CN101760503B - 一种快速检测啤酒厌氧菌的培养基及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速检测啤酒中有害厌氧菌的培养基，其特征是液体配方如下1L的添加量：果糖7.5g，L-半胱氨酸盐酸盐1.25g，柠檬酸铵1g，牛肉提取物6.6-6.7g，右旋葡萄糖10.3-10.4g，磷酸氢二钾1.3-1.4g，硫酸镁0.05g，硫酸锰0.025g，吐温80 0.6g，元蛋白胨5g，乙酸钠3.3-3.4g，酵母浸出物3.3-3.4，牛肝浸粉1.5g，L-苹果酸0.4g，麦芽糖22.5g，乳糖3.3-3.4g，番茄汁6g，特殊蛋白胨12.5g，胞啶0.1g，脱氧胸腺嘧啶0.2g。固体配方上述液体配方中添加琼脂15g。本发明所述的啤酒有害厌氧菌快速培养基是采用无机营养成分、有机营养成分、碳水化合物、生长刺激物质、天然提取物、表面活性剂通过混合调配、分装、灭菌等步骤配制而成，培养速度更快、培养效果更好。
Description
技术领域
本发明属于啤酒技术领域，更详细地说，涉及啤酒生产过程中一种快速检测啤酒中有害厌氧菌的培养基及其制备方法。
背景技术
啤酒酿造是建立在利用啤酒酵母的发酵和控制有害微生物的污染基础上的。我们需要的是只有培养酵母参与的纯种发酵，但在整个啤酒酿造过程中，酿造设备、空气、酿造用水等诸多因素都有可能导致有害微生物进入麦汁或发酵液中。如果有害微生物大量生长繁殖，就会污染麦汁和啤酒。污染的细菌会引起啤酒酸败、异臭、粘稠和出现浑浊，严重地影啤酒的质量，会给消费者和啤酒厂家造成伤害和损失。
啤酒对于绝大多数微生物都是营养贫乏的、甚至是恶劣的培养基。酒精含量在通常为4％-5％(w/w)；pH值波动在3.8-4.7，低于多数细菌可以生长的极限；而且二氧化碳含量高(约0.5％w/w)，特别低的溶解氧(＜0.1mg/L)使啤酒几乎成为厌氧环境。只有少数细菌可以在这种恶劣的环境下生长，导致啤酒腐败。这些细菌既有革兰氏阳性也有阴性菌。几乎所有的革兰氏阳性菌都是乳酸菌，它们构成了革兰氏阳性菌中庞大的一群。只有一部分乳酸菌会造成啤酒腐败，啤酒厂危害最大的多属于乳杆菌属和片球菌属。德国在1980-1990年间，这两种菌大约引起了58％-88％的微生物腐败事故。而在捷克啤酒厂，发现的啤酒有害菌都是乳酸菌。乳酸菌对啤酒造成腐败，引起啤酒混浊，黏度增加，产生不愉快的酸味及其它非典型气味。
为了更好的监控啤酒生产过程的微生物状况，对啤酒厌氧菌特别是乳酸杆菌属和片球菌属的快速检测至关重要。目前商品化选择性培养基较多，主要有NBB、UBA、MRS、Raka-Ray、VLB-S7等，其中MRS培养基应用较广，并被三家主要酿造协会(EBC-欧洲啤酒协会、ASBC-美国酿造化学家协会、BCOJ-日本酿造协会)所推荐；其它培养基如NBB-A，BMB的培养效果也比较好，培养检测时间大多集中在5-14天。
现有使用的培养基，针对啤酒有害厌氧菌培养时间需耗时7天，而且对于生长需求较为复杂的片球菌属(Pediococcus.spp)及两株乳杆菌(Lactobacillus lindneri和Lactobacillus paracollinoides)来说，即使培养7天效果也不是很理想，菌落过小，只有针尖大小，不利于观察、计数。为了更及时地监控啤酒生产过程的微生物状况，啤酒行业急欲开发一种针对常见啤酒有害厌氧菌(主要包括乳酸杆菌属和片球菌属)培养速度更快、效果更好的啤酒有害菌培养基。
发明内容
本发明的目的，就在于克服上述缺点和不足，提供培养速度快，利于观察和计数的一种快速检测啤酒中有害厌氧菌的培养基及其制备方法。
一种快速检测啤酒中有害厌氧菌的培养基，其液体配方如下1L的添加量(g)：
碳源物质：果糖(fructose)7.5g，右旋葡萄糖(dextrose)10.3-10.4g，麦芽糖(maltose)22.5g，乳糖(lactose)3.3-3.4g，L-苹果酸(L-malic acid)0.4g；
氮源物质：元蛋白胨(proteose peptone No3)5g，牛肉提取物(beefextract)6.6-6.7g，特殊蛋白胨(peptone special)12.5g，肝浸粉(liverconcentrate)1.5g；
表面活性剂：吐温80；
氨基酸盐类：L-半胱氨酸盐酸盐(L-Cysteine HCL)1.25g；
B族维生素及其他微量元素类物质：酵母浸出物(Yeast Extract)3.3-3.4g，番茄汁(tomato juice)6g或含有等量番茄汁的番茄汁培养基；
抑制非啤酒有害厌氧菌类物质：乙酸钠(sodium acetate)3.3-3.4g；
加快各种啤酒有害厌氧菌生长类物质：胞啶(cytidine)0.1g，脱氧胸腺嘧啶(thymidine)0.2g；
无机营养物质：硫酸锰(manganese sulfate)0.025g，硫酸镁(magnesiumsulfate)0.05g、柠檬酸铵(ammonium citrate)1g；
其他：250ml的清酒或除气啤酒，750ml的水。
其中元蛋白胨可替换为牛肉蛋白胨，或胰蛋白胨(tryptone)，或多蛋白胨(polypeptone)或胨化牛奶(peptonized milk)。
一种快速检测啤酒中有害厌氧菌的培养基，其固体配方如下1L的添加量(g)：在上述液体配方中添加琼脂(Agar)15g。
上述快速检测啤酒中有害厌氧菌的培养基的制备方法，包括下述步骤：
(1)将上述配方成分列表里成分混合，置25％清酒或者除气啤酒和75％的水的溶剂中加热溶解；
(2)利用1M的NaOH将pH值调节到5.8-6.2；
(3)如果检测含有酵母的样品需加入10ppm的放线菌酮；
(4)118℃高压灭菌15分钟，可暂存于2-10℃无菌保藏备用。
固体培养基的制备方法，在步骤(2)后加入琼脂，加热搅拌使琼脂溶解。
在步骤(4)后液体培养基按需求分装到无菌试管后，塞上无菌棉塞；固体培养基倒平板。
上述培养基的培养：置于厌氧培养箱或者厌氧罐30℃培养。
对于固体培养基48-72小时内即可观察、计数；对于液体培养基，48小时内即可观察、测浊度。
本发明所述的啤酒有害厌氧菌快速培养基是采用无机营养成分、有机营养成分、碳水化合物、生长刺激物质、天然提取物、表面活性剂通过混合调配、分装、灭菌等步骤配制而成。
其中碳源种类丰富多样，包括属于糖类的葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖和属于有机酸的L-苹果酸，可以满足厌氧菌对各类碳源的需求；特殊蛋白胨与牛肝浸粉可以提供成分更丰富的氮源；吐温80，属于表面活性剂，可以帮助微生物更有效的接触和吸收营养物质；半胱氨酸盐酸盐，一种有助于乳杆菌属快速生长的氨基酸盐类；酵母浸出物和番茄汁，为乳酸菌的生长提供必不可少的B族维生素及其他微量元素；乙酸钠，可以抑制非啤酒有害厌氧菌的增殖，提高培养基的选择度；胞啶和脱氧胸腺嘧啶，经文献证明可以有效的加快各种啤酒有害厌氧菌的生长速度；硫酸锰、硫酸镁、柠檬酸氨，为微生物的生长提供必要的无机营养物质；同时经过实验确定添加25％的清酒，可以补充B族维生素和酵母代谢营养产物，同时所含的苦味物质可以抑制非啤酒有害菌的增殖；水和琼脂，不作为营养物质，用来溶解、凝固培养基成分。虽然这种培养基与原来使用的同类培养基相比营养种类更加全面，但由于每种成分的用量合理、精简，因此与各种商品化培养基相比检测成本并不高，配制1L的成本大约为133元，以前成本大约116元，基本持平。而QA33培养基174元，NBB培养基212元，成本较高。
有研究报道证明啤酒有害厌氧菌由于长期生存在啤酒制造环境中，已衍化出抗酒精、抗酒花物质的特点，其生理特性与实验室标准菌株有所不同，且每一种啤酒有害厌氧菌对微量元素的需求特别是对B族维生素种类的需求相差较大，因此培养基优化实验所使用的啤酒有害厌氧菌均分离自啤酒实际生产过程，并且经过了菌种鉴定确定到种，与使用实验室标准菌株相比，优化出的培养基更适合应用于实际生产过程的微生物监控。
同时培养基各种成分添加量的优化过程采用了响应面试验设计方法，通过建立回归方程，将常见啤酒有害菌的生长速度与每种营养成分的添加量之间的关系函数化，通过组合搭配安排实验，然后对实验数据进行回归拟合，并对拟合方程作显著性检验及方差分析，多项式模型拟合的性质由决定系数R2及方差分析判定，其统计学上的显著性由F检验确定，最终科学性的确定每种营养成分的最佳添加量。
本培养基针对啤酒生产过程当中危害性最大的厌氧细菌培养检测速度非常快，选择度高，无论是实验室单种划线、涂布培养(具体验证菌种见下列表格1)还是生产过程直接取样(包括生产流程中的水、发酵、过滤后、成品等不同取样点)，至多在72小时内即可长齐所有啤酒有害厌氧菌菌落用以观察计数(检测含有酵母的样品需添加适量放线菌酮加以抑制)；并且对生长速度比较慢的lactobacillus.paracollinoides(尚无中文名，DSMZ编号：15502)、Lactobacillus lindneri(林氏乳杆菌/酸面团乳杆菌，DSMZ编号：20690)和pediococcus.damnosus(片球有害菌，DSMZ编号：20331)的培养效果特别好，与原来使用的培养基相比，生长速度更快，从7天缩短到2天，菌落直径明显增大，从针尖大小左右增大到小米粒大小，宜于观察、计数。
有害菌拉丁名及DSMZ编号(DSMZ：德国菌种保藏中心)对比参照表格1如下：
| No. | Species | 中文名 | DSMZ No. | 建议培养时间(小时) |
| 01 | Lactobacillusbrevis | 短乳杆菌 | 20054 | 24-48 |
| 02 | Lactobacilluscasei | 干酪乳杆菌 | 20011 | 48 |
| 03 | Lactobacilluscoryniformi | 棒状乳酸杆菌 | 20001 | 48 |
| 04 | Lactobacilluslindneri | 林氏乳杆菌/酸面团乳杆菌 | 20690 | 48 |
| 05 | Lactobacillusparacollinoides | 尚无中文名 | 15502 | 48 |
| 06 | Lactobacillusplantarum | 植物乳杆菌/胚芽乳杆菌 | 20174 | 24-48 |
| 07 | Pediococcusclausenii | 尚无中文名 | 14800 | 48 |
| 08 | Pediococcusdamno sus | 片球有害菌 | 20331 | 48-72 |
| 09 | Pediococcusinopinatus | 意外片球菌 | 20285 | 48 |
表2、生产厂实际取样对比效果(单位：个)
*快速：本专利发明的啤酒有害厌氧菌快速培养基
原：原来使用的培养基
以上实验对照样品取自于啤酒实际生产流程，将样品进行无菌膜滤，然后将滤膜一分为二分别置于两种培养基上进行培养，每天观察、计数。可以看出本专利发明的啤酒有害菌快速培养基至多在第三天即可长齐菌落用以观察、计数；而原来所用的培养基至少要等到第七天才能观察、计数。
具体实施方式
实施例1。
一种快速检测啤酒中有害厌氧菌的培养基，其液体配方如下1L的添加量(g)：果糖(fructose)7.5g，L-半胱氨酸盐酸盐(L-Cysteine HCL)1.25g，柠檬酸铵(ammonium citrate)1g，牛肉提取物(beef extract)6.6-6.7g，右旋葡萄糖(dextrose)10.3-10.4g，磷酸氢二钾(dipotassium phosphate)1.3-1.4g，硫酸镁(magnesium sulfate)0.05g，硫酸锰(manganese sulfate)0.025g，吐温80(polysorbate80)0.6g，元蛋白胨(proteose peptone No3)5g，乙酸钠(sodium acetate)3.3-3.4g，酵母浸出物(Yeast Extract)3.3-3.4g，牛肝浸粉(liver concentrate)1.5g，L-苹果酸(L-malic acid)0.4g，麦芽糖(maltose)22.5g，乳糖(lactose)3.3-3.4g，番茄汁(tomato juice)6g，特殊蛋白胨(peptonespecial)12.5g，胞啶(cytidine)0.1g，脱氧胸腺嘧啶(thymidine)0.2g。
一种快速检测啤酒中有害厌氧菌的培养基，其固体配方如下1L的添加量(g)：在上述液体配方中添加琼脂(Agar)15g。
本发明所述的啤酒有害厌氧菌快速培养基是采用无机营养成分、有机营养成分、碳水化合物、生长刺激物质、天然提取物、表面活性剂通过混合调配、分装、灭菌等步骤配制而成，包括下述步骤：
(1)将上述配方成分列表里成分混合，置25％清酒或者除气啤酒和75％的水的溶剂中加热溶解；
(2)利用1M的NaOH将pH值调节到5.8-6.2；
(3)如果检测含有酵母的样品需加入10ppm的放线菌酮；
(4)118℃高压灭菌15分钟，可暂存于2-10℃无菌保藏备用。
固体培养基的制备方法，在步骤(2)后加入琼脂，加热搅拌使琼脂溶解。
在步骤(4)后液体培养基按需求分装到无菌试管后，塞上无菌棉塞；固体培养基倒平板。
上述培养基的培养：置于厌氧培养箱或者厌氧罐30℃培养。
对于固体培养基48-72小时内即可观察、计数；对于液体培养基，48小时内即可观察、测浊度。
本发明参照附图和实施例进行说明，但保护范围不限于此，在本发明技术范围内具有普通技术人员可以经过简单的变换，而获得本发明同样的技术效果，同样在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种快速检测啤酒中有害厌氧菌的培养基，其特征是液体配方如下1L的添加量：
碳源物质：果糖7.5g，右旋葡萄糖10.3-10.4g，麦芽糖22.5g，乳糖3.3-3.4g，L-苹果酸0.4g；
氮源物质：3号朊蛋白胨5g，牛肉提取物6.6-6.7g，特殊蛋白胨12.5g，牛肝浸粉1.5g；
表面活性剂：吐温80；
氨基酸盐类：L-半胱氨酸盐酸1.25g；
B族维生素及其他微量元素类物质：酵母浸出物3.3-3.4g，番茄汁6g或含有等量番茄汁的番茄汁培养基；
抑制非啤酒有害厌氧菌类物质：乙酸钠3.3-3.4g；
加快各种啤酒有害厌氧菌生长类物质：胞啶0.1g，脱氧胸腺嘧啶0.2g；
无机营养物质：硫酸锰0.025g，硫酸镁0.05g、柠檬酸铵1g；
其他：250ml的清酒或除气啤酒，750ml的水。
2.如权利要求1所述的一种快速检测啤酒中有害厌氧菌的培养基，其特征是其中3号朊蛋白胨可替换为牛肉蛋白胨，或胰蛋白胨，或多蛋白胨或胨化牛奶。
3.如权利要求1或2所述的一种快速检测啤酒中有害厌氧菌的培养基，其特征是固体配方上述液体配方中添加琼脂15g。
4.上述权利要求1所述的培养基的制备方法，其特征是包括下述步骤：
(1)将上述配方成分列表里成分混合，置25％清酒或者除气啤酒和75％的水的溶剂中加热溶解；
(2)利用1M的NaOH将pH值调节到5.8-6.2；
(3)如果检测含有酵母的样品需加入10ppm的放线菌酮；
(4)118℃高压灭菌15分钟，可暂存于2-10℃无菌保藏备用。
5.如权利要求4所述的培养基的制备方法，其特征是：固体培养基的制备，在步骤(2)后加入琼脂，加热搅拌使琼脂溶解。
6.如权利要求4所述的培养基的制备方法，其特征是在步骤(4)后液体培养基按需求分装到无菌试管后，塞上无菌棉塞；固体培养基倒平板。
7.如权利要求4所述的培养基的制备方法，其特征是还可以包括步骤(5)培养基的培养：置于厌氧培养箱或者厌氧罐30℃培养，固体培养基48-72小时内，液体培养基48小时内。
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