CN101773600B - 补气养血,调经止带的中药组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种补气养血，调经止带的中药组合物及其质量控制方法，该组合物由鳖甲(制)12.8重量份、牡蛎(煅)9.6重量份、桑螵蛸9.6重量份、人参25.6重量份、黄芪6.4重量份、当归28.8重量份、白芍25.6重量份、香附(醋制)25.6重量份、天冬12.8重量份、甘草6.4重量份、地黄51.2重量份、熟地黄51.2重量份、川芎12.8重量份、银柴胡5.2重量、丹参25.6重量份、山药25.6重量份、芡实(炒)12.8重量份、等原料药制成，本发明组合物具有很好的补气养血，调经止带的功效；本发明质量控制方法专属性好、稳定性高、重现性好更加适合工业化的生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药组合物及质量控制方法，特别涉及一种补气养血，调经止带的中药组合物制剂质量控制方法。
背景技术
乌鸡，又称乌骨鸡、药鸡、绒毛鸡，乌鸡的历史源远流长，据文字记载可追溯至唐朝作为御膳和入药用。乌鸡滋阴补虚、调经止带、养气补血的独特功效，尤其合适作为女性四季皆宜的补身极品、还可作为内服美容品和妇科圣药，兼具抗病、抗癌功效。曾在我国流传“清补胜甲鱼，养伤赛白鸽，养颜如珍珠”之美誉。
由乌鸡等中药制备而成的中药组合制剂可以治疗女性气血两虚，月经不调等疾病，效果极佳。
发明内容
本发明目的在于提供一种补气养血，调经止带中药组合物；本发明第二个目的在于提供一种补气养血，调经止带的中药组合物的制备方法；本发明的第三个目的在于提供该中药组合物制剂的质量控制方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
本发明公开一种补气养血，调经止带的中药组合物，该组合物的原料组成为：
乌鸡64-192重量份、鹿角胶12.8-38.4重量份、鳖甲6.4-19.2重量份、牡蛎4.8-14.4重量份、桑螵蛸4.8-14.4重量份、人参12.8-38.4重量份、黄芪3.2-9.6重量份、当归14.4-43.2重量份、白芍12.8-38.4重量份、香附12.8-38.4重量份、天冬6.4-19.2重量份、甘草3.2-9.6重量份、地黄25.6-76.8重量份、熟地黄25.6-76.8重量份、川芎6.4-19.2重量份、银柴胡2.6-7.8重量、丹参12.8-38.4重量份、山药12.8-38.4重量份、芡实6.4-19.2重量份、鹿角霜4.8-14.4重量份。
所述一种补气养血、调经止带的中药组合物的原料组成优选为：
乌鸡(去毛爪肠)128重量份、鹿角胶25.6重量份、鳖甲(制)12.8重量份、牡蛎(煅)9.6重量份、桑螵蛸9.6重量份、人参25.6重量份、黄芪6.4重量份、当归28.8重量份、白芍25.6重量份、香附(醋制)25.6重量份、天冬12.8重量份、甘草6.4重量份、地黄51.2重量份、熟地黄51.2重量份、川芎12.8重量份、银柴胡5.2重量、丹参25.6重量份、山药25.6重量份、芡实(炒)12.8重量份、鹿角霜9.6重量份。
本发明所述一种补气养血，调经止带的中药组合物制剂的制备方法为：
熟地黄、地黄、川芎、鹿角霜、银柴胡、芡实、山药、丹参八味粉碎成粗粉，其余乌鸡等十二味，分别酌予碎断，置罐中，另加黄酒150-450g，加盖封闭，隔水炖至酒尽，取出，与上述粗粉掺匀，低温干燥，再粉碎成细粉，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的剂型，包括但不限于丸剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、片剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、口服液体制剂或外用制剂。
上述补气养血、调经止带的中药组合物丸剂的制备方法优选为：
以上二十味，熟地黄、地黄、川芎、鹿角霜、银柴胡、芡实、山药、丹参八味粉碎成粗粉，其余乌鸡等十二味，分别酌予碎断，置罐中，另加黄酒300g，加盖封闭，隔水炖至酒尽，取出，与上述粗粉掺匀，低温干燥，再粉碎成细粉，过筛，混匀。每100g粉末加炼蜜30～40g与适量的水，泛丸，干燥，制成水蜜丸，即得。
本发明提供一种该中药组合物胶囊剂的制备方法：
熟地黄、地黄、川芎、鹿角霜、银柴胡、芡实、山药、丹参八味粉碎成粗粉，其余乌鸡等十二味，分别酌予碎断，置罐中，另加黄酒300g，加盖封闭，隔水炖至酒尽，取出，与上述粗粉掺匀，低温干燥，再粉碎成细粉，过筛，混匀，加入辅料，其中药粉∶淀粉∶碳酸钙∶硬脂酸镁的比例为10∶2.85∶1.1∶0.15，混匀，填充胶囊，即得。
本发明所述的补气养血，调经止带的中药组合物制剂的质量控制方法包括如下步骤：
鉴别：
A、取中药组合物制剂5-20g，研碎，加硅藻土5-40g，研匀。加无水乙醇、甲醇、水中的一种溶剂或一种以上的混合溶剂40-200ml，超声处理15-45分钟，滤过，滤液浓缩至0.5-4.0ml，作为供试品溶液。另取当归对照药材，加无水乙醇、甲醇、水中的一种溶剂或一种以上的混合溶剂5-40ml，振摇提取2小时，取上清液作为对照药材溶液。吸取上述两种溶液各1～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以(2-20∶1)比例的正己烷-醋酸乙酯混合溶剂为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的亮蓝色斑点。
B、取中药组合物制剂5-20g，研碎，加硅藻土5-40g，研匀。加氯仿、醋酸乙酯中的一种溶剂或一种以上的混合溶剂40-200ml，加热回流0.5-3小时，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇0.5-3ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。另取丹参酮IIA对照品，加乙醇制成每1ml含0.1-2mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各2-15μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以(5-50∶1)苯-醋酸乙 酯为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗红色斑点。
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以5-85∶95-15比例的甲醇-水为流动相；检测波长为210-250nm；对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含10-100μg的溶液，即得；供试品溶液的制备：取水蜜丸，研细，精密称取1-10g；精密加入10-90％乙醇5-50ml，称重，时时振摇，放置0-48小时，超声处理15-60分钟，放冷，称重，加10-90％乙醇补足重量，滤过，精密量取续滤液1-10ml，通过大孔吸附树脂柱，内径0.5-3cm，长5-30cm，用10-90％乙醇20-200ml洗脱，收集洗脱液，置蒸发皿中蒸干，残渣用水2-10ml分次使溶解，转移至5-50ml量瓶中，容器用甲醇适量多次洗涤，洗液并入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2-20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
上述质量控制方法中优选包括如下方法：
鉴别：
A、取中药组合物制剂12g，研碎，加硅藻土12g，研匀。加无水乙醇100ml，超声处理0.5小时，滤过，滤液浓缩至1.5ml，作为供试品溶液。另取当归对照药材，加乙醇20ml，振摇提取2小时，取上清液作为对照药材溶液。吸取上述两种溶液各3～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的亮蓝色斑点。
B、取中药组合物制剂12g，研碎，加硅藻土12g，研匀。加氯仿100ml，加热回流1.5小时，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1.5ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。另取丹参酮IIA对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法的试验，吸取上述两种溶液各6μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯(19∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗红色斑点。
含量测定：色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水(33∶67)为流动相；检测波长为230nm；对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得；供试品溶液的制备：取水蜜丸，研细，精密称取5g。精密加入30％乙醇25ml，称重，时时振摇，放置24小时，超声处理 30分钟，放冷，称重，加30％乙醇补足重量，滤过，精密量取续滤液5ml，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，用30％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，置蒸发皿中蒸干，残渣用水5ml分次使溶解，转移至25ml量瓶中，容器用甲醇适量多次洗涤，洗液并入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明一种补气养血，调经止带的中药组合物制剂薄层色谱方法检测专属性好、稳定性高、重现性好更加适合工业化的生产，真正确保了临床用药的安全、有效、可靠。
下面实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
本发明所有实验例所选用的制剂均为根据本发明实施例1制得的本发明丸剂，但是本发明实验结果并不仅限于该丸剂。
实验例1：药效学实验
一、中药组合物制剂对小鼠常压耐缺氧实验
实验方法：小鼠45只，按体重随机分成空白组、低剂量组、高剂量组。各组动物适应环境3天后开始给与相应的生理盐水和药物共7天。第7天，所有小鼠在给药后1小时，将其放入盛有钠石灰的广口瓶内(每瓶只放1只鼠)，用凡士林涂抹瓶口盖严，使之不漏气，立即计时，以呼吸停止为止，结果见表1。
表1本发明中药组合物制剂对小鼠常压耐缺氧的影响(X±s)
与空白组比较，**＜0.01，*P＜0.05。
从上表可看出，低、高剂量均能延长小鼠常压耐缺氧时间，与空白组比差异有显著性。
二、本发明中药组合物制剂对对小鼠游泳时间的影响
实验方法：小鼠45只，按体重随机分为空白组、中药组合物制剂低剂量、中药组合物制剂高剂量共5组。各组动物适应环境3天后开始给与相应的生理盐水和药物共7天。第7天，所有小鼠在给药后1小时，在其尾部绑上铅丝(重量按小鼠当日体重的8％计算)，分别放入水箱内游泳，并开始计时，直至小鼠沉入水底死亡为止，结果见表2。
表2本发明中药组合物制剂对小鼠负重游泳时间的影响(X±s)
与空白组比较，**P＜0.01，*P＜0.05。
从上表可看出，低、高剂量均能延长小鼠负重游泳时间，与空白组比差异有极显著性。
三、本发明中药组合物制剂对化学刺激法引起的扭体实验
实验方法：小鼠40只，按体重随机分为空白组、杜冷丁阳性药组、中药组合物制剂低剂量组、中药组合物制剂高剂量组。各组动物适应环境3天后开始与相应的生理盐水和药物共7天。第7天，杜冷丁组提前半小时腹腔注射杜冷丁，每只0.2mL；接着各组动物依次灌服相应的生理盐水和药物，每鼠在灌胃后半小时腹腔注射醋酸，每只0.5mL。从注射开始到小鼠出现第一次扭体反应的时间为潜伏期，从注射时间开始共观察10分钟，记录小鼠扭体次数，结果见表3。
表3本发明中药组合物制剂对小鼠的镇痛作用(X±s)
与空白组比较，**P＜0.01，*P＜0.05
从上表可看出，杜冷丁组、中药组合物制剂低剂量组对小鼠有显著性的镇痛作用，但高剂量组的统计学意义不明显。
四、本发明中药组合物制剂对剪尾法测小鼠出血时间及玻片法测凝血时间的影响
实验方法：小鼠45只，按体重随机分成空白、中药组合物制剂低剂量组、中药组合物制剂高剂量组。各组动物适应环境3天后开始给与相应的生理盐水和药物共7天。最后一次给药后1小时，用眼科剪剪去小鼠尾巴约2cm并开始计时至出血自然止住结束，此时间即为出血时间，期间每15秒用脱脂棉球轻轻吸去血液。凝血时间测定则是滴小鼠断尾后第一滴血在玻片上，凝血时间测定则是滴小鼠断尾后第一滴血一玻片上，血滴直径约 5mm，立即计时。第隔30秒用清洁大头针自血滴边缘向里轻轻挑动一次，看有无血丝挑起。从采血开始至挑起血丝的时间即为凝血时间，结果见表4。
表4中药组合物制剂对小鼠出、凝血时间的影响(X±s)
与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
从上表可看出，中药组合物制剂能明显缩短小鼠的出、凝血时间。
以上的实验结果表明，中药组合物制剂能延长小鼠负重游泳时间，缩短小鼠的出血、凝血时间，并有一定的镇痛作用。从而进一步论证了中药组合物制剂补气养血，调经止带的功效。
五、本发明中药组合物制剂对抗5-Fu化疗骨髓抑制的实验研究
1、实验方法：
分组：根据全国抗癌药物筛选规程，无菌条件下抽取9天生长良好的腹水为瘤源，按1∶3比例用生理盐水稀释，每鼠0.2ml于右侧腋窝下皮下接种，24小时后随机分成荷瘤对照组、5-Fu组、5-Fu加中药组合物制剂高剂量组、5-Fu加中药组合物制剂低剂量组。
给药方法：荷瘤对照组用生理盐水灌胃，每日1次，每次0.2ml，连续10天。5-Fu组腹腔注射5-Fu110mg/kg，于瘤细胞接种后第1、第5天各注射1次，同时用生理盐水灌胃，每次0.2ml，连续10天。本发明中药组合物制剂水分散制成每ml含生药1.2g、4.8g。5-Fu加中药组合物制剂高、低剂量组的化疗药物剂量、给药途径及时间与5-Fu组相同，本发明中药组合物制剂剂量为0.1ml/10g，每日灌胃1次，连续10天。于实验第12天取荷瘤对照组、5-Fu组，5-Fu加中药组合物制剂高剂量组、5-Fu加中药组合物制剂低剂量组各10只小鼠，剪头采血处死，检测血常规，并骨髓取材测各项指标。
2、观察指标
血象指标：白细胞总数(WBC)，血细胞自动分析仪检测。
骨髓有核细胞计数(BMC)：显微镜下采用WBC计数的方法进行骨髓有核细胞计数。
骨髓象指标：造血细胞计数等，采用病理组织切片、HE梁色；造血细胞NF-κB、Caspase3的表达，采用免疫组织化学的方法染色；以上3项在Mias-2000图形分析系统下定 量观察。实验结果采用SPSS10.0统计分析软件，以及多个样本均数两两比较法(q检验)。
3、实验结果
3.1对外周血象及骨髓有核细胞计数的影响，结果见表5。
表5各组小鼠血常规(X±s)
注：*P＜0.05，**P＜0.01，与荷瘤对照组相比：○P＜0.05，○○P＜0.01，与5-Fu组相比：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，与5-Fu+中药高剂量组相比：
由表5可以看出，本发明中药组合物制剂对造血功能有一定的保护作用。在大剂量化疗药物的抑制下，单纯化疗组及中药高、低剂量组的WBC、BMC与对照组比较均有明显减少，P＜0.01或P＜0.05；但各中药治疗组的减少程度不及单纯化疗组，尤其是中药高剂量组与单纯化疗组对WBC、BMC的保护有显著性差异，P＜0.05。中药组合物制剂高剂量组BMC明显高于低剂量组，P＜0.05，说明中药组合物制剂对化疗后H22肝癌小鼠BMC数量的恢复有明显的促进作用，且有一定的量效关系。
3.2对骨髓造血细胞量HE染色的影响，结果见表6。
表6各组小鼠骨髓HE染色骨髓造血细胞面积总和(X±s)、积分光密度值(X±s)
注：*P＜0.05，**P＜0.01，与荷瘤对照组相比；○P＜0.05，○○P＜0.01，与5-Fu组相比；△P＜0.05，△△P＜0.01，与5-Fu+中药低剂量组相比。
由表6可以看出，单纯化疗组小鼠骨髓造血细胞面积总和、积分光密度值均明显下降，与对照组比较，P＜0.01；各中药治疗组骨髓造血细胞面积总和、积分光密度值虽明显少于正常组，但明显高于单纯化疗组，P＜0.01或P＜0.05；尤以高剂量组骨髓造血细胞面积、积分 光密度明显优于低剂量组，P＜0.01，说明中药组合物制剂在促进化疗所致骨髓造血细胞增殖方面有一定的量效关系。
3.3对骨髓造血细胞NF-κB染色的影响，结果见表7。
表7各组小鼠骨髓造血细胞NF-κB面积总和(X±s)、积分光密度值(X±s)
注：*P＜0.05，**P＜0.01，与荷瘤对照组相比；○P＜0.05，○○P＜0.01，与5-Fu组相比；△P＜0.05，△△P＜0.01，与5-Fu+中药低剂量组相比。
荷瘤对照组小鼠骨髓造血细胞NF-κB主要表达在细胞浆中，而各化疗组小鼠骨髓造血细胞NF-κB均表达在细胞核中，说明在化疗药物作为应激原的刺激下NF-κB活化，导致其进入细胞核。由表3可以看出，单纯化疗组小鼠骨髓造血细胞NF-κB面积总和、积分光密度明显低于中药高、低剂量组，P＜0.01；而中药高剂量组又明显高于中药低剂量组，P＜0.05，说明中药组合物制剂在促进化疗所致骨髓造血细胞NF-κB的表达方面有一定的量效关系。
3.4对骨髓造血细胞Caspase-3染色的影响，结果见表8。
表8各组小鼠骨髓Caspase-3表达面积总和(±s)、积分光密度值(±s)
注：*P＜0.05，**P＜0.01，与荷瘤对照组相比；○P＜0.05，○○P＜0.01，与5-Fu组相比；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，与5-Fu+中药高剂量组相比。
由表8看出，单纯化疗组、中药高、低剂量组小鼠骨髓Caspase-3表达面积总和、积分光密度值较正常组均有所升高，尤以单纯化疗组、中药低剂量组升高较为显著，P＜0.01；而单纯化疗组又明显高于中药高剂量组，P＜0.05。
本实验结果表明，中药组合物制剂可保护骨髓造血功能，可增加WBC数及BMC计数；增加化疗后H22小鼠骨髓造血细胞核转录因子NF-κB的表达；降低化疗后H22小鼠骨髓造血细胞Caspase-3的表达。NF-κB是一类关键性核转录因子，参与造血生长因子如IL26、GM2CSF、CAM转录的调控，与细胞存活以及凋亡密切相关，具有十分重要的功能。
实验例2：当归薄层色谱法实验
本发明中，在含量测定项下利用HPLC测定制剂中白芍药材的特征成分芍药苷的含量，间接的鉴别了芍药苷的存在，也就验证了白芍药材的存在，因此再增加这味药材的薄层鉴别，不仅对保证制剂质量意义不大，还会增加操作的繁琐程度。下述实验中所述中药组合物制剂为本发明实施例1制备的制剂。
1、供试品的前处理
此中药组合物制剂为二十味药材粉碎后加入炼蜜制成的蜜丸。制剂中含有大量蜂蜜，黏性较大，很难分散，提取时溶剂不易进入制剂内部，会造成提取不完全。硅藻土为固体粉末，没有黏性，流动性好，可以吸收蜂蜜，使蜜丸容易分散，而且硅藻土对化合物没有吸附作用，使用溶剂提取时不会造成化学成分的损失。本发明利用硅藻土将蜜丸分散后，再使用合适溶剂提取相应的化学成分。通过试验验证使用硅藻土分散蜜丸的必要性。
方法一、直接提取：取中药组合物制剂12g，用剪刀剪碎，加无水乙醇100ml，超声处理0.5小时，滤过，滤液浓缩至1.5ml，作为供试品溶液1。
方法二、使用硅藻土分散：取中药组合物制剂12g，研碎，加硅藻土12g，研匀。加无水乙醇100ml，超声处理0.5小时，滤过，滤液浓缩至1.5ml，作为供试品溶液2。
取当归对照药材，加乙醇20ml，振摇提取2小时，取上清液作为对照药材溶液。
吸取上述三种溶液各3～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯(365nm)下检视。
供试品溶液2色谱中在当归对照药材相对应的位置上均显明显的相同亮蓝色的斑点，而供试品1色谱中在当归对照药材相对应的位置上斑点颜色不明显，说明未加硅藻土分散的样品很难提取。因此选择将本发明中药组合物制剂用硅藻土分散后再提取。
2、供试品溶液提取方法的选择
当归中成分为低极性成分，有一定的挥发性，因此本实验对提取中药组合物制剂中当归成分的提取方法进行了考察，优选出最优的提取方法。
方法一、超声提取：取中药组合物制剂12g，研碎，加硅藻土12g，研匀。加无水乙 醇100ml，超声处理0.5小时，滤过，滤液浓缩至1.5ml，作为供试品溶液1；
方法二、振摇提取：取中药组合物制剂12g，研碎，加硅藻土12g，研匀。加无水乙醇100ml，振摇提取2小时，滤过，滤液浓缩至1.5ml，作为供试品溶液2；
方法三、回流提取：取中药组合物制剂12g，研碎，加硅藻土12g，研匀。加无水乙醇100ml，回流处理0.5小时，滤过，滤液浓缩至1.5ml，作为供试品溶液3；
取当归对照药材，加乙醇20ml，振摇提取2小时，取上清液作为对照药材溶液。
吸取上述四种溶液各3～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯(365nm)下检视。
供试品1、2、3在当归对照药材相对应的位置上均显相同颜色的斑点，供试品2色谱中较供试品1、3色谱中的斑点更清晰、明显。当归中成分有一定的挥发性，所以不加热的提取方式更适于提取药组合物制剂中当归成分。中药组合物制剂剂型为蜜丸，虽经硅藻土分散，但仅靠被动渗透提取不完全，超声波提取当归成分提取效率高、操作简单，本实验选择超声波提取法提取中药组合物制剂中的当归化学成分。
3、提取溶剂的选择
分别取中药组合物制剂12g，研碎，加硅藻土12g，研匀，分别加正己烷、醋酸乙酯、无水乙醇、乙醇100ml，超声处理0.5小时，滤过，滤液浓缩至1.5ml，作为供试品溶液1、2、3、4。
取当归对照药材，加乙醇20ml，振摇提取2小时，取上清液作为对照药材溶液。
吸取上述五种溶液各3～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯(365nm)下检视。
供试品溶液3、4薄层色谱中在当归对照药材相对应的位置上均显明显的相同颜色的斑点，但供试品4由于提取溶剂乙醇含水，提取的杂质较多，造成色谱中斑点较多，干扰了当归的检测；在供试品溶液1色谱中在当归对照药材相对应的位置没有观察到相同颜色的斑点；供试品溶液2色谱中在当归对照药材相对应的位置的斑点颜色不明显。试验结果表明，正己烷、醋酸乙酯不能有效地将制剂中的当归化学成分提取出来，而乙醇、无水乙醇提取效率较高，但乙醇提取杂质较多。因此，选择无水乙醇为提取中药组合物制剂中当归化学成分的最优溶剂。
4、提取溶剂量的考察
为了更真实地反应中药的质量，本实验通过试验选择提取中药组合物制剂中当归化学成分的最优提取溶剂量、最佳提取时间。
取中药组合物制剂12g三份，研碎，加硅藻土12g，研匀。分别加无水乙醇50、100、150ml，超声处理0.5小时，滤过，滤液浓缩至1.5ml，作为供试品溶液1、2、3。
取当归对照药材，加乙醇20ml，振摇提取2小时，取上清液作为对照药材溶液。
吸取上述四种溶液各3～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯(365nm)下检视。
供试品1、2、3在当归对照药材相对应的位置上均显相同颜色的斑点，供试品2、3斑点较供试品1更清晰、明显，但供试品2、3的斑点颜色基本相似，无差别，表明100ml无水乙醇可将制剂中的当归成分基本萃取完全。所以确定提取中药组合物制剂中当归化学成分的最优提取溶剂量为100ml无水乙醇。
5、提取时间的考察
取中药组合物制剂三份各12g，研碎，加硅藻土12g，研匀。加无水乙醇100ml，分别超声处理15、30、60分钟，滤过，滤液浓缩至1.5ml，作为供试品溶液1、2、3。
取当归对照药材，加乙醇20ml，振摇提取2小时，取上清液作为对照药材溶液。
吸取上述四种溶液各3～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯(365nm)下检视。
供试品1、2、3在当归对照药材相对应的位置上均显相同颜色的斑点，供试品2、3色谱中较供试品1色谱中的斑点更清晰、明显，但供试品2、3的斑点颜色基本相似，无差别，表明超声提取30分钟可将制剂中的当归成分基本萃取完全。因此确定提取中药组合物制剂中当归化学成分的最优提取时间为30分钟。
6、供试品点样量的考察
薄层色谱的点样量有一定要求，点样量太小，斑点不清晰；点样量太大，增加点样困难，容易造成薄层过载，斑点拖尾，降低分离度，增加分离的难度，所以需要对供试品溶液的点样量进行考察。
取中药组合物制剂12g，研碎，加硅藻土12g，研匀。加无水乙醇100ml，超声处理0.5小时，滤过，滤液浓缩至1.5ml，作为供试品溶液。
另取当归对照药材，加乙醇20ml，振摇提取2小时，取上清液作为对照药材溶液。
分别吸取供试品溶液1、4、15μl，当归对照药材溶液4μl点于同一硅胶G板上，以正己烷-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，凉干，置紫外光(365nm)下进行观察。
点样量为1μl的供试品在当归对照药材相对应的位置上荧光斑点强度较低，不宜观 察；点样量为4μl的供试品在白术对照药材相对应的位置上荧光斑点明显，斑点大小适中，无拖尾，前后无干扰；点样量为15μl的供试品在当归对照药材相对应的位置上荧光斑点较大，明显拖尾，斑点与前后荧光斑点相连，而且点样时由于点样次数较多，破坏了硅胶薄层的表面。因次确定供试品的最佳点样量为3-5μl。
7、对照药材提取方法的考察
由于对照药材仅为一味药材，所以对照药材提取方法、提取溶剂量、提取时间与供试品提取方法有所不同。
提取方法的考察：
方法一、振摇提取：取当归对照药材1g，加乙醇20ml，振摇提取2小时，取上清液作为对照药材溶液1；
方法二、超声提取：取当归对照药材1g，加乙醇20ml，超声提取30min，取上清液作为对照药材溶液2；
方法二、回流提取：取当归对照药材1g，加乙醇20ml，回流提取30min，取上清液作为对照药材溶液3。
吸取上述三种对照药材溶液各3～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯(365nm)下检视。
对照药材溶液1、2、3在色谱中均显相同颜色的斑点，对照药材溶液1色谱中较对照药材溶液2、3色谱中的斑点更清晰、明显，表明提取当归对照药材时采用振摇提取时提取效率高于超声提取、回流提取。当归中成分为低极性成分，有一定的挥发性，加热、超声均可造成提取时当归成分的损失。供试品制备时由于中药组合物制剂剂型为蜜丸，虽经硅藻土分散，但仅靠被动渗透提取不完全，所以采用超声提取法进行提取；当归对照药材为单一药材，靠振摇提取，避免加热，可以将当归中的成分较为完全的提取出来，所以在提取对照药材时采用振摇提取。
8、对照药材提取溶剂量的考察
取当归对照药材1g三份，分别加乙醇5、20、50ml，振摇提取2小时，取上清液作为对照药材溶液1、2、3。
吸取上述三种对照药材溶液各3～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯(365nm)下检视。
对照药材溶液1、2、3色谱中均显相同颜色的斑点，对照药材溶液2色谱甲斑点较供试品1、3色谱中的斑点更清晰、明显。对照药材溶液1由于提取溶液量较少，中药组 合物制剂中当归化学成分提取不完全，对照药材溶液3虽然提取溶剂量大，由于药液浓度低，所以色谱中斑点颜色也不明显，将对照药材溶液浓缩到20ml，色谱中斑点颜色与对照药材溶液2色谱中斑点无明显差别，说明20ml乙醇可以将中药组合物制剂中当归化学成分基本提取完全；如果使用50ml乙醇提取效率增加不大，且需要将药液浓缩后点样，增加了实验操作。因此确定，提取供试批且供试品2、3的斑点颜色基本相似，无差别，因此确定提取当归对照药材的最佳提取溶剂量为20ml。
9、对照药材提取时间的考察
取当归对照药材1g三份，分别加20ml，振摇提取1、2、3小时，取上清液作为对照药材溶液1、2、3。
吸取上述三种对照药材溶液各3～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯(365nm)下检视。
对照药材溶液1、2、3在色谱中均显相同颜色的斑点，对照药材溶液2、3色谱中较对照药材溶液1色谱中的斑点更清晰、明显，且对照药材溶液2、3的斑点颜色基本相似，无差别，表明当归对照药材提取2小时基本提取完全。因此确定提取当归对照药材的最佳提取时间为2小时。
10、对照药材点样量的确定：
取当归对照药材，加乙醇20ml，振摇提取2小时，取上清液作为对照药材溶液。
分别吸取当归对照药材溶液1μl、4μl、15μl点于同一硅胶G板上，以正己烷-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，凉干，置紫外光(365nm)下进行观察。
当归对照药材溶液点样量为1μl时，荧光斑点强度较低，不宜观察；当归对照药材溶液点样量为4μl时，当归对照药材薄层上荧光斑点清晰，大小适中，无拖尾，前后无干扰；当归对照药材溶液点样量为15μl时，白术对照药材薄层上荧光斑点较大，与前后荧光斑点相连，且明显拖尾，另外，由于点样大，点样次数较多，易对硅胶薄层表面造成破坏。因此，确定当归对照药材溶液的最佳点样量为3-5μl。
11、展开剂溶剂及比例的选择：
取中药组合物制剂12g，研碎，加硅藻土12g，研匀。加无水乙醇100ml，超声处理0.5小时，滤过，滤液浓缩至1.5ml，作为供试品溶液。
另取当归对照药材，加乙醇20ml，振摇提取2小时，取上清液作为对照药材溶液。
取缺确当归的当归阴性制剂12g按供试品制备方法制备缺当归阴性对照溶液。
取5块硅胶G薄层板，每块薄层均点样供试品、当归对照药材、缺当归阴性对照溶 液各3-5μl，分别以正己烷、正己烷-醋酸乙酯(20∶1)、正己烷-醋酸乙酯(9∶1)、正己烷-醋酸乙酯(1∶1)、醋酸乙酯为展开剂，展开，取出，凉干，置紫外光(365nm)下进行观察。
结果如下：薄层板1以正己烷为展开剂，由于展开剂极性太低，供试品、对照药材中当归成分均未展开；薄层板2以正己烷-醋酸乙酯(20∶1)为展开剂，极性较低，展开不充分，供试品中当归成分未与其他斑点分离；薄层板3以正己烷-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，极性适中，对照药材品中目标斑点Rf值为0.45，且与其他成分分离良好，供试品中在当归对照药材相对应的位置上显相同颜色的荧光斑点，且该当归成分-目标斑点与其他成分斑点分离良好，阴性无干扰；薄层板4、5分别以正己烷-醋酸乙酯(1∶1)、醋酸乙酯为展开剂，由于展开剂极性太大，供试品、对照药材中当归成分Rf值较大，与其他成分斑点重叠，分离失败。所以确定分离中药组合物制剂中当归成分的最优薄层展开剂为正己烷-醋酸乙酯(9∶1)。
12、显色条件的选择：
当归中的成分日光下没有颜色，但在紫外下却显荧光，因此，考虑直接置紫外光灯(365nm)下观察荧光或使用通用型显色剂显色后观察。常用的通用型显色剂为10％的硫酸乙醇溶液。
取中药组合物制剂12g，研碎，加硅藻土12g，研匀。加无水乙醇100ml，超声处理0.5小时，滤过，滤液浓缩至1.5ml，作为供试品溶液。
另取当归对照药材，加乙醇20ml，振摇提取2小时，取上清液作为对照药材溶液。
取两块硅胶G薄层板，两块薄层板分别点上述供试液及对照药材溶液各3～5μl，以正己烷-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。
方法一：薄层1喷以10％的硫酸乙醇溶液；
方法二：薄层2置紫外灯(365nm)下检视；
方法一薄层在日光下观察，供试品溶液与对照药材溶液色谱均没有观察到明显颜色的斑点，且在紫外(365nm)下均无荧光。方法二薄层在紫外(365nm)下在当归对照药材相对应的位置上，供试品溶液有明显显相同颜色的荧光斑点，斑点清晰，前后无干扰。因此确定确定分离中药组合物制剂中当归成分的最佳显色条件为置紫外光(365nm)下观察荧光。
综上试验最后确定中药组合物制剂中当归的薄层色谱鉴别条件为：取中药组合物制剂12g，研碎，加硅藻土12g，研匀。加无水乙醇100ml，超声处理0.5小时，滤过，滤 液浓缩至1.5ml，作为供试品溶液。另取当归对照药材，加乙醇20ml，振摇提取2小时，取上清液作为对照药材溶液。吸取上述两种溶液各3～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的亮蓝色斑点。
实验例3：胶囊剂处方筛选实验
1：外观性状：
取本发明实施例1胶囊内容物，置洁净白纸上，观察内容物的流动性，测休止角。
采用固定漏斗法，将3只漏斗串联并固定于水平放置的坐标纸上1cm的高度处，小心地将粉末沿漏斗壁倒入最上的漏斗中直到坐标纸上形成的圆锥体尖端接触到漏斗口为止，由坐标纸测出圆锥底部的直径(2R)，计算出休止角tga＝H/R.做5次，计算平均值。
2吸湿性：
将上述内容物置室温条件下观察粉末性状变化。
吸湿性试验：取底部盛有氯化钠过饱和溶液的玻璃干燥器，放入25℃恒温培养箱内恒温24h，此时干燥箱内的相对湿度为75％。在已恒重的称量瓶底部，分别放入约2g样品，准确称重后置于氯化钠过饱和溶液的干燥器内(称量瓶盖打开)，于25℃恒温培养箱保存，48h后称量，计算吸湿百分率。
本发明胶囊剂处方筛选
胶囊处方筛选----吸湿性考察
下述实施例均能实现上述实验例的效果。
具体实施方式
实施例1丸剂
乌鸡(去毛爪肠)128g 鹿角胶25.6g 鳖甲(制)12.8g 牡蛎(煅)9.6g
桑螵蛸9.6g 人参25.6g 黄芪6.4g 当归28.8g
白芍25.6g 香附(醋制)25.6g 天冬12.8g 甘草6.4g
地黄51.2g 熟地黄51.2g 川芎12.8g 银柴胡5.2g
丹参25.6g 山药25.6g 芡实(炒)12.8g 鹿角霜9.6g
制法：以上二十味，熟地黄、地黄、川芎、鹿角霜、银柴胡、芡实、山药、丹参八味粉碎成粗粉，其余乌鸡等十二味，分别酌予碎断，置罐中，另加黄酒300g，加盖封闭，隔水炖至酒尽，取出，与上述粗粉掺匀，低温干燥，再粉碎成细粉，过筛，混匀。每100g粉末加炼蜜30～40g与适量的水，泛丸，干燥，制成水蜜丸，即得。
功用：补气养血，调经止带。用于气血两虚，身体瘦弱，腰膝酸软，月经不调，崩漏带下。
用法用量：口服，水蜜丸一次6g，一日2次。
质量控制方法：
鉴别：
A、取中药组合物制剂12g，研碎，加硅藻土12g，研匀。加无水乙醇100ml，超声处理0.5小时，滤过，滤液浓缩至1.5ml，作为供试品溶液。另取当归对照药材，加乙醇20ml，振摇提取2小时，取上清液作为对照药材溶液。吸取上述两种溶液各3～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的亮蓝色斑点。
B、取中药组合物制剂12g，研碎，加硅藻土12g，研匀。加氯仿100ml，加热回流1.5小时，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1.5ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。另取丹参酮IIA对照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法的试验，吸取上述两种溶液各6μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯(19∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗红色斑点。
含量测定：色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水(33∶67)为流动相；检测波长为230nm；对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得；供试品溶液的制备：取水蜜丸，研细，精密称取5g。精密加入30％乙醇25ml，称重，时时振摇，放置24小时，超声处理30分钟，放冷，称重，加30％乙醇补足重量，滤过，精密量取续滤液5ml，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，用30％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，置蒸发 皿中蒸干，残渣用水5ml分次使溶解，转移至25ml量瓶中，容器用甲醇适量多次洗涤，洗液并入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品含白芍以芍药苷(C23H28O11)计，水蜜丸每1g不得少于0.35mg。
实施例2胶囊剂
乌鸡(去毛爪肠)128g 鹿角胶25.6g 鳖甲(制)12.8g 牡蛎(煅)9.6g
桑螵蛸9.6g 人参25.6g 黄芪6.4g 当归28.8g
白芍25.6g 香附(醋制)25.6g 天冬12.8g 甘草6.4g
地黄51.2g 熟地黄51.2g 川芎12.8g 银柴胡5.2g
丹参25.6g 山药25.6g 芡实(炒)12.8g 鹿角霜9.6g
熟地黄、地黄、川芎、鹿角霜、银柴胡、芡实、山药、丹参八味粉碎成粗粉，其余乌鸡等十二味，分别酌予碎断，置罐中，另加黄酒300g，加盖封闭，隔水炖至酒尽，取出，与上述粗粉掺匀，低温干燥，再粉碎成细粉，过筛，混匀，加入辅料，其中药粉∶淀粉∶碳酸钙∶硬脂酸镁的比例为10∶2.85∶1.1∶0.15，混匀，填充胶囊，即得。
实施例3颗粒剂
乌鸡(去毛爪肠)130g 鹿角胶28g 鳖甲(制)12.8g 牡蛎(煅)9.6g
桑螵蛸9.6g 人参23g黄芪8g 当归30g
白芍25.6g 香附(醋制)25.6g 天冬12.8g 甘草6.4g
地黄51.2g 熟地黄51.2g 川芎12.8g 银柴胡5.2g
丹参25.6g 山药25.6g 芡实(炒)12.8g 鹿角霜9.6g
熟地黄、地黄、川芎、鹿角霜、银柴胡、芡实、山药、丹参八味粉碎成粗粉，其余乌鸡等十二味，分别酌予碎断，置罐中，另加黄酒300g，加盖封闭，隔水炖至酒尽，取出，与上述粗粉掺匀，低温干燥，再粉碎成细粉，过筛，混匀，加入辅料，经常规工艺制成颗粒剂。
Claims (1)
1.一种中药组合物在制备对抗5-Fu化疗导致骨髓造血抑制药物中的应用，其特征在于该中药组合物的原料药组成为：
乌鸡去毛爪肠128重量份、鹿角胶25.6重量份、制鳖甲12.8重量份、煅牡蛎9.6重量份、桑螵蛸9.6重量份、人参25.6重量份、黄芪6.4重量份、当归28.8重量份、白芍25.6重量份、醋制香附25.6重量份、天冬12.8重量份、甘草6.4重量份、地黄51.2重量份、熟地黄51.2重量份、川芎12.8重量份、银柴胡5.2重量、丹参25.6重量份、山药25.6重量份、炒芡实12.8重量份、鹿角霜9.6重量份。
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