CN101747411B - 氨基酰色氨酰色氨酸三肽苄酯及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了氨基酰色氨酰色氨酸三肽苄酯及其制备方法和应用。本发明化合物的通式结构为：AA-Trp-Trp-OBzl；其中，AA选自丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸残基。本发明在肿瘤细胞模型和小鼠S180肉瘤模型上评价该化合物的抗肿瘤活性，实验结果显示，本发明化合物具有优秀的抗肿瘤活性，未见毒副反应，临床上可作为抗肿瘤剂应用。

Description

氨基酰色氨酰色氨酸三肽苄酯及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及三肽苄酯，尤其涉及一系列氨基酰色氨酰色氨酸三肽苄酯及其制备方法，本发明还进一步涉及它们的抗肿瘤药理作用；属于生物医药领域。

背景技术

癌症是全球死亡率最高的病因之一。DNA嵌合类型的抗癌药以DNA为直接靶点，已成为抗癌药的重要分支，引起广泛关注。本发明认识到色氨酰-色氨酸苄酯可能嵌入肿瘤细胞的DNA，在它们的N端引入天然氨基酸之后，可协助嵌入作用，因而可增强抗肿瘤作用。按照这种构想，发明人发明了具有抗肿瘤作用的氨基酰色氨酰色氨酸三肽苄酯。

发明内容

本发明的目的之一是提供一类具有抗肿瘤活性的氨基酰色氨酰色氨酸三肽苄酯。

本发明的目的之二是提供一种制备上述具有抗肿瘤活性的氨基酰色氨酰色氨酸三肽苄酯的制备方法。

本发明的目的之三是提供一种能够治疗肿瘤的药物组合物。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一类具有抗肿瘤活性的氨基酰色氨酰色氨酸三肽苄酯，其结构为通式I所示：

AA-Trp-Trp-OBzl               I

其中，AA选自丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸残基。

一种制备上述氨基酰色氨酰色氨酸三肽苄酯的方法，该方法包括：

(1)将叔丁氧羰基保护的色氨酸和色氨酸苄酯耦联，合成叔丁氧羰基色氨酰色氨酸苄酯；

(2)脱去叔丁氧羰基酪氨酰色氨酸苄酯的叔丁氧羰基，制备得到色氨酰色氨酸苄酯；

(3)将色氨酰色氨酸苄酯与叔丁氧羰基保护的氨基酸进行耦联，制备得到叔丁氧羰基氨基酰色氨酰色氨酸苄酯；

(4)将叔丁氧羰基氨基酰色氨酰色氨酸苄酯脱去叔丁氧羰基，即得。

其中，步骤(1)中优选在DCC、HOBt、NMM和THF存在下将叔丁氧羰基保护的色氨酸和色氨酸苄酯耦联，合成叔丁氧羰基色氨酰色氨酸苄酯；

步骤(2)中优选的在氯化氢/乙酸乙酯溶液中加入叔丁氧羰基酪氨酰色氨酸苄酯，脱去叔丁氧羰基，制备得到色氨酰色氨酸苄酯；

步骤(3)中优选在DCC、HOBt、NMM和THF存在下将色氨酰色氨酸苄酯与叔丁氧羰基保护的氨基酸进行耦联，制备得到叔丁氧羰基氨基酰色氨酰色氨酸苄酯；所述的叔丁氧羰基保护的氨基酸优选自叔丁氧羰基保护的丙氨酸、叔丁氧羰基保护的天冬氨酸、叔丁氧羰基保护的谷氨酸、叔丁氧羰基保护的苯丙氨酸、叔丁氧羰基保护的甘氨酸、叔丁氧羰基保护的组氨酸、叔丁氧羰基保护的异亮氨酸、叔丁氧羰基保护的赖氨酸、叔丁氧羰基保护的亮氨酸、叔丁氧羰基保护的蛋氨酸、叔丁氧羰基保护的天冬酰胺、叔丁氧羰基保护的谷氨酰胺、叔丁氧羰基保护的精氨酸、叔丁氧羰基保护的丝氨酸、叔丁氧羰基保护的苏氨酸、叔丁氧羰基保护的缬氨酸、叔丁氧羰基保护的色氨酸或叔丁氧羰基保护的酪氨酸；

步骤(4)中优选在氯化氢/乙酸乙酯溶液中叔丁氧羰基氨基酰色氨酰色氨酸苄酯脱去叔丁氧羰基。

本发明在肿瘤细胞模型和小鼠S180肉瘤模型上评价本发明化合物的抗肿瘤活性，实验结果显示，本发明化合物具有确切的抗肿瘤活性；毒性评价结果表明，本发明化合物用药安全，未见毒副反应，临床上可作为抗肿瘤剂应用。在此基础上，本发明提供了一种治疗治疗肿瘤的药物组合物，该药物组合物由治疗上有效量的本发明化合物和药学上可接受的载体或辅料组成。

附图说明

图1本发明化合物的合成路线图。i)DCC，HOBt，NMM，THF；ii)4NHCl/EtOAc，0℃，30min；Boc-AA选自叔丁氧羰基保护的丙氨酸、天冬氨酸单苄酯、谷氨酸单苄酯、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、二叔丁氧羰基保护的赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、硝基精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸.

图2本发明化合物(NWW)在89μmol/kg，8.9μmol/kg和0.89μmol/kg三种剂量下对S180荷瘤小鼠的抑瘤率(n＝12)。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备Ala-Trp-Trp-OBzl(AWW)

1)制备Boc-Trp-Trp-OBzl

冰浴冷却下往置于250ml圆底烧瓶中的由5.00g(12.6mmol)盐酸L-色氨酸苄酯、4.22g(1.39mmol)Boc-L-色氨酸和1.87g(1.39mmol)HOBt与100ml THF构成的溶液中滴入3.43g(1.67mmol)DCC和40mlTHF构成的溶液。往得到的溶液通过滴入NMM调pH值到8。反应混合物0℃搅拌2小时后抽滤，滤液减压浓缩至干。得到的残余物用150ml乙酸乙酯溶解、置于250ml分液漏斗中、依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗(30ml×6)、饱和氯化钠水溶液洗(30ml×3)、5％硫酸氢钾水溶液洗(30ml×5)、饱和氯化钠水溶液洗(30ml×3)。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到7.04g(96.1％)目标化合物，为无色固体。Mp189-191℃；ESI⁺/MS(m/e)581[M+H]⁺.

2)制备HCl·Trp-Trp-OBzl

将2.00g(3.44mmol)Boc-Trp-Trp-OBzl置于250ml圆底烧瓶中并用5ml乙酸乙酯溶解。冰浴下往得到的溶液中缓慢滴入16ml 4N HCl/EtOAc。反应混合物0℃搅拌1.5小时后，向其中加入无水乙醚使产物析出，静置，倾出上清液，反复数次后，过滤得到1.74g(97.8％)标化合物，为无色固体。Mp197-199℃；ESI⁺/MS(m/e)481[M+H]⁺.

3)制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl

冰浴冷却下往置于100ml圆底烧瓶中的由517mg(1.00mmol)HCl·Trp-Trp-OBzl、208mg(1.10mmol)Boc-Ala-OH和149mg(1.10mmol)HOBt与15ml THF构成的溶液中滴入272mg(1.20mmol)DCC和5ml THF构成的溶液。往得到的溶液通过滴入NMM调pH值到8。反应混合物0℃搅拌2小时后抽滤，滤液减压浓缩至干。得到的残余物用50ml乙酸乙酯溶解、置于100ml分液漏斗中、依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗(30ml×6)、饱和氯化钠水溶液洗(30ml×3)、5％硫酸氢钾水溶液洗(30ml×5)、饱和氯化钠水溶液洗(30ml×3)。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到641mg(98.5％)目标化合物，为无色固体。Mp202-204℃；ESI⁺/MS(m/e)652[M+H]⁺.

4)制备Ala-Trp-Trp-OBzl

将500mg(0.778mmol)Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl置于100ml圆底烧瓶中并用2ml乙酸乙酯溶解。冰浴下往得到的溶液中缓慢滴入5ml 4NHCl/EtOAc。反应混合物0℃搅拌1小时后，向其中加入无水乙醚使产物析出，静置，倾出上清液，反复数次后，过滤得到449mg(98％)目标化合物，为无色固体。Mp205-207℃；ESI⁺/MS(m/e)552[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=11.03$ (c＝1，CH₃OH)；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝10.885(m，2H)，8.690(d，J＝7.3Hz，1H)，8.591(d，J＝8.1Hz，1H)，7.652(d，J＝7.8Hz，1H)，7.502(d，J＝7.8Hz，1H)，7.153(m，13H)，5.033(m，2H)，4.675(m，2H)，3.773(m，1H)，3.092(m，4H)，1.319(m，3H).

实施例2制备Gly-Trp-Trp-OBzl(GWW)

1)制备Boc-Gly-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由193mg(1.10mmol)Boc-Gly制得414mg(65.0％)目标化合物，为无色固体。Mp206-208℃；ESI⁺/MS(m/e)638[M+H]⁺.

2)制备Gly-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.785mmol)Boc-Gly-Trp-Trp-OBzl制得446mg(99.1％)目标化合物，为无色固体。Mp201-203℃；ESI⁺/MS(m/e)538[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=8.23$ (c＝1，CH₃OH)；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝10.973(s，1H)，10.890(s，1H)，8.805(d，J＝7.3Hz，1H)，8.659(d，J＝8.3Hz，1H)，7.625(d，J＝7.9Hz，1H)，7.514(d，J＝7.9Hz，1H)，7.183(m，13H)，5.059(m，2H)，4.681(m，2H)，3.146(m，6H).

实施例3制备Phe-Trp-Trp-OBzl(FWW)

1)制备Boc-Phe-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作由292mg(1.10mmol)Boc-Phe制得682mg(93.8％)目标化合物，为无色固体。Mp200-202℃；ESI⁺/MS(m/e)728[M+H]⁺.

2)制备Phe-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.688mmol)Boc-Phe-Trp-Trp-OBzl制得432mg(97.5％)目标化合物，为无色固体。Mp199-201℃；ESI⁺/MS(m/e)628[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=11.23$ (c＝1，CH₃OH)；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝10.962(m，2H)，8.965(d，J＝8.0Hz，1H)，8.795(d，J＝7.2Hz，1H)，7.642(d，J＝7.9Hz，1H)，7.523(d，J＝11.4Hz，1H)，7.179(m，18H)，5.032(m，2H)，4.679(m，2H)，3.408(m，1H)，3.096(m，6H).

实施例4制备Leu-Trp-Trp-OBzl(LWW)

1)制备Boc-Leu-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作由254mg(1.10mmol)Boc-Leu制得675mg(97.4％)目标化合物，为无色固体。Mp206-208℃；ESI⁺/MS(m/e)694[M+H]⁺.

2)制备Leu-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.721mmol)Boc-Leu-Trp-Trp-OBzl制得450mg(99.2％)目标化合物，为无色固体。Mp222-224℃；ESI⁺/MS(m/e)594[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=15.76$ (c＝1，CH₃OH)；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝10.905(m，2H)，8.751(d，J＝8.1Hz，1H)，8.703(d，J＝7.2Hz，1H)，7.625(d，J＝7.9Hz，1H)，7.492(d，J＝7.9Hz，1H)，7.152(m，13H)，5.023(m，2H)，4.633(m，2H)，3.748(m，1H)，3.147(m，4H)，1.590(m，1H)，0.893(m，6H).

实施例5制备Ile-Trp-Trp-OBzl(IlWW)

1)制备Boc-Ile-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由254mg(1.10mmol)Boc-Ile制得687mg(99.2％)目标化合物，为无色固体。Mp212-214℃；ESI⁺/MS(m/e)694[M+H]⁺.

2)制备Ile-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.721mmol)Boc-Ile-Trp-Trp-OBzl制得429mg(94.6％)目标化合物，为无色固体。Mp228-230℃；ESI⁺/MS(m/e)594[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=17.00$ (c＝1，CH₃OH)；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝10.970(m，2H)，8.706(d，J＝7.2Hz，1H)，8.640(d，J＝8.0Hz，1H)，7.235(m，13H)，5.029(m，2H)，4.671(m，2H)，3.456(m，1H)，3.112(m，4H)，1.252(m，1H)，1.070(m，2H)，0.818(m，6H).

实施例6制备Val-Trp-Trp-OBzl(VWW)

1)制备Boc-Val-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由239mg(1.10mmol)Boc-Val制得642mg(95％)目标化合物，为无色固体。Mp210-212℃；ESI⁺/MS(m/e)680[M+H]⁺.

2)制备Val-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.736mmol)Boc-Val-Trp-Trp-OBzl制得440mg(97％)目标化合物，为无色固体。Mp200-202℃；ESI⁺/MS(m/e)580[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=13.43$ (c＝1，CH₃OH)；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝10.895(m，2H)，8.710(d，J＝7.3Hz，1H)，8.574(d，J＝7.9Hz，1H)，8.637(d，J＝7.9Hz，1H)，7.480(d，J＝7.9，1H)，7.176(m，13H)，5.042(m，2H)，4.722(dd，J＝5.4Hz，J＝13.5Hz，1H)，4.631(dd，J＝7.1Hz，J＝14.3Hz，1H)，3.599(m，1H)，3.146(m，4H)，2.075(m，1H)，0.899(m，6H).

实施例7制备Ser-Trp-Trp-OBzl(SWW)

1)制备Boc-Ser-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由226mg(1.10mmol)Boc-Ser-OH制得563mg(84.4％)目标化合物，为无色固体。Mp195-197℃；ESI⁺/MS(m/e)668[M+H]⁺.

2)制备Ser-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.750mmol)Boc-Ser-Trp-Trp-OBzl制得418mg(92.4％)目标化合物，为无色固体。Mp218-220℃；ESI⁺/MS(m/e)568[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=25.37$ (c＝1，CH₃OH)；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝10.972(m，2H)，8.703(m，2H)，7.283(m，15H)，5.081(m，2H)，4.631(m，2H)，4.087(m，2H)，3.450(m，1H)，3.140(m，4H).

实施例8制备Thr-Trp-Trp-OBzl(TWW)

1)制备Boc-Thr-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由241mg(1.10mmol)Boc-Thr制得580mg(85.2％)目标化合物，为无色固体。Mp190-192℃；ESI⁺/MS(m/e)682[M+H]⁺.

2)制备Thr-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.734mmol)Boc-Thr-Trp-Trp-OBzl制得429mg(95％)目标化合物，为无色固体。Mp195-197℃；ESI⁺/MS(m/e)582[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=6.10$ (c＝1，CH₃OH)；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝10.948(m，2H)，7.307(m，15H)，5.061(m，2H)，4.645(m，2H)，3.631(m，1H)，3.388(m，2H)，3.128(m，4H)，1.148(m，3H).

实施例9制备Tyr-Trp-Trp-OBzl(YWW)

1)制备Boc-Tyr-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由309mg(1.10mmol)Boc-Tyr制得708mg(95.3％)目标化合物，为无色固体。Mp220-222℃；ESI⁺/MS(m/e)744[M+H]⁺.

2)制备Tyr-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.673mmol)Boc-Tyr-Trp-Trp-OBzl制得449mg(98.1％)目标化合物，为无色固体。Mp207-209℃；ESI⁺/MS(m/e)644[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=9.77$ (c＝1，CH₃OH)；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝10.868(m，2H)，8.764(d，J＝7.3Hz，1H)，8.730(d，J＝8.2Hz，1H)，7.652(d，J＝8.0Hz，1H)，7.519(d，J＝7.9Hz，1H)，7.051(m，17H)，5.006(m，2H)，4.696(m，2H)，3.898(m，1H)，3.035(m，6H).

实施例10制备Pro-Trp-Trp-OBzl(PWW)

1)制备Boc-Pro-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由237mg(1.10mmol)Boc-Pro制得654mg(97％)目标化合物，为无色固体。Mp182-184℃；ESI⁺/MS(m/e)678[M+H]⁺.

2)制备Pro-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.739mmol)Boc-Pro-Trp-Trp-OBzl制得451mg(99％)目标化合物，为无色固体。Mp182-184℃；ESI⁺/MS(m/e)578[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=16.73$ (c＝1，CH₃OH)；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝10.903(s，1H)，10.862(s，1H)，8.716(m，2H)，7.642(d，J＝7.9Hz，1H)，7.507(d，J＝7.9Hz，1H)，7.167(m，13H)，5.047(m，2H)，4.652(m，2H)，4.074(m，1H)，3.171(m，6H)，1.777(m，4H).

实施例11制备Met-Trp-Trp-OBzl(MWW)

1)制备Boc-Met-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由274mg(1.10mmol)Boc-Met制得692mg(97.3％)目标化合物，为无色固体。Mp218-220℃；ESI⁺/MS(m/e)712[M+H]⁺.

2)制备Met-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.703mmol)Boc-Met-Trp-Trp-OBzl制得448mg(98.4％)目标化合物，为无色固体。Mp215-217℃；ESI⁺/MS(m/e)612[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=7.77$ (c＝1，CH₃OH)；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝10.988(m，2H)，8.782(d，J＝7.3Hz，1H)，8.727(d，J＝7.9Hz，1H)，7.737(d，J＝7.8Hz，1H)，7.654(d，J＝7.8Hz，1H)，7.181(m，13H)，5.044(m，2H)，4.698(dd，J＝7.3Hz，J＝14.2Hz，1H)，4.614(dd，J＝7.3Hz，J＝14.2Hz，1H)，3.189(m，5H)，2.011(m，3H)，1.621(m，4H).

实施例12制备Glu(OBzl)-Trp-Trp-OBzl(EWW)

1)制备Boc-Glu(OBzl)-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由370mg(1.10mmol)Boc-Glu(OBzl)制得469mg(58.7％)目标化合物，为无色固体。Mp202-204℃；ESI⁺/MS(m/e)800[M+H]⁺.

2)制备Glu(OBzl)-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.626mmol)Boc-Glu(OBzl)-Trp-Trp-OBzl制得455mg(99％)目标化合物，为无色固体。Mp214-216℃；ESI⁺/MS(m/e)700[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=20.17$ (c＝1，CH₃OH)¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝10.915(m，2H)，8.782(d，J＝7.2Hz，1H)，8.720(d，J＝7.7Hz，1H)，7.658(d，7.8Hz，1H)，7.498(d，7.8Hz，1H)，7.173(m，18H)，5.018(m，4H)，4.670(m，2H)，3.814(m，1H)，3.082(m，4H)，2.557(m，2H)，2.062(m，2H).

实施例13制备Asp(OBzl)-Trp-Trp-OBzl(DWW)

1)制备Boc-Asp(OBzl)-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由355mg(1.10mmol)Boc-Asp(OBzl)制得473mg(60％)目标化合物，为无色固体。Mp208-210℃；ESI⁺/MS(m/e)786[M+H]⁺.

2)制备Asp(OBzl)-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.637mmol)Boc-Asp(OBzl)-Trp-Trp-OBzl制得450mg(97.9％)目标化合物，为无色固体。Mp210-212℃；ESI⁺/MS(m/e)686[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=10.03$ (c1，CH₃OH)；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝10.933(m，2H)，8.757(d，J＝7.9Hz，1H)，7.730(d，J＝7.3Hz，1H)，7.305(m，20H)，5.070(m，4H)，4.644(m，2H)，3.346(m，1H)，3.152(m，4H)，2.933(m，2H).

实施例14制备Cys(4-OMeBzl)-Trp-Trp-OBzl(CWW)

1)制备Boc-Cys(4-OMeBzl)-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由375mg(1.10mmol)Boc-Cys(4-OMeBzl)制得801mg(99％)目标化合物，为无色固体。Mp221-223℃；ESI⁺/MS(m/e)804[M+H]⁺.

2)制备Cys(4-OMeBzl)-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.623mmol)Boc-Cys(4-OMeBzl)-Trp-Trp-OBzl制得441mg(96％)目标化合物，为无色固体。Mp219-221℃；ESI⁺/MS(m/e)704[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=14.43$ (c＝1，CH₃OH)；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝10.928(m，2H)，8.940(d，J＝7.9Hz，1H)，8.744(d，J＝7.9Hz，1H)，7.623(d，J＝7.9Hz，1H)，7.431(d，J＝7.9Hz，1H)，7.106(m，17H)，4.984(m，2H)，4.725(dd，J＝7.5Hz，J＝10.5Hz，1H)，4.593(dd，J＝7.5Hz，J＝10.5Hz，1H)，3.703(m，5H)，3.396(dd，J＝7.5Hz，J＝10.5Hz，1H)，2.996(m，6H).

实施例15制备Arg(NO₂)-Trp-Trp-OBzl(RWW)

1)制备Boc-Arg(NO₂)-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由351mg(1.10mmol)Boc-Arg(NO₂)制得317mg(40.6％)目标化合物，为无色固体。Mp207-209℃；ESI⁺/MS(m/e)782[M+H]⁺.

2)制备Arg(NO₂)-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.638mmol)Boc-Arg(NO₂)-Trp-Trp-OBzl制得445mg(97.2％)目标化合物，为无色固体。Mp188-190℃；ESI⁺/MS(m/e)682[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=18.00$ (c＝1，CH₃OH)；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝10.998(m，2H)，8.516(d，J＝7.5Hz，1H)，8.374(d，J＝7.4Hz，1H)，7.329(m，15H)，5.111(m，2H)，4.185(m，1H)，4.038(m，2H)，3.136(m，4H)，1.729(m，2H)，1.582(m，4H).

实施例16制备Lys(Z)-Trp-Trp-OBzl(KWW)

1)制备Boc-Lys(Z)-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由418mg(1.10mmol)Boc-Lys(Z)制得829mg(98.4％)目标化合物，为无色固体。Mp201-203℃；ESI⁺/MS(m/e)843[M+H]⁺.

2)制备Lys(Z)-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.594mmol)Boc-Lys(z)-Trp-Trp-OBzl制得459mg(99％)目标化合物，为无色固体。Mp193-195℃；ESI⁺/MS(m/e)743[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=14.77$ (c＝1，CH₃OH)¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝10.976(m，2H)，8.960(d，J＝7.9Hz，1H)，8.649(d，J＝7.3Hz，1H)，7.762(d，J＝7.9Hz，1H)，7.651(d，J＝7.9Hz，1H)，7.185(m，18H)，5.003(m，4H)，4.703(m，1H)，4.348(m，1H)，3.354(m，1H)，3.046(m，6H)，1.498(m，6H).

实施例17制备Gln-Trp-Trp-OBzl(QWW)

1)制备Boc-Gln-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由271mg(1.10mmol)Boc-Gln制得469mg(66.2％)目标化合物，为无色固体。Mp195-197℃；ESI⁺/MS(m/e)709[M+H]⁺.

2)制备Gln-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.706mmol)Boc-Gln-Trp-Trp-OBzl制得424mg(93.2％)目标化合物，为无色固体。Mp188-190℃；ESI⁺/MS(m/e)609[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=13.33$ (c＝1，CH₃OH)；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝10.873(m，2H)，8.782(d，J＝7.2Hz，1H)，8.705(d，J＝7.8Hz，1H)，7.588(m，2H)，7.171(m，13H)，5.017(m，2H)，4.667(m，2H)，3.879(m，1H)，3.171(m，4H)，2.270(m，2H)，1.956(m，2H).

实施例18制备Asn-Trp-Trp-OBzl(NWW)

1)制备Boc-Asn-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由255mg(1.10mmol)Boc-Asn制得633mg(91％)目标化合物，为无色固体。Mp190-192℃；ESI⁺/MS(m/e)695[M+H]⁺.

2)制备Asn-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.720mmol)Boc-Asn-Trp-Trp-OBzl制得431mg(94.9％)目标化合物，为无色固体。Mp199-201℃；ESI⁺/MS(m/e)595[M+H]⁺；

(c1，CH₃OH)；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝10.988(m，2H)，8.729(m，2H)，7.579(m，2H)，7.186(m，13H)，5.037(m，2H)，4.627(m，2H)，2.956(m，7H).

实施例19制备His-Trp-Trp-OBzl(HWW)

1)制备Boc-His(Boc)-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由391mg(1.10mmol)Boc-His(Boc)制得556mg(68.0％)目标化合物，为无色固体。Mp189-191℃；ESI⁺/MS(m/e)818[M+H]⁺.

2)制备His-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.612mmol)Boc-His(Boc)-Trp-Trp-OBzl制得361mg(90％)目标化合物，为无色固体。Mp211-213℃；ESI⁺/MS(m/e)618[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=16.43$ (c＝1，CH₃OH)；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝11.020(s，1H)，10.953(s，1H)，9.030(s，1H)，8.913(m，2H)，8.440(s，3H)，7.667(d，J＝7.9Hz，1H)，7.509(d，J＝7.9Hz，1H)，7.281(m，13H)，5.044(m，2H)，4.650(m，2H)，3.210(m，6H)，2.991(m，1H).

实施例20制备Trp-Trp-Trp-OBzl(WWW)

1)制备Boc-Trp-Trp-Trp-OBzl

按照制备Boc-Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由334mg(1.10mmol)Boc-Trp制得664mg(86.7％)目标化合物，为无色固体。Mp180-182℃；ESI⁺/MS(m/e)767[M+H]⁺.

2)制备Trp-Trp-Trp-OBzl

按照制备Ala-Trp-Trp-OBzl的操作，由500mg(0.653mmol)Boc-Trp-Trp-Trp-OBzl制得416mg(91％)目标化合物，为无色固体。Mp212-214℃；ESI⁺/MS(m/e)667[M+H]⁺； ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-6.73$ (c＝1，CH₃OH)；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ＝11.103(m，3H)，8.028(m，2H)，7.389(m，20H)，4.568(m，4H)，3.589(s，1H)，3.431(m，6H).

实验例1本发明化合物抗肿瘤细胞增殖活性评价实验

将生长状态良好、处于对数生长期的B16(小鼠黑色素瘤细胞)、HepG₂(肝细胞癌细胞)、K562(人慢性髓性白血病细胞)、S180(小鼠腹水型肉瘤细胞)、H22(小鼠腹水型肝癌细胞)细胞以5×10⁴个/ml密度接种于96孔板，每孔100μl，37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时，加入经灭菌处理的本发明化合物(实施例1-20所制备)溶液，对照组加入等体积溶剂。继续培养48小时后，每孔加25μl MTT(5mg/ml，四噻唑蓝)溶液，置于37℃孵育4小时，离心5min(2500rpm)，小心除去上清液后每孔加入100μl DMSO溶解紫色残留物(甲瓒)，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长570nm。按照公式“相对生存率＝(D含药-D空白)/(D对照-D空白)×100％”计算每一个样品浓度下的样品对肿瘤细胞的抑制率。实验重复3次，结果以(x±SD)表示。结果见表1。

表1本发明化合物的肿瘤细胞增殖抑制率(x±SD，％)

注：浓度：10μM；n＝6

实验例2本发明化合物抗小鼠S180肉瘤活性评价实验

在无菌条件下抽取接种6d后取生长旺盛S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1:2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数^[91]，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/ml；细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％；将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成1×10⁷个/ml的细胞悬液，于ICR雄性小鼠(体重20±2g)腋皮下接种0.2ml/只，制成实体瘤动物模型。本发明化合物及阳性对照均按8.9μmol/kg溶于5‰CMC-Na溶液，0.2ml/只，腹腔给药，每天一次，连续给药7天，共给药7次。空白对照腹腔给0.2ml5‰CMC-Na溶液，每天一次，连续给药7天，共给药7次。每日观察给药各组动物的反应小鼠的自主活动、精神状态、毛发、呼吸、饮食，粪便性状。连续给药7天后，于第8天脱颈椎处死小鼠，称取体重(处死体重)，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离，称瘤重。按“抑瘤率％＝[(阴性对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重]×100％”计算抑瘤率。结果见表2。

表2本发明化合物对S180荷瘤小鼠的抑瘤率结果(x±SD，n＝6)

注：与空白对照比较，^*表示P<0.05，^**表示P<0.01

实验例3本发明化合物治疗的荷S180肉瘤小鼠的毒性评价

每日观察给药各组动物的反应小鼠的自主活动、精神状态、毛发、呼吸、饮食，粪便性状。连续给药7天后，于第8天脱颈椎处死小鼠，称取体重(处死体重)，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离，剥离肿瘤后的小鼠采用称重，再解剖取出肝、脑、肾、和脾，称取肝重(g)、脑重(g)、肾重(g)、脾重(g)。按“体重增长(g)＝处死体重-原始体重-瘤重”计算体重增长。并按“脾指数(g/kg)＝脾重/处死体重”计算脾指数。实验结果见表3。给药后各组动物没有观察到出现文献报道的震颤、跳跃、抽搐、强直、仰卧、呼吸加快的症状。

表3本发明化合物对S180荷瘤小鼠各脏器指标的影响(x±SD，n＝12)

a)与空白对照组比较P<0.05；b)与空白对照组比较P<0.01；c)与空白对照组比较P<0.01，与阿糖胞苷组比较P<0.05；d)与空白对照及阿糖胞苷组比较P<0.01

实验例4本发明化合物NWW治疗的荷S180肉瘤小鼠的量效关系

选取活性最好的本发明化合物NWW在89μmol/kg，8.9μmol/kg和0.89μmol/kg三种剂量下评价对荷S180瘤小鼠治疗作用。实验结果见图2，结果表明NWW对肉瘤小鼠具有剂量依赖的治疗作用。

Claims (9)

1.具有抗肿瘤活性的氨基酰色氨酰色氨酸三肽苄酯，其结构为通式I所示：

AA-Trp-Trp-OBzl  I

其中，AA选自丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸残基。

2.一种制备权利要求1所述氨基酰色氨酰色氨酸三肽苄酯的方法，包括：

(1)将叔丁氧羰基保护的色氨酸和色氨酸苄酯耦联，合成叔丁氧羰基色氨酰色氨酸苄酯；

(2)脱去叔丁氧羰基色氨酰色氨酸苄酯的叔丁氧羰基，得到色氨酰色氨酸苄酯；

(3)将色氨酰色氨酸苄酯与叔丁氧羰基保护的氨基酸进行耦联，得到叔丁氧羰基氨基酰色氨酰色氨酸苄酯；

(4)脱去叔丁氧羰基氨基酰色氨酰色氨酸苄酯的叔丁氧羰基，即得。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中在二环己基羰二亚胺、N-羟基苯并三唑、N-甲基吗啉和无水四氢呋喃存在下将叔丁氧羰基保护的色氨酸和色氨酸苄酯耦联，合成叔丁氧羰基色氨酰色氨酸苄酯。

4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中在氯化氢/乙酸乙酯溶液中加入叔丁氧羰基色氨酰色氨酸苄酯，脱去叔丁氧羰基，得到色氨酰色氨酸苄酯。

5.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中在二环己基羰二亚胺、N-羟基苯并三唑、N-甲基吗啉和无水四氢呋喃存在下将色氨酰色氨酸苄酯与叔丁氧羰基保护的氨基酸进行耦联，得到叔丁氧羰基氨基酰色氨酰色氨酸苄酯。

6.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的叔丁氧羰基保护的氨基酸选自叔丁氧羰基保护的丙氨酸、叔丁氧羰基保护的天冬氨酸、叔丁氧羰基保护的谷氨酸、叔丁氧羰基保护的苯丙氨酸、叔丁氧羰基保护的甘氨酸、叔丁氧羰基保护的组氨酸、叔丁氧羰基保护的异亮氨酸、叔丁氧羰基保护的赖氨酸、叔丁氧羰基保护的亮氨酸、叔丁氧羰基保护的蛋氨酸、叔丁氧羰基保护的天冬酰胺、叔丁氧羰基保护的谷氨酰胺、叔丁氧羰基保护的精氨酸、叔丁氧羰基保护的丝氨酸、叔丁氧羰基保护的苏氨酸、叔丁氧羰基保护的缬氨酸、叔丁氧羰基保护的色氨酸或叔丁氧羰基保护的酪氨酸。

7.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(4)中在氯化氢/乙酸乙酯溶液中将叔丁氧羰基氨基酰色氨酰色氨酸苄酯脱去叔丁氧羰基。

8.一种治疗肿瘤的药物组合物，由有效量的权利要求1所述的氨基酰色氨酰色氨酸三肽苄酯和药学上可接受的辅料组成。

9.权利要求1所述的氨基酰色氨酰色氨酸三肽苄酯在制备抗肿瘤药物中的用途。

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