共15个基因座，加上紧密连锁的DXS6809-DXS6789和DXS7424-DXS101共19个基因座。19个基因座均来自于6个连锁群组中，且每个群组不少于两个基因座。既提高了试剂盒的整体分辨率，又利于实际案件中亲权指数的计算。
具体的技术方案：
人X染色体DNA19个基因座复合扩增试剂盒，包括有用于扩增如下19个基因座的引物：DXS8378、DXS7423、DXS10148、DXS10159、DXS6809、DXS7424、DXS10164、DXS10162、DXS7132、DXS10079、DXS6789、DXS101、DXS10103、DXS10101、HPRTB、DXS10075、DXS10074、DXS10135及DXS10134。
上述的引物及其在扩增体系中的优选浓度如表1所示：
表1引物序列及浓度
优选的，所述的每个基因座对应的引物中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。
优选的，将所述19个基因座分组，具体为：DXS8378，DXS7423，DXS10148，DXS10159，DXS6809为第一组；DXS7424，DXS10164，DXS10162，DXS7132，DXS10079，DXS6789为第二组；DXS101,DXS10103，DXS10101，HPRTB为第三组；DXS10075，DXS10074，DXS10135，DXS10134为第四组。
优选的，各组分别采用蓝色荧光染料6-FAM、绿色荧光染料HEX、黄色荧光染料TAMRA或红色荧光染料ROX进行标记，且每组之间相互不同。
优选的，每组内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。
优选的，所述的试剂盒的扩增体系由以下成分组成：Buffer，10.5μL；基因组DNA，0.1-10μL，含量为0.125-5ng；引物混合物，5.0μL，sdH2O，补足至25.0μL；所述的Buffer为MgCl27.5mM,Tris-HClbuffer125mM,KCl125mM,dNTPs7.5mM,BSA2mg/ml及taq酶0.5μL。
人X染色体DNA19个基因座复合扩增试剂盒在亲子鉴定、尸源认定、案件排查中的应用。
有益效果
(1)第一次实现同管扩增19个X染色体STR基因座。目前不管科研还是产品化的X染色体检测STR位点，没有同一复扩体系可以包含19个基因座。X染色体STR尤其是连锁群组中的基因座，序列同源性较强，特异性引物设计较难，本项目采用特殊的引物设计方法解决特异性扩增问题。
(2)本发明创造性的选择了6个连锁群组共19个STR基因座，在四个连锁群的基础上增加了群组DXS7424-DXS101和DXS6809-DXS6789，且在连锁群组2中增加了DXS10159-DXS10162-DXS10164-DXS10075。确定最终复扩体系包括DXS10135-DXS10148-DXS8378，DXS10159-DXS10162-DXS10164-DXS7132-DXS10074-DXS10075-DXS10079，DXS10103-HPRTB-DXS10101，DXS10134-DXS7423四个连锁群共15个基因座，加上紧密连锁的DXS6809-DXS6789和DXS7424-DXS101共19个基因座。19个基因座均来自于6个连锁群组中，且每个群组不少于两个基因座。既提高了试剂盒的整体分辨率，又利于实际案件中亲权指数的计算且数据分析简便。
(3)本发明采用样本免提取直接扩增的方法，通过mix的调配，利用PCR抗抑制剂，实现样本直接扩增，将检测时间缩短至2-4小时。
(4)本发明采用PCR成分预混的方法，除引物外，其他PCR成分进行预混生产，减少了配比PCR成分的时间，节省了检测人员时间。
(5)本发明试剂盒的灵敏度高，在DNA模板量为0.15ng的条件下，可检出全部19个基因座。
附图说明
图1为对标准品9947样品的STR分型结果图。
图2为等位基因分型标准物谱图。
图3为实施例2中姐妹关系认定中的遗传关系示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1基因座的确定、引物设计和试剂盒扩增参数的建立
选择的基因座主要考虑以下几个因素：1、多态性，选择的STR位点GD值在中国人群相对较高>0.6，2、选择不同连锁群内紧密连锁位点，位于同一连锁群内的基因座呈连锁遗传，可以用于单倍型观察多态性。3、选择突变率相对比较低的基因座，如DXS8377和DXS10011突变率3.7％及2.5％就不能选入。4、考虑引物设计因素，例如DXS10148模版序列，如下，在核心重复区前不远就有14个polyA的结构，因此引物不能跨过这个区域。引物只能在后面区域，比如AAAAGGGGGAAGGAAGGAAG。引物包含GGAA的3个重复，足以与核心重复区TTCC的基因座匹配产生非特异，比如DXS10146，这种情况下不能选择包含TTCC
的基因座。DXS10148序列：
AAAAAAAAAAAAAAGGGGGAAGGAAGGAAGGAAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAAGAAAGAAAGAAAGAAGGAAAGAAGGAAGGAAAGAAGGAAAGAAGGAAAGAAGGAAAGGGAAAGGAAAGGAAAAAGAAACACCACTGCCAAAACCAGCAAAAGATTAAAGGAAGCAAACATCCTCATTCTACTATTTCCCCTCTTATGCAGGAGAAATAGCCTGAGTTGCACATATTAACCCATATTGTCTTTTTTTTCTTTCCAAATTTTT
本课题选择6个连锁群组共19个STR基因座，在四个连锁群的基础上增加了群组DXS7424-DXS101和DXS6809-DXS6789，且在连锁群组2中增加了DXS10159-DXS10162-DXS10164-DXS10075。确定最终复扩体系包括DXS10135-DXS10148-DXS8378，DXS10159-DXS10162-DXS10164-DXS7132-DXS10074-DXS10075-DXS10079，DXS10103-HPRTB-DXS10101，DXS10134-DXS7423四个连锁群共15个基因座，加上紧密连锁的DXS6809-DXS6789和DXS7424-DXS101共19个基因座。19个基因座均来自于6个连锁群组中，且每个群组不少于两个基因座。
在设计引物的过程中，随着复合扩增体系中基因座数目的增加，由于竞争的影响，各基因座相对平衡控制难度加大。
引物末端外挂碱基提高Tm值：如上述DXS10148引物为了保证其特异性不能跨核心重复区，最终引物为AAAAGGGGGAAGGAAGGAAG，但是在实际的试验过程中发现这条引物的扩增效率较低，通过寻找原因后发现，这是由于虽然oligo6评价有69.4℃，但在实际扩增中耐受不了62℃，因而会影响整个复扩体系的温度容忍性。为了解决这一问题，通过在引物末端加g/c碱基，提高Tm值，即DXS101485’端加gctg-AAAAGGGGGAAGGAAGGAAG可以做到62℃扩增无丢失，修饰中提高tm值有很多方法，比如MGB，LNA，PNA修饰，但是价格较高，生产不稳定，在法医试剂盒中较难实现，而采用碱基修饰的方法比较简单。
引物末端外挂碱基改变迁移率：在引物设计中，碰到引物在复扩体系中扩增无非特异，温度容忍性较好，但出现越界情况。比如DXS6809上游引物AGGAATACTGAGGGCATGACTAGATTA，下游引物GGTTCTGTTAATCTTGGACTGGA经测试完成符合复扩要求，且测试多对引物，这对引物最合适，但是在实际扩增过程中，发现该扩增子偏小，其前面一个的基因座DXS10159出现越界，两个基因座的panel出现重叠现象。因此通过引物外挂高AT的碱基片段，来改变扩增产物的迁移率。如DXS6809引物外挂aataaatcataa。最终引物为上游引物为aataaatcataaAGGAATACTGAGGGCATGACTAGATTA，下游引物为aataaatcataaGGTTCTGTTAATCTTGGACTGGA，从而使扩增子延长了24bp，解决了越界问题。
经过引物设计，先对19个基因座中的单个基因座引物进行反复调整测试，退火温度特异性达到标准后，研究19个基因座复合扩增PCR反应条件，通过大量的反复实验确定了复合扩增中的各个参数，如，循环参数、退火温度、缓冲液离子强度、酶量、复合扩增反应体积的变化以及模板DNA量等，使扩增产物达到平衡、特异的要求，建立起复合扩增体系，同时扩增出19个基因座。优选的各个基因座对应的引物序列及引物在扩增体系中的终浓度如表1所示。
本研究对荧光染料进行了鉴别、遴选，选用了蓝、绿、黄、红、橙五种荧光标记物，优选了5色荧光组合方案。在确定5色荧光组合方案的基础上，通过大量反复实验，设计出基因座组合方式以及荧光标记类型。从生产成本及各基因座引物扩增效率等方面考虑，将19个基因座分成四组，使用6-FAM、HEX、TAMRA、ROX分组标记，分子量内标用第五色荧光染料SIZ标记。以下举例说明其中一种优选组合和标记方式：DXS8378，DXS7423，DXS10148，DXS10159，DXS6809为第一组，该组基因座对应的引物的荧光标记物为6-FAM；DXS7424，DXS10164，DXS10162，DXS7132，DXS10079，DXS6789为第二组，采用绿色荧光染料标记，荧光标记物为HEX；DXS101,DXS10103，DXS10101，HPRTB为第三组，采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA；DXS10075，DXS10074，DXS10135，DXS10134为第四组，采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。这种基因座组合方式使得仅需标记五种荧光就可实现这19个基因座的同时检测分析。
扩增试剂盒中的组成如表2所示：
表2扩增试剂盒组成
组分 体积
Buffer 10.5μL
基因组DNA 0.1-10μl含量为0.125-5ng
权利要求1所述的引物 5.0μL
sdH2O 补足至25.0μL
其中所述的buffer为MgCl27.5mM,Tris-HClbuffer125mM,KCl125mM,dNTPs7.5mM,BSA2mg/ml及taq酶0.5μL。
扩增及检测分型的步骤是：
(l)将PCR扩增管置于热循环仪上；
(2)选择表3的扩增程序进行扩增；
(3)扩增后的样品应避光保存；
热循环仪的扩增程序
表3扩增程序
(4)扩增产物在遗传分析仪上荧光检测：由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCUMarkerSIZ-500组成上样混合物〔(0.5μlAGCUMarkerSIZ-500)×(进样数)+(12μl去离子甲酰胺)×(进样数)〕；将12.5μl上样混合物与1μl扩增产物或系统中等位基因分析标准物AllelicLadder混合，避免产生气泡；95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析；
(5)分型分析：用片段分析软件GeneMapper分析步骤C中遗传分析仪检测收集的数据。电泳采用多道或单道毛细管电泳。其中基因组DNA样品来源于唾液斑、组织、血痕或血液。
对9947标准品进行样本扩增的分型结果如图1所示，从图中可以看出，各个基因座都有良好的扩增峰出现，与其基因型一致，且无非特异扩增峰出现。如图2，对等位基因分型标准物的扩增的分型结果可以看出，本试剂盒对于各个基因座的等位基因都能够做到准确的分型，各个等位基因之间可以很好区分，且没有非特异性扩增峰出现。
表4为图1和图2中的等位基因信息，具体如下：
表4等位基因信息
实施例2应用19个基因座的荧光标记复合扩增检验系统进行姐妹关系认定
如图3，连锁的X基因座在复杂的亲子鉴定中有独特的优势，如姐妹关系认定。B某与A某可能为同父异母的姐妹，其生物学父亲M已经死亡，M1和M2为M的同胞兄弟，M3为M的姐姐。
1、收集鉴定案件中的血样：本实验中样品由XX亲子鉴定机构提供。DNA提取采用Chelex-100法分别提取2个全血样本的基因组DNA：取0.5～5μl全血置于灭菌的1.5ml离心管中，加入sdH2O1ml于管中，振荡数秒；置于室温10分钟后，振荡数秒，12,000rpm离心3分钟，弃上清液，保留足够上清液盖没沉淀，勿搅起沉淀；加入200μl5％的Chelex-100，振荡数秒；于56℃保温30分钟，振荡数秒；沸水浴10分钟，振荡数秒；12,000rpm离心5分钟，上清为提取得到的基因组DNA。基因组DNA的提取参考《GA/T383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行。也可以直接以血样检测，通过1.2mm孔径血滤纸片或FTA卡血样片实行。
2、扩增检测
按照实施例1进行PCR扩增、遗传分析仪检测并最终获得分型结果。
3、结论
结果显示见表5，从结果显示A与BX染色体基因座分型复合遗传规律，不排除为同父异母的姐妹关系。从M1,M2和M3的X染色体基因座分型可以反推A父亲M的分型，以DXS8378-10148-10135为例，M1为10-29-29，M2为10-27.1-23，所以M只可能为10-27.1/29-23/29，而A，B为10-29-29符合遗传规律。依次类推，每个连锁群的单倍型均符合遗传规律。
表5检测结果
注：下划线为符合遗传规律的基因座。
单亲亲子鉴定在亲子鉴定中具有一种特殊性，由于亲代中某一方不能够提供相关遗传信息，其亲权概率也必然较低，因此，为保证亲权鉴定的准确性，往往需要检测更多的基因座。在二联体亲子鉴定中，相对亲权概率(RCP)大于99.975％时，认定存在亲缘关系；出现3个或3个以上STR基因座违反遗传规律时，就可以达到排除标准而排除亲缘关系。在父女的亲子鉴定中加做X很有必要，而本案例为更加复杂亲缘鉴定案例，可以更好的发挥X染色体连锁基因座作为单倍型在亲缘鉴定上的优势。
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<212>DNA
<213>人工序列
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ccctccttaggcaaccc17
<210>2
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
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<211>17
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<213>人工序列
<400>3
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>25
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<213>人工序列
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
tgcactccaacctggatgacat22
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
aataaatcataaggttctgttaatcttggactgga35
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<211>18
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<213>人工序列
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<211>18
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<211>22
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ggagatctaagaagttatttgatgtcc27
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<213>人工序列
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<213>人工序列
<400>33
tcctactgccccaccttta19
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<213>人工序列
<400>34
tatggtctcagtgcccctc19
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<213>人工序列
<400>35
ggagtgataagaatgatgg19
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<213>人工序列
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aatatgtgtagtggacgtg19
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<213>人工序列
<400>37
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<210>38
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
gatggacatttgggttg17

Claims (8)

1.人X染色体DNA19个基因座复合扩增试剂盒，其特征在于，包括有用于扩增如下19个基因座的引物，所述基因座分别为DXS8378、DXS7423、DXS10148、DXS10159、DXS6809、DXS7424、DXS10164、DXS10162、DXS7132、DXS10079、DXS6789、DXS101、DXS10103、DXS10101、HPRTB、DXS10075、DXS10074、DXS10135及DXS10134，所述的引物的序列是：DXS8378的引物序列为SEQIDNO.1-2；DXS7423的引物序列为SEQIDNO.3-4；DXS10148的引物序列为SEQIDNO.5-6；DXS10159的引物序列为SEQIDNO.7-8；DXS6809的引物序列为SEQIDNO.9-10；DXS7424的引物序列为SEQIDNO.11-12；DXS10164的引物序列为SEQIDNO.13-14；DXS10162的引物序列为SEQIDNO.15-16；DXS7132的引物序列为SEQIDNO.17-18；DXS10079的引物序列为SEQIDNO.19-20；DXS6789的引物序列为SEQIDNO.21-22；DXS101的引物序列为SEQIDNO.23-24；DXS10103的引物序列为SEQIDNO.25-26；DXS10101的引物序列为SEQIDNO.27-28；HPRTB的引物序列为SEQIDNO.29-30；DXS10075的引物序列为SEQIDNO.31-32；DXS10074的引物序列为SEQIDNO.33-34；DXS10135的引物序列为SEQIDNO.35-36；DXS10134的引物序列为SEQIDNO.37-38。
2.根据权利要求1所述的人X染色体DNA19个基因座复合扩增试剂盒，其特征在于，所述的引物在扩增体系中的终浓度是：SEQIDNO.1-2，0.10μM；SEQIDNO.3-4，0.25μM；SEQIDNO.5-6，0.60μM；SEQIDNO.7-8，0.30μM；SEQIDNO.9-10，0.25μM；SEQIDNO.11-12，0.50μM；SEQIDNO.13-14，0.35μM；SEQIDNO.15-16，0.50μM；SEQIDNO.17-18，0.30μM；SEQIDNO.19-20，0.25μM；SEQIDNO.21-22，0.40μM；SEQIDNO.23-24，0.95μM；SEQIDNO.25-26，1.00μM；SEQIDNO.27-28，0.75μM；SEQIDNO.29-30，0.40μM；SEQIDNO.31-32，2.00μM；SEQIDNO.33-34，2.50μM；SEQIDNO.35-36，1.75μM；SEQIDNO.37-38，2.35μM。
3.根据权利要求1所述的人X染色体DNA19个基因座复合扩增试剂盒，其特征在于：所述的每个基因座对应的引物中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。
4.根据权利要求3所述的人X染色体DNA19个基因座复合扩增试剂盒，其特征在于：将所述19个基因座分组，具体为：DXS8378，DXS7423，DXS10148，DXS10159，DXS6809为第一组；DXS7424，DXS10164，DXS10162，DXS7132，DXS10079，DXS6789为第二组；DXS101,DXS10103，DXS10101，HPRTB为第三组；DXS10075，DXS10074，DXS10135，DXS10134为第四组。
5.根据权利要求4所述的人X染色体DNA19个基因座复合扩增试剂盒，其特征在于：各组分别采用蓝色荧光染料6-FAM、绿色荧光染料HEX、黄色荧光染料TAMRA或红色荧光染料ROX进行标记，且每组之间相互不同。
6.根据权利要求1所述的人X染色体DNA19个基因座复合扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的扩增体系为：Buffer，10.5μL；基因组DNA，0.1-10μL，含量为0.125-5ng；引物混合物，5.0μL，sdH2O，补足至25.0μL；所述Buffer的组成为MgCl27.5mM,Tris-HClbuffer125mM，KCl125mM,dNTPs7.5mM，BSA2mg/mL及taq酶0.5μL。
7.根据权利要求1所述的人X染色体DNA19个基因座复合扩增试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒的扩增程序是：初始变性：95℃，2分钟；热循环：94℃30秒，60℃90秒，65℃90秒，共进行30个循环；终延伸：72℃，20分钟；保温：4℃。
8.权利要求1所述的人X染色体DNA19个基因座复合扩增试剂盒在亲子鉴定中的应用。
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