CN101748073A - 一种蛹虫草菌种分离保藏方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种蛹虫草菌种分离保藏的方法，该方法从成熟子囊果中分离得到纯子囊孢子，将子囊孢子与收集沙混合后保藏。本发明蛹虫草的保藏对象是子囊孢子，与传统保藏真菌细胞或分生孢子不同，本发明保藏的是有性孢子，其能最大限度地保留亲本的遗传特性，避免菌种退化。此外，在分离子囊孢子时，本发明采用子囊果自然弹射法得到纯子囊孢子，避免了传统冲洗或刮取等方法对孢子的伤害，从而提高孢子的活力。

Description

一种蛹虫草菌种分离保藏方法

技术领域

本发明属于蛹虫草栽培技术领域，涉及蛹虫草菌种及遗传特性保持的方法。

背景技术

蛹虫草(Cordyceps militaris(L.Fr)Link)，又名蚕虫草、北冬虫夏草，属子囊菌门(Ascomycota)、核菌纲(Pyrenomycetes)、球壳目(Sphaeriales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、虫草属(Cordyceps(Fr.)Link)真菌。蛹虫草是虫草属真菌的模式种，在自然界多寄生在多寄生在多种鳞翅日昆虫的幼虫和蛹上。

近年来，很多研究都表明，人工栽培的蛹虫草化学成分及药理作用与冬虫夏草相似，但价格却远远低于冬虫夏草，因此，蛹虫草的开发应用具有极大的潜在市场。人工培养蛹虫草是解决野生虫草来源不足的良好途径，相关的研究很多，然而人工培养过程中菌种退化现象严重是制约产业化开发的一大瓶颈。影响人工培养蛹虫草菌种退化的因素很多，简单的可以分成两的大类，一类是菌株的遗传特性造成菌种的退化(内因)。一类是培养条件、操作环节、环境因素导致的菌种退化(外因)。

人工培养蛹虫草要得到子实体，先决条件是这个蛹虫草菌株要有形成子实体的能力，不同菌株所具备的遗传背景是不一样的，所以它们具备形成的子实体的能力有差异。然而，在实际生产中，即使是优势蛹虫草菌株，随着菌种传代、转接次数的增加或保藏时间的延长，菌种资源极易退化。

蛹虫草菌种退化的形态表现为：角变现象增加；菌丝长势变弱，子实体原基的产生减少，培养周期越来越长，菌丝易老化；菌丝体色素变弱，甚至没有色素的产生，子实体产量显著减少且品质改变等。在生产上通常蛹虫草菌种转管次数不宜超过3次(俞孕珍，1995)。

蛹虫草菌种退化后表现在子实体上为产量和品质下降，畸形率上升，甚至不分化子实体原基(王升厚，1998)。

在实际的蛹虫草规模化生产的菌种分离和筛选过程中，最常采用的是组织分离法。组织分离法就是指通过子实体组织分离获得纯菌丝的方法。食用菌的子实体实际上就是菌丝体的纽结物，它具有很强的再生能力。因此，只要切取一小块子实体组织，把它移植到培养基上，就能获取纯粹的菌丝体。

组织分离培养，从生物学的角度来看，乃是一种无性繁殖，是从组织-菌丝-组织-菌丝周而复始的循环过程，遗传变异小，但在无性繁殖过程中可能产生自然变异和突变，但组织分离产生的变异不很大，是一种累积、渐进的过程，变异是绝对的，稳定是相对的。组织分离法还会因取样时子实体发育的不同时期和部位，以及个人的经验和技巧而产生不同的结果。

组织分离法取样位置不同遗传特性产生区别的一个典型事例是：香菇同一菌种子实体菇肉、菇柄组织分离物与菌丝体间既保持了遗传物质相对稳定性和遗传性状的稳定性(DNA相似性在88％以上)，存在着相对的遗传变异，虽然变异极为细微，但是预示着一种潜在必然趋势，反映了累积、渐进的漫长过程，这是由于内、外因造成的，但主要是由于遗传型的变异造成的，育种工作者不应忽略这种变异的存在，因为这很可能是造成某些菌种退化和变异的原因所在。(香菇子实体组织分离物与菌丝体的遗传相关性上海农业学报1997，13(4)：85～88)

孢子分离法是利用食用菌成熟的有性孢子即担孢子、子囊孢子，无性孢子即厚垣孢子、节孢子、粉孢子等萌发成菌丝，来获得纯菌种的一种方法。由于孢子的数量大，变异的机会多，因此采用孢子分离法，可以有更多选择优良菌株的机会，而且孢子的生活力强，所得菌种菌龄小，生活力旺盛。但是有些食用菌的担孢子不易萌发成菌丝，还有些食用菌的孢子有两种或四种极性，单孢分离的菌株有时不产生子实体，必须经过交配，得到结实性的双核菌丝，才能用于产生。故孢子分离法又有单孢分离法和多孢分离法两种。

单孢分离法是指每次只取一个担孢子，让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的一种方法。多孢分离法就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发，自由交配来获得食用菌纯菌种一种方法。

蛹虫草单孢育种存在的问题：第一，种质资源十分有限，现存种质的遗传差异小，遗传背景和差异不清楚，种质资源的馈乏，严重限制了单孢杂交等杂交方法作用的发挥。收集鉴定调查我国及世界各地蛹虫草的种质背景，以便发现和充分利用有限的种质。第二，蛹虫草子囊孢子和分生孢子小，特别是子囊孢子的分离和获得，传统的单孢分离方法无法用显微操作确认接种材料是单孢。难以获得真正的单孢分离物。当前分离方法主要针对这些问题进行改进，并取得了一些进展，但是这些问题依然是单孢分离中的难点，有待进一步研究设计出更简易、更严格的无菌操作方法。第三，缺乏有效的遗传标记。近年来，育种的遗传标记从简单的性状标记、营养缺陷标记、抗性标记发展到目前的同核不育单孢配对杂交。目前同核不育单孢配对杂交仍然是期望最有前途的主要方法，但该方法存在很多不完善的方面，如产生的杂种子代并不都具备亲本的优良性状。

因孢子在形成时，经减数分裂后，会发生基因的分离和重组，孢子基因类型众多。孢子萌发后，各种能亲和的菌丝发生交配，形成多种有差异的双核菌丝类型，在遗传特性上与原来母体不相同。因此，多孢分离得到的菌丝体是杂混的基因群体，不同于亲本并有多种基因类型，从而不是一种纯菌种。但多孢分离法能最大限度的保留亲本的遗传特性。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种蛹虫草的分离保藏方法，用以克服菌种退化的问题。

本发明方法是从成熟子囊果中分离得到纯子囊孢子，然后将子囊孢子与收集沙混合后保藏。与传统保藏真菌细胞或分生孢子不同，本发明保藏的是有性孢子(子囊孢子)，其能最大限度地保留亲本的遗传特性，避免菌种退化。

在分离子囊孢子时，本发明采用子囊果自主弹射的方法获得纯子囊孢子。这种方法得到的子囊孢子能够使其与其它组织充分分离，从而得到纯的子囊孢子。具体可以将富含子囊果的子实体固定在密闭容器的顶端或侧面，容器内装有收集沙，待子囊孢子从子囊果中自然弹射出后，即得到纯子囊孢子。

所述的容器可以为三角瓶，固定子实体的方法是用针状物将子实体固定在瓶塞下面。子实体在固定时可以切成条状，这样便于固定和子囊果的弹射。

所述收集沙的优选粒度为60～80目，这种粒度有利于子囊孢子的保藏。另外，收集沙应当经过处理，使其纯净不含杂质，特别是不含有机质，这样可以避免子囊孢子在保藏时萌发。此外，保藏时应当尽量放置在低温干燥处，或者在干燥器中保藏。

子囊孢子从子囊果中弹射出来后，应当将子囊孢子和收集沙混合，然后可通过漏斗移入试管中，用灭菌的橡胶塞封口，然后用牛皮纸或塑料纸包好，存放于4～6℃低温干燥处或室温干燥器内保存。

此外，本发明还提供了一种多孢收集器，其可以是一种具有瓶塞的容器，在瓶塞内侧设有具有针状突起的子实体固定器，这样可以将富含子囊果的子实体悬空固定在容器的上方。所述容器可以是三角瓶等常用容器。

在本发明中，子囊孢子的分离保藏应当采用无菌操作，所用的器皿应当进行灭菌处理，这样可以避免子囊孢子的污染。

本领域技术人员应当理解，依据本发明，本领域技术人员可以直接将分离得到的纯子囊孢子进行使用。

本发明提供了一种蛹虫草菌种分离保藏的方法，该方法从成熟子囊果中分离得到纯子囊孢子，将子囊孢子与收集沙混合后保藏。本发明蛹虫草的保藏对象是子囊孢子，与传统保藏真菌细胞或分生孢子不同，本发明保藏的是有性孢子，其能最大限度地保留亲本的遗传特性，避免菌种退化。此外，在分离子囊孢子时，本发明采用子囊果自然弹射法得到纯子囊孢子，避免了传统冲洗或刮取等方法对孢子的伤害，从而提高孢子的活力。实验表明，室温或普通冰箱条件下菌种可保持2-10年，子实体产量和生物转化率无显著差异，基本保留了原始亲本的遗传性状。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明蛹虫草的分离保藏具体可采用如下方法进行：

(1)、多孢收集装置的制备：

多孢分离装置采用250-500ML三角瓶制成。首先选用耐高温高压的高分子材料(如PP塑料)，裁剪成比三角烧瓶口更小的方形或圆形小片，然后将大头针从一面插满整个小片(类似牙刷)。然后用棉线将针头的背面封在棉塞进入瓶口的一面。这样棉塞进入瓶口的一面就布满了针头，多孢收集装置就制成了。

(2)、多孢载体吸附沙的准备：

将河沙用60目过筛，弃去大颗粒及杂质，再用80目过筛，去掉细沙。用吸铁石吸去铁质，放入容器中用10％盐酸浸泡，如河沙中有机物较多可用20％盐酸浸泡。24小时后倒去盐酸，用水洗泡数次至中性，将沙子烘干。

(3)、多孢收集装置的灭菌及干燥处理：

称量处理好的多孢载体吸附沙约100-200克放入多孢分离装置，盖好制作好的带大头针的棉塞，然后整体121℃湿热灭菌30min。灭菌后放入干燥箱中80℃干燥8-12小时。

(4)、多孢分离亲本子实体的选择：

选取正在栽培瓶中生长后期的没有受到污染的，整瓶的所有子实体生长良好，形态颜色正常，子囊果已经成熟的的栽培瓶经过瓶表面消毒后放入超净工作台。

(5)、多孢的收集：

选取成熟的子实体经过无菌操作将子囊果丰富的部分用剪刀切割后放入灭菌过的培养皿中，大约收集5-10条后，将灭菌过的多孢分离器上的棉塞把下，然后用针头部刺入子实体中将其固定，最后将固定了子实体的棉塞仍然塞入三角瓶中。在室温的条件下放置10-15天让成熟的子囊孢子弹射在多孢分离沙上。另外子实体上子囊果子囊孢子弹射结束后，也可以直接将灭菌的液体培养基加入多孢收集装置，上摇瓶培养，直接做为菌种使用。

(6)、多孢保藏管的准备：

将试管用铝铂封口和铝铂包裹的漏斗同时后干热180℃2小时灭菌。将与试管相同型号的橡胶塞121℃湿热灭菌30min，灭菌后放入干燥箱中80℃干燥8-12小时。

(7)、多孢保藏管的制备：

经过10-15天的子囊孢子收集后，轻轻摇动三角瓶(尽量防止子实体从棉塞上脱落)，使子囊孢子和收集沙混合均匀。然后将子囊孢子和收集沙的混合物通过漏斗移入试管中，用灭菌的橡胶塞封口。然后用牛皮纸或塑料纸包好，存放于低温(4～6℃)干燥处或室温干燥器内保存。

(8)、菌种的活化：

无菌条件下打开多孢保藏管，取部分沙粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后直接做出菇实验或再转接斜面。

实施例1子囊孢子的分离和保藏

(1)、多孢收集装置的制备：

多孢分离装置采用500ML三角瓶制成。首先选用耐高温高压的高分子材料(PP塑料)，裁剪成比三角烧瓶口更小的圆形小片，然后将大头针从一面插满整个小片(类似牙刷)。然后用棉线将针头的背面封在棉塞进入瓶口的一面，制成多孢收集装置。

(2)、多孢载体吸附沙的准备：

将河沙用60目过筛，弃去大颗粒及杂质，再用80目过筛，去掉细沙。用吸铁石吸去铁质，放入容器中用10％盐酸浸泡。24小时后倒去盐酸，用水洗泡数次至中性，将沙子烘干。

(3)、多孢收集装置的灭菌及干燥处理：

称量处理好的多孢载体吸附沙200克放入多孢分离装置，盖好制作好的带大头针的棉塞，然后整体121℃湿热灭菌30min。灭菌后放入干燥箱中80℃干燥8-12小时。

(4)、多孢分离亲本子实体的选择：

选取正在栽培瓶中生长后期的没有受到污染的，整瓶的所有子实体生长良好，形态颜色正常，子囊果已经成熟的的栽培瓶经过瓶表面消毒后放入超净工作台。

(5)、多孢的收集：

选取成熟的子实体经过无菌操作将子囊果丰富的部分用剪刀切割后放入灭菌过的培养皿中，收集8条后，将灭菌过的多孢分离器上的棉塞把下，然后用针头部刺入子实体中将其固定，最后将固定了子实体的棉塞仍然塞入三角瓶中。在室温的条件下放置12天让成熟的子囊孢子弹射在多孢分离沙上。

(6)、多孢保藏管的准备：

将试管用铝铂封口和铝铂包裹的漏斗同时后干热180℃2小时灭菌。将与试管相同型号的橡胶塞121℃湿热灭菌30min，灭菌后放入干燥箱中80℃干燥8-12小时。

(7)、多孢保藏管的制备：

经过12天的子囊孢子收集后，轻轻摇动三角瓶(尽量防止子实体从棉塞上脱落)，使子囊孢子和收集沙混合均匀。然后将子囊孢子和收集沙的混合物通过漏斗移入试管中，用灭菌的橡胶塞封口。然后用牛皮纸或塑料纸包好，存放于低温(4～6℃)干燥处。

实例2

实验时间2006年4月：

1、菌种：

蛹虫草(购自中科院微生物所)

2、液体摇瓶用培养基：

去皮土豆300克(煮汁)、葡萄糖10克、蛋白胨2克、磷酸二氢钾0.5克、硫酸镁1克、水1000毫升，pH自然。

3、子实体生产营养液：黄豆2％、葡萄糖1％、奶粉5％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸镁0.05％、维生素B₁10mg/1000ml的比例配成营养液，调整pH在5.6～7.2。

4、采用PP料制成的培养盒：

高10CM，上底直径12cm，下底直径8cm。每盒大米40克和营养液56克分装混合，灭菌接种。

5、菌丝培养管理

培养室适宜温度为(18～25)℃，湿度为(70～85)％，应避光培养(7～8)天。菌丝布满表面后开始通风培养。

6、子实体培养

在按种后待菌丝布满整个瓶面并深扎到瓶底，开始见光，但避免太阳光直射。若培养室光线太暗，可补充日光灯照。菌丝见光后，在培养料表面或四周见有桔黄色色素形成，并出现米粒状的桔黄色菌蕾，菌蕾伸长后即成为子实体。子实体培育阶段，温度应为(20～23)℃，超过25℃生长缓慢，湿度应提高到(80～85)％。超过27℃菌丝萎缩不能出菌束。在子实体培养后期，逐渐加大室内空气的流通和交换，培养室培养阶段若发现污染应立即清除。

7、采收：

采后平均鲜重达到28.7克/瓶。

8、保藏

采用实施例1方法，将子实体子囊孢子进行保藏。

实例3

实验时间2008年8月：

1、菌种：

实施例2保藏的蛹虫草菌株子囊孢子。

2、液体摇瓶用培养基：

去皮土豆300克(煮汁)、葡萄糖10克、蛋白胨2克、磷酸二氢钾0.5克、硫酸镁1克、水1000毫升，pH自然。

3、子实体生产营养液：

黄豆2％、葡萄糖1％、奶粉5％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸镁0.05％、维生素B₁10mg/1000ml的比例配成营养液，调整pH在5.6～7.2。

4、采用PP料制成的培养盒

高10CM，上底直径12cm，下底直径8cm。每盒大米40克和营养液56克分装混合，灭菌接种。

5、菌丝培养管理

培养室适宜温度为(18～25)℃，湿度为(70～85)％，应避光培养(7～8)天。菌丝布满表面后开始通风培养。

6、子实体培养

在按种后待菌丝布满整个瓶面并深扎到瓶底，开始见光，但避免太阳光直射。若培养室光线太暗，可补充日光灯照。菌丝见光后，在培养料表面或四周见有桔黄色色素形成，并出现米粒状的桔黄色菌蕾，菌蕾伸长后即成为子实体。子实体培育阶段，温度应为(20～23)℃，超过25℃生长缓慢，湿度应提高到(80～85)％。超过27℃菌丝萎缩不能出菌束。在子实体培养后期，逐渐加大室内空气的流通和交换，培养室培养阶段若发现污染应立即清除。

7、采收：

采后后平均鲜重达到28.9克/瓶。

结论：

通过实例2和3的对比，子实体产量和外观均无显著性差异，从而说明本发明的确起到了保留亲本遗传性状的作用。

Claims (8)

1.一种蛹虫草菌种分离保藏方法，该方法包括以下步骤：1)从成熟子囊果中分离得到纯子囊孢子；2)将子囊孢子与收集沙混合后保藏。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤1)分离子囊孢子的方法是利用子囊果自主弹射得到纯子囊孢子。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤1)分离子囊孢子的方法是：将富含子囊果的子实体固定在密闭容器的顶端或侧面，容器内装有收集沙，待子囊孢子从子囊果中自然弹射出后，即得到纯子囊孢子。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的容器为三角瓶，固定子实体的方法是用针状物将子实体固定在瓶塞下面。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括将子实体切成条状。

6.如权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述收集沙的粒度为60～80目。

7.如权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，其中步骤2)将子囊孢子和收集沙混合后通过漏斗移入试管中，用灭菌的橡胶塞封口，然后用牛皮纸或塑料纸包好，存放于4～6℃低温干燥处或室温干燥器内保存。

8.一种多孢收集器，其为一具有瓶塞容器，其特征在于，在瓶塞内侧还设有具有针状突起的子实体固定器。