CN102159553A - 靶向氧氮自由基药剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了组合物和对清除自由基，尤其是对于线粒体选择性的有用的方法。该化合物包括一个连接在线粒体靶向基团上的含有氮氧自由基的基团。该化合物可以交联成二聚体而不丧失活性。本发明还提供了预防、缓解和治疗辐射引起的损伤的方法。根据本发明所述，该方法包括以有效预防、缓解或治疗辐射引起的损伤的一定数量和给药方案的方式将一种化合物输送给患者。

Description

靶向氧氮自由基药剂
技术领域
本发明提供了新型化合物和由含有一个氧氮自由基载体基团(也称含氧氮自由基基团)和一个线粒体靶向基团(也称靶向基团)的物质构成的组合物。该靶向基团被认为是不受任何限制的，具有将该组合物选择性的传递到线粒体的能力，同时可以将该氧氮自由基基团的抗氧化剂和自由基清除活性传递到细胞，包括然而并非仅限于在线粒体内富集。这些化合物一般可用作抗氧化剂，并具有自由基清除能力，而且，特别地，例如并且没有限制，具有辐射防护能力，同时能够预防并缓解退行性疾病。
背景技术
细胞内的氧化应激一般是通过生成活性氧类物质(“ROS”)和活性氮类物质(“RNS”)的方法来表达它自己。特别地，细胞呼吸途径会在细胞的线粒体膜内产生ROS和RNS，见kelso等人，具有氧化还原活性的泛醌对于细胞内线粒体的靶向选择性：抗氧化剂和抗细胞凋亡特性，J Biol Chem.276：4588(2001)。活性氧类物质包括自由基，含氧原子的活性阴离子，以及含有既可以产生自由基也可以被自由基进行化学活化的氧原子的分子。具体的例子包括超氧阴离子，羟自由基和氢过氧化物。许多疾病状态下，对于ROS和RNS产生的正常反应减弱了。
自然产生的酶，比如超氧化物歧化酶(″SOD″)和过氧化氢酶补救ROS和RNS自由基以使正常代谢活动得以进行。细胞稳态的重大偏差，比如失血性休克，会导致氧化应激状态，从而造成线粒体膜“电子漏”(“electron leakage”)。“电子漏”产生过量的ROS致使细胞天然抗氧化剂无法补偿。特别地，SOD不能容纳与通过细胞凋亡最终导致早发性线粒体机能障碍和细胞死亡的失血性休克有关的过剩的ROS，参见Kentner等人，在失血性休克早期利用TEMPOL抗氧化剂治疗提高小鼠存活率，J Trauma Inj Infect Crit Care.，968(2002)。
心磷脂(“CL”)是只在真核细胞的线粒体内膜中发现的一种阴离子磷脂，见Iverson，S.L.和S.Orrenius，心磷脂与细胞色素C之间的相互作用和细胞凋亡的线粒体调控，Arch Biochem.423：37-46(2003)。在正常状态下，促细胞凋亡蛋白质细胞色素C是通过与CL结合锚定在线粒体内膜上的，见Tuominen，E.K.J.，等人。磷脂与细胞色素c的相互作用：扩展脂质锚定的证据，JBiol Chem.，277：8822-8826(2002)。CL的酰基部分很容易受到活性氧类物质过氧化作用的影响。当线粒体内产生过量的ROS时，连接在CL上的细胞色素C可以起到氧化酶的作用，导致线粒体膜内的CL的大量过氧化反应，见Kagan，V.E.等人。细胞色素c用作释放促细胞凋亡因子所必需的心磷脂加氧酶，Nat Chem Biol.1：223-232(2005)；还有Kagan，V.E.等人，细胞凋亡的氧脂组学：细胞色素c对心磷脂和磷脂酰丝氨酸的氧化还原催化作用，Free Rad Biol Med.37：1963-1985(2005)。
CL的过氧化反应减弱了CL和细胞色素C之间的键合作用，见Shidoji，Y.等人，脂质过氧化作用引起的细胞色素C和心磷脂之间的分子间相互作用的减弱，Biochem Biophys Res Comm.264：343-347(1999)。这导致细胞色素C释放进入线粒体膜间腔，导致细胞程序性死亡。并且，CL的过氧化反应能有效的打开线粒体通透性转换孔(“MPTP”)，见Dolder，M.等人，接触位点的线粒体肌酸激酶：与孔蛋白和腺嘌呤核苷酸转位酶的相互作用，在通透性转换过程中的作用和对氧化损伤的敏感性，Biol Sign Recept.，10：93-111(2001)；也参见Imai，H.等人，利用线粒体/磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶防止低血糖致细胞凋亡过程中腺嘌呤核苷酸转运体的失活，Biochem J.，371：799-809(2003)。因此，线粒体膜膨胀和释放细胞色素C进入胞液。胞液内的过量的细胞色素C会导致细胞凋亡，见Iverson，S.L.等人，心磷脂-细胞色素C之间的相互作用和细胞凋亡的线粒体调控，Arch Biochem Biophys.423：37-46(2003)。
此外，线粒体机能障碍和细胞死亡最终可能导致多脏器功能衰竭，尽管进行了复苏治疗或补充供氧，参见Cairns，C，生命机器的紊乱：失血性休克的代谢途径，Curr Crit Care.，7：437(2001)。因此，需要有一种能够清除ROS并由此减少氧化应激的抗氧化剂。减少氧化应激可以延迟，甚至抑制，否则可能发生的诸如组织缺氧之类的生理状况。
同样，还存在改善抗氧化剂穿过细胞膜的渗透性的需要。SOD的局限性之一是它不能轻易穿过细胞膜。然而，氮氧自由基，如TEMPO(2，2，6，6-四甲基哌啶-N-氧)及其衍生物，已被证明比SOD更易穿过细胞膜。而且，例如但不仅限于氮氧自由基，TEMPO可以抑制ROS的生成，特别是超氧化物，这是由于线粒体电子传递链对羟胺自由基清除剂的还原作用，见Wipf，P.等人，选择性电子清除剂的线粒体靶向性：半短杆菌肽-TEMPO轭合物的合成和生物学分析，J Am Chem Soc.127：12460-12461。因此，TEMPO衍生物选择性传递可以导致有积极治疗意义的ROS的减少，而且由于细胞氧化应激的减少可以延迟或抑制细胞死亡。
选择性传送可以通过许多不同途径实现-例如，通过具有能够穿透细胞膜，并最终被线粒体膜捕获的特定靶向序列的生物学或化学成分实现。已经证实氮氧自由基SOD模拟化合物选择性传递进入线粒体膜是很难实现的。因此，需要能够有效和有选择性地将抗氧化剂传递给准确定位的线粒体及其膜和膜间隙，以帮助减少ROS类物质和RNS类物质。抗氧化剂也有助于抑制通常由活性氧类物质增加造成的细胞和线粒体的细胞凋亡活性，见Kelso.等人，具有氧化还原活性的泛醌对于细胞内线粒体的靶向选择性：抗氧化剂和抗细胞凋亡特性，J Biol Chem.，276：4588(2001)。美国专利NO.20070161573和20070161544的文献中描述了有关线粒体靶向抗氧化剂的示例。
目前仍然是非常需要一种可以传递不同类型载体到线粒体的组合物及其相关方法。在一个实施方案中，提供了一种包括具有很强的将线粒体连接到载体上的亲和力的膜活性肽基片段的组合物。载体的选择范围很大。需要有一种能够有效治疗线粒体膜内过量的线粒体ROS和RNS产物引起的疾病的组合物和方法。还需要有一种可以防止动物细胞和组织遭受辐射损伤的化合物。
辐照
暴露于致电离辐射(IR)的生物学后果包括基因组不稳定性和细胞死亡(Little JB，Nagasawa H，Pfenning T，等人，辐射致基因组不稳定：X射线和α粒子的延时致突性和细胞遗传学效应。Radiat Res 1997；148：299-307)。据推测，辐解产生的自由基是红外损伤(IR)的主要原因。水直接辐解和次级短寿命(10-10～10-6s)活性中间体介导的化学反应会导致细胞大分子，包括DNA和蛋白质，以及膜磷脂的损伤(Mitchell JB，Russo A，Kuppusamy P，等人，辐射、自由基及其成像，Ann N Y Acad Sci 2000；899：28-43)。DNA被认为是自由基的主要攻击目标，导致DNA单，双链断裂(Bryant PE.哺乳动物细胞DNA的酶限制：潜在致命性病变的双链断裂的证据，Int J Radiat Biol 1985；48：55-60)。为了保持基因组的完整性，DNA修复和细胞周期检验点调控的多种途径应辐射致DNA损伤而被激活(Elledge SJ.细胞周期检验点：防止身份危机。Science 1996；274：1664-1672)。这些修复和调控系统发生故障导致遗传毒性，恶性病变和细胞死亡(Sachs RK，Chen AM，Brenner DJ.致电离辐射产生的染色体畸变的邻近效应。Int J Radiat Biol 1997；71：1-19)。
IR致细胞死亡的主要机制之一是细胞凋亡，最常见的是通过线粒体依赖性内在途径实现(Newton K，Strasser A.致电离辐射和化疗药物在无Fas或FADD/MORT1信号条件下引起淋巴细胞凋亡。癌症治疗医学J Exp Med 2000；191：195-200)。后者包括继之以作为死亡程序执行的关键事件的细胞色素C和其他促细胞凋亡因子(Smac/Diablo[第二线粒体衍生的半胱天冬酶(caspase，全称是天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶)激活剂/低pI细胞凋亡结合蛋白的直接抑制剂]，EndoG[内切酶G]，Omi/HtrA2[丝氨酸蛋白酶]，和AIF[细胞凋亡诱导因子])的释放进入胞液的线粒体的通透性。细胞色素c的释放有利于通过与细胞凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf-1)相互作用形成凋亡小体，然后募集并活化半胱天冬酶-9的前体(procaspase-9)和启动蛋白质水解级联反应，最终导致细胞分裂。促凋亡因子和半胱天冬酶(caspase)的激活释放意味着不可逆细胞凋亡过程的开始。因此，以防止这些病症的发生为目的的药物开发研究是很有意义的，特别是预防线粒体损伤表达的临界点的出现(Szewczyk A，Wojtczak L，作为药理学靶点的线粒体。Pharmacol Rev 2002；54：101-127)。然而，对于细胞色素c从线粒体释放的确切机制仍然知之甚少。据推测，可能通过干扰电子传递而产生的活性氧类物质(ROS)对于促进细胞色素c从线粒体释放具有关键性作用(KowaltowskiAJ，Castilho RF，Vercesi AE。在有Ca2+存在条件下，通过解偶联或无机磷酸盐开启线粒体通透性转换孔取决于线粒体产生的活性氧类物质。FEBS Lett 1996；378：150-152)。显而易见，ROS能够致使体外和体内线粒体膜产生通透性，并且线粒体膜转换孔被证明具有氧化还原敏感性(Kroemer G，Reed JC，细胞死亡的线粒体调控。Nat Med 2000；6：513-519)。
相反，抗氧化剂和还原剂，锰超氧化物歧化酶(MnSOD)(Wong GH，Elwell JH，Oberley LW，等人。含Mn2+超氧化物歧化酶是细胞抵抗肿瘤坏死因子的细胞毒性细胞必不可少的。Cell 1989；58：923-931)，和硫氧还蛋白(Iwata S，Hori T，Sato N，等人。成人型T细胞白血病(ATL)-衍生因子/人类硫氧还蛋白可以抑制由于L-胱氨酸和谷胱甘肽耗竭导致的淋巴样细胞的细胞凋亡：硫醇介导的氧化还原作用可能参与调控促氧化状态引起的细胞凋亡，J Immunol 1997；158：3108-3117)的超量表达可以延迟或抑制细胞凋亡。以往的研究表明，在细胞凋亡早期，线粒体专有磷脂-心磷脂(CL)的从线粒体膜内移位到线粒体膜外，然后活化的细胞色素c进入CL专有过氧化物酶(Fernandez MG，Troiano L，Moretti L，等。细胞凋亡过程中线粒体内心磷脂分布的早期变化，Cell Growth Differ 2002；13：449-455以及KaganVE，Tyurin VA，Jiang J，等。作为促细胞凋亡因子释放所必须的心磷脂加氧酶的细胞色素c。Nat Chem Biol 2005；1：223-232)。活化的细胞色素c利用产生的ROS进一步催化CL的氧化(Kagan VE，Tyurin VA，Jiang J，等人。作为促细胞凋亡因子释放所必须的心磷脂加氧酶的细胞色素c。Nat Chem Biol 2005；1：223-232)。最重要的是，氧化CL是线粒体释放细胞色素c一个重要来源(Kagan VE，Tyurin VA，Jiang J，等，作为促细胞凋亡因子释放所必须的心磷脂加氧酶的细胞色素c。Nat Chem Biol 2005；1：223-232和Petrosillo G，Casanova G，Matera M，等人。过氧化心磷脂与鼠心肌细胞线粒体膜的相互作用：通透性转换和细胞色素c释放的诱导。FEBS Lett 2006；580：6311-6316)，这可能是由于这种磷脂和细胞色素c之间相互作用的微环境的变化造成的(Ott M，Robertson JD，Gogvadze V，等人。细胞色素c从线粒体释放分两个步骤进行。Proc Natl Acad Sci USA 2002；99：1259-1263和Garrido C，Galluzzi L，Brunet M，等人。线粒体释放细胞色素C的机制。Cell Death Differ 2006；13：1423-1433)和/或氧化CL会同Bcl-2家族蛋白(Bid，Bax/Bak)，以及腺嘌呤核苷酸转位分子(ANT)和压敏性阴离子通道(VDAC)，参与线粒体通透性转换孔(MTP)的形成(Petrosillo G，Casanova G，Matera M，等。过氧化心磷脂与鼠心肌细胞线粒体膜的相互作用：通透性转换和细胞色素c释放的诱导。FEBS Lett 2006；580：6311-6316。FEBS Lett 2006；580：6311-6316和Gonzalvez F，GottliebE.心磷脂：设置细胞凋亡过程。Apoptosis 2007；12：877-885)。除了其在细胞凋亡信号通路的重要作用外，ROS还涉及旁观者效应的永久性(Narayanan PK，Goodwin EH，Lehnert BE.α粒子启动人类细胞中超氧化物阴离子和过氧化氢的生物生产。Cancer Res 1997；57：3963-3971和Iyer R，Lehnert BE.通过旁观者对α粒子的反应而与细胞生长相关的潜在因素，Cancer Res 2000；60：1290-1298)和辐照后基因组的不稳定性(Spitz DR，Azzam EI，Li JJ，等。代谢氧化/还原反应与致电离辐射的细胞反应：一种应激反应生物学的统一概念。Cancer Metastasis Rev 2004；23：311-322；Limoli CL，Giedzinski E，Morgan WF，等。染色体不稳定的细胞中的持久性氧化应激。Cancer Res 2003；63：3107-3111；以及Kim GJ，Chandrasekaran K，Morgan WF.线粒体机能障碍，活性氧类物质和辐射致基因组不稳定性水平的持续升高：综述。Mutagenesis 2006；21：361-367)。因此，通过抗氧化剂清除细胞内ROS，尤其是它的主要来源，线粒体ROS，的抗氧化剂，可能是一个发展辐射防护药剂和辐射缓解药剂的重要机遇。防红外抗氧化剂的研究已经超过50年(Weiss JF，Landauer MR。辐射防护抗氧化剂。Ann N Y Acad Sci 2000；899：44-60)。
致电离辐射诱导细胞死亡的主要机制之一是细胞凋亡，这通常是通过线粒体依赖性内在途径实现。由细胞色素C(″cyt c″)催化心磷脂氧化反应，细胞色素C和其他促凋亡因子释放进入胞液，随后的半胱天冬酶(caspase)活化是在表明细胞凋亡不可逆阶段开始的死亡程序的执行中的关键事件。
在Belikova，NA，等人的文章中，(辐照致细胞凋亡过程中线粒体内细胞色素C的心磷脂专有过氧化物酶反应，Int。J.Radiation Oncology Biol.Phys.，Vol.69，No.1，pp.176-186，2007)，一种用于处理细胞色素c含量较低的HeLa细胞(14％，HeLa1.2细胞)的小干扰RNA(siRNA)途径。细胞经γ-射线处理(剂量为5-40Gy)。用电喷雾离子阱质谱分析法和高效液相色谱一Amplex Red荧光检测法分析脂质氧化。促凋亡因子(cyt c，Smac/DIABLO)的释放用蛋白质印迹法检测。细胞凋亡通过半胱天冬酶(caspase)-3/7活化和磷脂酰丝氨酸外翻表现出来。这表示辐照引起氢过氧化物选择性积累是在心磷脂(CL)内而不是在其他磷脂内。HeLa1.2细胞的反应是辐照致CL氧化产物的积累比亲代HeLa细胞低。在照射后的细胞色素C缺陷细胞中检测出促凋亡因子(Smac/DIABLO)的释放成比例下降。其结论是细胞色素C是CL过氧化反应的一种重要的催化剂，对凋亡程序的执行至关重要。辐照致细胞凋亡中细胞色素C的这种新的作用对于开发新的辐射防护药剂和放射增敏剂极为重要。
重大的药物开发研究已经直接针对这些事件的预防，特别是代表一个重要的不可逆转点的线粒体损伤。虽然确切的机制仍然没有得到很好的理解，但是在细胞色素c/心磷脂复合物的过氧化物酶作用下活性氧类物质的生成(ROS)和心磷脂的氧化被认为是在促进细胞色素c从线粒体中释放中起到了关键作用。ROS-超氧自由基歧化(通过超氧歧化酶)生成H2O2-以供过氧化物酶循环之用，并有利于氧化心磷脂的积累。因此，通过电子和自由基清除剂清除细胞内的ROS，尤其是其主要来源-线粒体ROS，为开发辐射防护药剂和辐射缓解药剂提供了很有希望的机遇。辐射防护领域中所进行的重大的研究是利用抗氧化剂对抗致电离辐射(Weiss等人，用抗氧化剂进行辐射防护。Ann N Y AcadSci 2000；899：44-60)。
一类新型抗氧化剂，稳定的氮氧自由基，由于其直接清除自由基的多重性能以及类似催化酶的机制已被列为强力辐射防护药剂(Saito等。自旋标记物，TEMPOL与OH自由基的两个反应位点。J Pharm Sci 2003；92：275-280；Mitchell等人。具有生物学活性的金属离子非依赖性超氧化物歧化酶模拟化合物。Biochemistry 1990；29：2802-2807)。TEMPOL(4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶-N-氧基)是一种已经被广泛研究的在体外和体内都具有辐射防护药剂特性的氮氧自由基(Mitchell等。氮氧自由基用作辐射防护药剂。Mil Med 2002；167：49-50；Hahn等人。体内辐射防护和稳定的氮氧自由基对血压的影响。Int J Radiat Oncol Biol Phys 1998；42：839-842。Mitchell等人。通过氮氧自由基超氧化物歧化酶模拟化合物-tempol抑制氧依赖性辐射致损伤，Arch Biochem Biophys 1991；289：62-70；Hahn等人。Tempol，一种稳定的自由基，是一种新的小鼠辐射防护药剂。Cancer Res 1992；52：1750-1753)。目前，TEMPOL在临床试验中，作为一种很受关注的辐射防护药剂用于癌症放射治疗过程中防止脱发。虽然被发现很有前途也较为有效，但是需要TEMPOL有高毫摩尔浓度，主要是由于其分配进入细胞和线粒体的量很少，这使其广泛应用受到限制(Gariboldi等。哌啶氮氧自由基Tempol-一种潜在的神经胶质瘤新型治疗剂在体外和体内作用的研究。Eur J Cancer 2003；39：829-837)。此外，已经证实辐照过程中TEMPOL一定会发挥其辐射防护作用(Mitchell等。辐射，自由基及其成像。Ann NY Acad Sci 2000；899：28-43；Mitchell等人。通过氮氧自由基超氧化物歧化酶模拟化合物-tempol抑制氧依赖性辐射致损伤。Arch Biochem Biophys 1991；289：62-70)，这表明，TEMPOL的保护机制受限于它与产生与辐射产生的短寿命辐射中间体之间的相互作用。
在自由基生成的部位的充足的抗氧化剂浓度对于优化保护策略是至关重要的。大量的研究表明，线粒体是ROS的第一来源和主要标靶(Orrenius S评论。线粒体介导的细胞死亡过程中的活性氧类物质。Drug Metab Rev 2007；39：443-455)。事实上，线粒体被看作是药物开发的重要标靶已很久(Szewczyk等人，线粒体作为药理学标靶。221 Pharmacol.Rev.54：101-127；2002；Garber K。靶向线粒体出现在治疗策略。J.Natl.Cancer Inst.97：1800-1801；2005)。
线粒体的靶向化合物的化学法包括使用蛋白质和肽，以及将有效成分负载于脂溶性阳离子化合物，磷酸三苯基膦，磺脲类药物，蒽环类药物，及其他经证实或推测对线粒体具有亲和力的药剂上(Murphy MP。对线粒体具有靶向性生物活性的化合物。Trends Biotechnol.15：326-330；1997；Dhanasekaran等，线粒体超氧化物歧化酶模拟化合物抑制过氧化物引起的氧化性损伤及细胞凋亡：线粒体超氧化物的作用。Free Radic.Biol.Med.157 39：567-583；2005；Hoye等人，靶向线粒体。Acc.Chem.Res.41：87-97，2008)。然而，在撰写本发明的时候，尚无有关GS-氧氮自由基的证据被提供。
发明概述
目前仍然存在一种用于将各种类型的负载物，特别是抗氧化剂传递到线粒体的一种组合物及其相关方法的非常现实的需要。此处提供的是一种含有靶向性基团的化合物和一种含氮氧自由基基团的负载物以及含有该化合物的组合物。如下面示例所述，本发明所述的化合物和组合物可用于防护和治疗遭受致电离辐射，抗衰老疗法以及，受益于抗氧化剂治疗的常见疗法。这些化合物的示例见下文以及权利要求。
例如，抗γ-射线的线粒体共轭氮氧自由基(含-N-O·，-N-OH or N＝O的化合物和基团)的有效线粒体浓度可增加到亲代非共轭氮氧自由基的1000倍(并且其所要求的组织浓度可以从10mM减少1000倍到10μM)。线粒体靶向氮氧自由基在线粒体内富集已被EPR光谱学证实，并且用质谱分析了从用线粒体靶向氮氧自由基培养的细胞中获得的线粒体中的该氮氧自由基的含量。将线粒体靶向氮氧自由基输送到线粒体不依赖于线粒体膜电位。因此，线粒体靶向氮氧自由基不仅可以在完整的线粒体内积累，而且还可以在具有低膜电位的切断的或损伤的线粒体内积累。而且，线粒体靶向氮氧自由基的轭合物被输送到线粒体内不会影响线粒体膜电位。因此，他们不损害细胞内的主要线粒体功能和能量生产。此外，共轭氮氧自由基提供了一种重要的新功能-辐照后保护。
与其他氮氧自由基相似，共轭线粒体靶向氮氧自由基可潜在降低血压和交感神经活性。然而，与非共轭亲代氮氧自由基相比，大量减少线粒体靶向氮氧自由基的剂量(约1000倍)，可明显降低由其导致的副作用。
附图简述
图1提供了某些氮氧自由基的非限制性示例。logP值采用Molinspirations网站(www.molinspiration.com/cgi-bin/properties)的分子性质和类药性在线计算器估算。TIPNO＝t-丁基异丙基苯基氮氧自由基。
图2提供了本发明所参考的某些线粒体靶向抗氧化剂的结构的示例和TEMPOL的结构。
图3描述了TEMPO-半短杆菌肽轭合物的合成途径的示例。
图4显示了肌上皮细胞(MECs)内的氮氧自由基短杆菌肽S缩氨酸-TEMPO轭合物的结合和还原的EPR(电子顺磁共振)分析。
图5显示了异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FD4)的读数，反映了短杆菌肽-S TEMPO轭合物对深度失血性休克的大鼠肠黏膜通透性的影响。图5显示了反映短杆菌肽-S TEMPO轭合物对继深度失血性休克之后的大鼠肠黏膜通透性的影响的异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FD4)读数。该数据表示为相对于休克阶段输入生理盐水的对照样本的检测值的渗透率变化的百分比。图5A显示出TEMPOL用于肠道粘膜保护检测的“阳性对照”的FD4读数。图5B显示出体现肠道黏膜保护的TEMPO共轭XJB-5-208的FD4读数。图5C显示出含有TEMPO的有效基团，但是不能预防大出血引起的肠屏障功能障碍的XJB-5-125的FD4读数。图5D显示了不具有TEMPO的有效基团且不能预防大出血引起的肠屏障功能障碍的XJB-5-127的FD4读数。图5E显示出体现肠道黏膜保护的TEMPO共轭XJB-5-131的FD4读数。图5F显示出即使拥有与最活跃的化合物XJB-5-131相同的半短杆菌肽线粒体靶向基团，但不具有TEMPO的有效基团的XJB-5-133的FD4读数。图5G显示出具有TEMPO的有效基团但不能预防大出血引起的肠屏障功能障碍的XJB-5-197的FD4读数。图5H显示出不具有TEMPO的有效基团并且不能预防大出血引起的肠屏障功能障碍的XJB-5-194的FD4读数。
图6显示的氮氧自由基轭合物对放线菌素D(ActD)致细胞凋亡的影响示意图。图6A是从10000回肠细胞计算出的超氧化物产物的平均荧光强度的示意图。图6B是以膜联蛋白V阳性细胞百分率表示的磷脂酰丝氨酸外翻的示意图。图6C是以在其特异底物上的Z-DVED-AMC的量，以nmol/mg蛋白计，来表示的半胱天冬酶-3(caspase-3)活性的示意图。6D是一个用碘化丙啶荧光法显示的DNA片段示意图。图6E是在不同浓度的化合物5a(如图3所示)存在条件下PS外翻的示意图。图6F是在存在或不存在5a或2-脱氧葡萄糖的情况下线粒体内三磷酸腺苷(ATP)的含量示意图。图7显示了腔内XJB-5-131对大出血致肠黏膜内磷脂过氧化反应的影响。图7A是卵磷脂(“PC”)过氧化反应的示意图。图7b是一个关于磷脂酰乙醇胺(“PE”)过氧化反应活性的示意图。图7c是一个关于磷脂酰丝氨酸(“PS”)过氧化反应活性的示意图。图7D是一个关于心磷脂(“CL”)过氧化反应活性的示意图。
图8是腔内XJB-5-131的对半胱天冬酶3和7(caspase3和7)活性的影响的示意图。
图9是XJB-5-131对遭受到氧化应激的Caco-2BBe人类肠上皮样单层膜渗透性的示意图。该膜通透性以清除率(pL·h-l·cm2)表示。
图10A是XJB-5-131静脉治疗对遭受容量控制失血性休克的大鼠的MAP(平均动脉压，mm Hg)的影响示意图。图10B是XJB-5-131静脉治疗对遭受容量控制失血性休克的大鼠存活率的影响示意图。图11A是一个JP4-039合成途径示意图。图1B提供了结构式4中的化合物的合成路线如下。
图12表明，氮氧自由基轭合物XJB-5-125融合到细胞和线粒体，比存在于小鼠胚胎干细胞中的其亲代非共轭4-氨基-TEMPO更有效。(A)表明其与小鼠胚胎干细胞内其细胞和细胞线粒体融合效率，和(B)显示从线粒体回收的氮氧自由基的典型EPR谱图。
图13显示氮氧自由基共轭XJB-5-125防止小鼠胚胎细胞因γ射线导致超氧化物的产生和磷脂过氧化反应。(A)超氧化物的产生。细胞暴露于10Gyγ射线下。XJB-5-125(20μM)在辐照前10min或辐照后1h被添加到细胞内，并在培养5h后去除。细胞在指定的时间点用5μM的二氢埃托啡(DHE)培养30min。采用配有CellQuest软件的FACScan流式细胞仪进行溴乙非啶荧光性分析。10000个细胞的平均荧光强度是使用585-nm的带通滤波器取得的。(B)心磷脂的氧化。心磷脂的氢过氧化物采用高效液相色谱一Amplex Red荧光检测法测定。数据以平均值±标准差(n＝3)的形式表示。*p＜0.01对未辐照细胞；*p＜0.01(0.05)对在相同条件下经过XJB-5-125治疗的辐照细胞。插图是细胞内心磷脂的一个典型2D-HPTLC(二维高效薄层色谱法)剖面。
图14显示，显示氮氧自由基共轭XJB-5-125防止γ射线辐照引起细胞凋亡。(A)XJB-5-125阻断γ射线辐照引起的细胞色素c在小鼠胚胎细胞的胞液中的积累。(B)细胞色素c/肌动蛋白的密度比。采用实验室工作图像采集和分析软件(Labworks ImageAcquisition and Analysis Software，(UVP，Upland，CA))通过密度计量学对普带进行半定量分析。细胞色素c释放的水平表示为细胞色素c/肌动蛋白的平均密度比。(C)剂量(5，10和20μM)取决于XJB-5-125(预处理)对γ射线辐照(10Gy)致磷脂酰丝氨酸(PS)外翻的辐射防护作用。在辐照后培养48h后，取出细胞，并在流式细胞仪分析前用Annexin V-FITC试剂和碘化丙啶(PI)染色。(D)时间(2，3，4，5和6h)取决于XJB-5-125(20μM)对γ射线辐照(10Gy)引起的小鼠胚胎细胞内磷脂酰丝氨酸(PS)外翻(辐照后48h)的辐射防护效果。(E)XJB-5-125对γ射线辐照(10Gy)引起的人类支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞内磷脂酰丝氨酸(PS)外翻(辐照后48h)的辐射防护效果。在辐照前10min或辐照后1h，细胞用5-125(5或10μM)处理。辐照后72h对PS外翻进行分析。数据以平均值±标准差(n＝3)的形式表示。*(&)p＜0.01(0.05)对辐照后未经5-125处理的细胞；#p＜0.05对XJB-5-125预处理的细胞。
图15显示了氮氧自由基共轭XJB-5-125对γ射线辐照剂量/小鼠胚胎细胞的存活曲线的影响。细胞用XJB-5-125(20μM)在辐照前预处理10min或在辐照后处理1h，4h培养后将其清除。存活比率以相对于对照样本的平板效率进行计算。这些数据通过SigmaPlot9.0(SYSTAT软件)用多靶单击数学模型进行拟合。数据以平均值±标准差(n＝3)表示。
图16说明了GS共轭氮氧自由基，XJB-5-125，对γ射线剂量/32D cl 3小鼠造血细胞的存活曲线的影响。与32D cl 3细胞(0.797Gy)相比，在XJB-5-125或Tempol中培养的细胞，其Do(剂量)(分别为1.138or 1.209Gy，)增加了。在XJB-5-125中培养的细胞其存活曲线的肩区比tempol中培养的细胞的肩区值5.82增大了18.24n。
17A和17B是GS-氮氧自由基化合物JP4-039增加遭受全身辐照(9.75Gy)的小鼠的存活率曲线图。
图18是GS-氮氧自由基化合物JP4-039增加遭受全身辐照(9.5Gy)的小鼠的存活率曲线图。
图19显示GS-氮氧自由基化合物JP4-039对于辐照后24h的造血细胞是一种有效的辐射缓解剂。
图20显示(GS-氮氧自由基化合物)JP4-039对于KM101人骨髓基质细胞的辐照损伤是一种有效的辐射缓解剂。
图21A显示出脐带血移植I.V27天后，在所获得的NOD/SCID小鼠骨髓中的人类细胞的检测结果，该结果显示出流式细胞仪对于接受辐照，胫骨上端骨钻孔(见下文)，和人类脐带血注射之后的人类CD45+(浅灰色)造血细胞在NOD/SCID小鼠BM中的分析和识别。
图21B是在骨骺板近端下侧2mm的胫骨侧面的一个直径2mm的单侧骨皮质伤口用钻头施行外科手术7天后胫骨创伤的横截面显微照片。
图22是一个用于研究体外透皮量Bronaugh扩散系统示意图。
图23是显示24h后XJB-5-125传递进入小鼠的皮肤的示意图。
图24显示了从通过小鼠皮肤过滤后所获得的不同比率转录的GS-氮氧自由基的典型的EPR光谱。1-供体液，2-溶液A过滤6h后的受体液，3-溶液B过滤6h后的受体液，4-暴露于溶液A24h后的皮肤。介质，或皮肤(组织)胞液中的GS-氮氧自由基的EPR谱已经录入加有2mMK3Fe(CN)6的28.5％的乙腈中。
图25是展现了经过24hXJB-5-125穿过小鼠皮肤的累计透皮吸收曲线图。
图26A及图26B分别提供了化合物JED-E71-37和JED-E71-58的结构。
图27显示了用于研究确定XJB-5-131对类早衰Ercc1-/Δ小鼠出现早衰迹象的年龄的影响的一种治疗模式。XJB-5-131为2mg/kg，由10μg/μL的二甲基亚砜(DMSO)与50μL的葵花籽油的混合并腹腔注射制得。作为对照，同窝出生的Ercc1-/Δ小鼠只用等量的葵花籽油治疗，进行双盲双生子研究。
图28是采用图27中所述的方法，通过与对照样本(葵花籽油)相比较显示出XJB-5-131(在本图中为“XJB”)治疗对Ercc1-/ Δ小鼠的各种老化迹象出现年龄(几周内)的影响的一个简表。在本图中从小鼠5wks大开始直到它生命终结，对小鼠进行的持续治疗是每周三次。XJB柱中突出显示的细胞说明，相对于只用介质治疗的同基因对照组小鼠而言，用XJB治疗的小鼠与年龄有关的退行性改变的出现明显推迟。
图29中的条形图显示出经XJB-5-131(在本图中为“XJB”)治疗的或按照图27所述的方法用介质(葵花籽油)治疗的Ercc1-/Δ小鼠的椎间盘中的黏多糖(一种椎间盘维护和灵活性所必须的细胞外基质蛋白)含量。在本图中小鼠的从其5wks大开始直到它生命终结，对它进行的持续治疗是每周三次。
图30提供的照片显示出经XJB-5-131(80μg，在外用膏剂中乳化)治疗的或按照图27中所述的方法只用膏剂治疗的Ercc1-/Δ小鼠的(光)老化效应。本图中小鼠的持续治疗是在紫外线辐照后每天进行，持续五天。
图31A-B是经XJB-5-131或按照图27中所述的方法只用介质(葵花籽油)治疗的(A)雄性和(B)雌性Ercc1-/Δ小鼠的体重与年龄的函数关系的曲线图。XJB-5-131与其亲代化合物TEMPO一样不会导致体重降低。
图32提供了源自Ercc1-/-小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(“MEF”)的SA-β半乳糖苷酶(一种细胞衰老标记)染色显微照片，其MEF细胞在细胞固定和着色前用XJB-5-131(本图中称“XJB；”溶于介质500nM)或者单纯用介质连续处理48h。
图33提供的显微照片显示出源自Ercc1-/-小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(“MEF”)的γH2AX免疫反应染色(一种DNA双链断裂和细胞衰老的标志物)显微照片，其MEF细胞在细胞固定和着色前用XJB-5-131(本图中称“XJB；”溶于介质500nM)或者单纯用介质连续处理48h。
图34显示出源自Ercc1-/-小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(“MEF”)的凋亡，其MEF细胞在细胞固定和着色前用XJB-5-131(本图中称“XJB”；溶于介质500nM)或者单纯用介质连续处理48h。
图35提供的显微照片显示出不同剂量的JP4-039对源自Erccl-/-小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(“MEF”)的增殖和生长的影响。即使其浓度高达10μM JP4-039对细胞也没有毒性的。
图36提供的显微照片显示出不同剂量的JP4-039对源自野生型小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(“MEF”)的增殖和生长的影响。即使其浓度高达10μM JP4-039对细胞也没有毒性的。
图37提供的显微照片显示出源自Ercc1--Δ小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(“MEF”)中p16(细胞不可逆衰老的标志物)的水平，小鼠胚胎成纤维细胞(“MEF”)在细胞固定和免疫反应着色前用JP4-039(本图中“0-39”；溶于介质10μM)或者单纯用介质处理48h。
图38提供的显微照片显示出源自Ercc1-/-小鼠并生长在氧化应激条件下(20％氧)的小鼠的原代小鼠胚胎成纤维细胞(“MEF”)的细胞增殖，其MEF细胞在细胞固定和着色前用JED-E71-37，JED-E71-58(溶于介质1μM)或者单纯用介质持续处理48h。
图39提供的显微照片显示出源自Ercc1--Δ小鼠并生长在氧化应激条件下(20％氧)的小鼠胚胎成纤维细胞(“MEF”)的H2AX免疫反应染色(一种DNA双链的断裂和衰老的标志物)，其MEF细胞在细胞固定和着色前用JED-E71-58(溶于介质1μM)或者单纯用介质持续处理48h。
图40是氮氧自由基类似物的比较设计示意图。
图41是氮氧自由基类似物的各种比较设计合成途径示意图。
图42是1，1，3，3-四甲基吡咯烷基-2-基氧杂(TMIO)的可选择性氮氧自由基部分(单元)合成途径示意图。
图43是一个1-甲基2-氮杂金刚烷N-氧基(1-Me-AZADO)的可选择性氮氧自由基部分(单元)合成途径示意图。
发明详述
本发明所使用的用语“主体”是指动物界的成员，包括但不限于人类。用语“活性氧类物质”(ROS)包括但不限于，超氧化物阴离子、氢氧根和氢过氧化物自由基。
一种抗氧化剂型化合物这里定义为一种降低其它化合物氧化速率或阻止一种物质与氧气或含氧化合物反应的化合物。一种化合物可通过检测其降低分子氧化和/或细胞氧化应激后遗症的能力而被确定为抗氧化剂型化合物，例如但不限于，降低脂质过氧化作用和/或减少蛋白质或核酸的氧化性损伤能力。在一个实例中，一种抗氧化剂，其至少在一次检测抗氧化活性的测量中具有介于0.01和1000倍的抗坏血酸的抗氧化活性水平。
本发明提供的化合物和组合物，包括一个目标基团和一个负载物，如含氮氧自由基的基团。负载物可以是任何有用的化合物，如在医疗和化学领域的众所周知的抗氧化剂。负载物可包含一个具有抗微生物活性的因子。例如，目标基团可以与抗菌酶(如溶菌酶，或抗生素如青霉素)交联。其他用于将目标基团连接到负载物上的方法在该技术领域中众所周知。在一个实施方案中，负载物是一种抗氧化剂，如含氮氧自由基的基团。在另一实施方案中，由线粒体选择性靶向制剂输送的负载物可以包括一氧化氮合酶(NOS)活性抑制剂。负载物可以具有从抗氧化，抗辐射，防护，抗细胞凋亡，治疗，改良，NOS拮抗剂及其制品所构成的基团中选择的特性。在另一实施方案中，负载物可以具有抑制一氧化氮合成酶的酶活性的能力。这将有助于理解，本发明所述的组合物中可能用到各种各样的负载物。负载物的非定性的例子包括：2-氨基-6-甲基噻嗪，泛醌类似物，泛醌类似物片段成分，没有亲水端基的泛醌类似物片段成分，超氧化物歧化酶模拟化合物，超氧化物歧化酶生物模拟化合物以及salen-锰化合物。
虽然少量ROS的产生是细胞呼吸途径的一种典型的副产品，某些条件下，当ROS的量超过天然酶机制无法清除的不断产生的ROS的量时，包括疾病或其他病情可能会发生在患者身上。因此，清除细胞线粒体膜内产生的活性样类物质的化合物，组合物和方法是有用的，并且本发明提供了这些化合物，组合物和方法。这些化合物，组合物和方法具有能够清除过量产生的ROS，通常超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等等不能具备的效用。
在一个非限定性的实施方案中，该化合物具有如下结构：
Figure BPA00001330558900211
(结构式1)
期中X是
Figure BPA00001330558900212
和
Figure BPA00001330558900213
之一，R1，R2和R4各自是氢，C1～C6直链或支链烷基，选择性的包括苯基(C6H5)基团，选择性的是甲基，羟基或氟取代基，包括：甲基、乙基、丙基、2-丙基、丁基、t-丁基、戊基、己基、苄基、羟苄基(如4-羟苄基)、苯基和羟苯基。R3是-NH-R5、-O-R5或-CH2-R5，其中R5是包含-N-O·、-N-OH或N＝O的基团。在一个实施方案中R3是
Figure BPA00001330558900214
(1-Me-AZADO or 1-甲基2-氮杂金刚烷N-氧基)。在另一个实施方案中R3是
Figure BPA00001330558900215
(TMIO；1，1，3，3-四甲基异吲哚啉-2-基氧杂)。
R是-C(O)-R6、-C(O)O-R6、或or-P(O)-(R6)2，其中R6是C1～C6直链或支链烷基，可选择性的包括一个或多个苯基(-C6H5)基团，并可以选择性是甲基，乙基，羟基或氟取代，包括Ac(乙酰基，R＝-C(O-CH3)，Boc(R＝-C(O)O-t-丁基)，Cbz(R＝-C(O)O-苄基(Bn))基团。R还可以是一个二苯基磷酸酯基团，也就是R＝
Figure BPA00001330558900221
排除这是对映体XJB-5-208，在某些实施方案实施方案中，R1是t-丁基，R2和R4为氢。例如：
Figure BPA00001330558900222
在本发明中，除非另有说明，例如，本发明所描述的一个结构的所有的化合物和/或结构包括所有可能的立体异构体，单剂或其混合物。
如上所述，R5是含有-N-O·、-N-OH或-N＝O的基团(不仅是单独的-N-O·、-N-OH或-N＝O，而是包含如前所述诸基的基团，如TEMPO)。正如本领域普通技术人员所熟知的，氮氧自由基及氮氧自由基衍生物，包括TEMPOL及与TEMPO相关的衍生物是能够抵御生物环境的稳定自由基。因此，本发明提供的线粒体膜内的4-氨基-TEMPO、TEMPOL或其他氮氧自由基“有效载荷”可以用作一种从膜内产生的ROS的有效和高效的电子清除剂。这方面非限定性的例子包括TEMPO(2，2，6，6-四甲基-4-哌啶1-氧基)和TEMPOL(4-羟基-TEMPO)，在它们中间当与本发明所述及的化合物复合，如当R3是-NH-R5，-O-R5时：
Figure BPA00001330558900231
其他包含-N-O·，-N-OH or N＝O基团的非限制的例子列于表1及图1(摘自Jiang，J.，等。“优化靶向氮氧自由基的传递、氧化应激的抑制以及抗细胞凋亡活性的结构要求”，J PharmacolExp Therap.2007，320(3)：1050-60)。本领域普通技术人员采用常用交联剂和/或共轭化学品(如本发明所述的化学品)将这些化合物中的任意一种与其余的化合物进行键合(共价键连接)。表1提供了非限定性摘自超过300中市售确认的含-N-O·、-N-OH或N＝O基团的化合物，这些化合物可在本发明所述的化合物或组合物的制备过程中使用。
表1市售含-N-O·、-N-OH or N＝O的基团
Figure BPA00001330558900241
Figure BPA00001330558900251
Figure BPA00001330558900261
Figure BPA00001330558900271
Figure BPA00001330558900291
Figure BPA00001330558900301
Figure BPA00001330558900311
Figure BPA00001330558900321
根据一个实施方案，该化合物具有
Figure BPA00001330558900322
的结构或的结构，其中R是-NH-R1，-O-R1或-CH2-R1，R1是一种含-N-O·，-N-OH或N＝O的基团。在一个实施方案中R是-NH-R1，在另一个实施方案中R是-NH-TEMPO。
根据另一个实施方案，化合物具有结构
Figure BPA00001330558900331
(结构式2)
其中R1、R2和R3各自是氢、C1～C6的直链或支链烷基，可选择包括苯基(C6H5)基团，可选择甲基，羟基或氟取代的，包括2-甲基丙基，苄基，甲基，羟基或氟取代苄基，如4-羟基苄基。R4是含-N-O·，-N-OH或N＝O的基团。在一个实施方案中R4是
Figure BPA00001330558900332
(1-Me-AZADO或1-甲基2-氮杂金刚烷N-氧基)，在另一个实施方案实施方案中R4是
Figure BPA00001330558900333
(TMIO；1，1，3，3-四甲基异吲哚啉-2-基氧杂)。R是-C(O)-R5，-C(O)O-R5，或-P(O)-(R5)2，其中R5是C 1～C6的直链或支链烷基，可选择包括一个或多个苯基(-C6H5)基团，并可以选择是甲基，乙基，羟基或氟取代，包括Ac，Boc，和Cbz的基团。R也可以是二苯基磷酸酯基团，也就是R＝
Figure BPA00001330558900334
在某些具体的实施方案中，其中的R4是TEMPO，这种化合物具有A、A1、A2或A3(Ac＝Acetyl＝CH3C(O)-)的结构之一：
Figure BPA00001330558900341
根据另一个实施方案，化合物具有结构
Figure BPA00001330558900342
(结构式3)，其中R1、R2和R3各自是氢、C1～C6的直链或支链烷基，可选的是苯基(-C6H5)，并且可选择是甲基，乙基，羟基或氟取代基，包括2-甲基丙基，苄基，甲基，羟基或氟取代苄基，如4-羟苄基。R4是含-N-O·，-N-OH或N＝O的基团。在一个实施方案中，R4是
Figure BPA00001330558900343
(1-Me-AZADO或1-甲基2-氮杂金刚烷N-氧基)。在另一个实施方案实施方案中，R4是
Figure BPA00001330558900351
(TMIO；1，1，3，3-四甲基异吲哚啉-2-基氧杂)。R是-C(O)-R5，-C(O)O-R5，或-P(O)-(R5)2，R5是C1～C6的直链或支链烷基，可选的是含一个或多个苯基(-C6H5)，并且可选择的是甲基，乙基，羟基或氟取代基，包括Ac、Boc和Cbz基团。R也可以是二苯基磷酸酯基团，也就是R＝
Figure BPA00001330558900352
在某些具体的实施方案中，其中R4是TEMPO，这种化合物具有D，D1，D2，或D3(Ac＝乙酰基＝CH3C(O)-)的结构之一：
Figure BPA00001330558900353
在其他非限定性的实施方案中，这种化合物具有结构：(结构式4)，其中X是
Figure BPA00001330558900355
和
Figure BPA00001330558900356
之一，并且其中R1和R4各自是氢、C2～C6的直链或支链烷基、可选的是苯基(-C6H5)，优选的是甲基、羟基或氟取代的基团，包括甲基，乙基，丙基，2-丙基，丁基，t-丁基，戊基，己基，苄基，羟苄基(如4-羟苄基)苯基和羟苯基。R3是-NH-R5、-O-R5或-CH2-R5，其中R5是含-N-O·，-N-OH或N＝O的基团。在一个实施方案中，R3是
Figure BPA00001330558900361
(1-Me-AZADO或1-甲基氮杂金刚烷N-氧基)。在另一个实施方案中R3是
Figure BPA00001330558900362
(TMIO；1，1，3，3-四甲基异吲哚啉-2-基氧杂)。
R是-C(O)-R6，-C(O)O-R6，或-P(O)-(R6)2，其中R6是C1～C6的直链或支链烷基，可选包含一个或多个苯基(-C6H5)的基团，上述基团可选被甲基，乙基，羟基或氟取代的基团，包括AC(乙酰基R＝-C(O)-CH3)，Boc(R＝-C(O)O-t-丁基)，Cbz(R＝-C(O)O-benzyl(Bn))。R也可以是二苯基磷酸酯基团，也就是R＝
Figure BPA00001330558900363
在一个非限制性的实例中，该化合物具有
Figure BPA00001330558900364
的结构之一。在又一个非限制性的实施方案中，该化合物具有
Figure BPA00001330558900371
结构，其中R4是氢或甲基。
上述化合物，如结构式1所示，可以通过任何适用的方法合成。化合物JP4-039通过例8的方法合成。在一个实施方案中，本发明提供了制备结构式1的化合物的方法。合成该化合物采用如下步骤：
A、用一种含R1-C(O)-结构的醛与(R)-2-甲基丙烷基-2-亚磺酰胺反应生成一种亚胺。如
Figure BPA00001330558900372
在R1-C(O)-中，例如但不限于此，R1是C1～C6的直链或支链烷基，可选择的是苯基(-C6H5)，并且可选择的是甲基、羟基或氟取代的基团，包括甲基，乙基，丙基，2-丙基，丁基，叔丁基，戊，己基，苄基，羟苄基(如4-羟苄基)、苯基和羟苯基。
B、用端炔-1-醇(HCC-R2-CH2-OH)与叔丁基二苯基硅烷盐反应生成一种炔，如
Figure BPA00001330558900373
在HCC-R2-CH2-OH中，举例但不限于本例，R2可不出现或者R2是直链或支链的亚烃基，包括包括甲基、乙基、丙基炔烃。
C、用上述炔化合物与亚胺化合物在有机锆催化剂存在条件下反应(利用锆氢化反应)生成一种烯。如
Figure BPA00001330558900381
D1、将该烯烃酰化生产氨基甲酸酯，如
其中，例如但不限于本例，R3是C1～C6的直链或支链烷基，可选包含苯基(C6H5)的基团，上述诸基团可选甲基，羟基或氟取代的基团，包括：甲基、乙基、丙基、2-丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、苄基、羟苄基(如4-羟苄基)苯基和羟苯基；
D2、或者，将丙烯基环丙烷化然后将该烯烃进行丙烯酸酯化生成一种氨基丙烯酸酯，如
Figure BPA00001330558900383
其中，例如但不限于本例，R3是C1～C6的直链或支链的烷基，可选基团是苯基(C6H5)，上述诸基团可选被甲基、羟基或氟取代的基团，包括甲基、乙基、丙基、2-丙基、丁基、叔丁基，戊基、己基、苄基、羟基(如4-羟苄基)苯基和羟苯基；
E、从氨基甲酸酯中除去叔丁基二苯基甲硅烷基基团生成一种醇，如
Figure BPA00001330558900391
F、将醇氧化生成一种羧酸，如
G、将羧酸和由羟基或氨基构成的含氮氧自由基的化合物进行反应通过缩合反应生成抗氧化剂化合物，如
Figure BPA00001330558900401
其中，R4是-NH-R4或-O-R4，并且，如上文所述，R4是一种含有-N-O·、-N-OH或N＝O基团。
在另一个非限定性的实施方案中，提供了一种含有R1-R2-R3结构的化合物，其中R1和R3是具有-R4-R5结构的基团，R4是是一种线粒体靶向基团，R5是-NH-R6，-O-R6或-CH2-R6，其中R6是一种含-N-O·，-N-OH或N＝O的基团，如TEMPO。R1和R2可以相同或者不同。同样，R4和R5对于每一个R1和R3也可以是相同或者不同的。在一个非限定性的实施方案中，R2是一种具有对称性的链接剂。图26A和图26B中描绘了两种该化合物的例子。在一个实施方案中，R1和R2具有上文中结构式1、2或3及上文定义的所有基团包括A、A1、A2、A3、D、D1、D2和D3的结构，代表化合物为JED-E71-58，见图26B。在另一个实施方案中，R1和R2各自是短杆菌肽衍生物，如化合物JED-E71-37，见图26A。对本发明提供的短杆菌肽衍生物的例子，如XJB-5-131和XJB-5-125(见图2)，美国专利NO.20070161573和20070161544以及Jiang，J，等。在结构和功能方面有进一步详细的描述。(优化靶向氮氧自由基的传递、氧化应激的抑制以及抗细胞凋亡活性的结构要求，J Pharmacol Exp Therap.2007，320(3)：1050-60，还见于，Hoye，AT等.，靶向线粒体，Acc Chem Res.2008，41(1)：87-97，还见于，Wipf，P，等。，线粒体靶向选择性电子清除剂：半短杆菌肽--TEMPO轭合物的合成和生物学分析，(2005)J Am Chem Soc.2005，127：12460-12461)。XJB化合物可以连接成二聚体，例如但不限于本例，与BocHN基团(例如，像在XJB-5-131中)中的氮反应，或者与一种胺，如果存在，例如，如果一个或多个该化合物的氨基没有酰化生成一种酰胺(如NHBoc或NHCbx)。
在Jiang，J，等人(J Pharmacol Exp Therap.2007，320(3)：1050-60)，采用ActD致小鼠胚胎细胞凋亡模型，作者筛选了氮氧自由基库，以研究其抗氧化/抗凋亡特性、化学组成和三维(3D)结构之间的构效关系。高疏水性和有效的线粒体融合被认为是必要的，但是对氮氧自由基轭合物的高抗细胞凋亡/抗氧化剂活性是不充分的。通过设计构象预组织化的肽基氮氧自由基轭合物以及从实验(圆振二向色性和NMR)和理论(分子动力学)上表征其3D结构，他们证实β-转角/β-折叠二级结构的存在对所要求活性所必需的。脂膜模型的Monte Carlo模拟证实在半-GS类似物内D-Phe-Pro反转的保护能确保氮氧自由基组分在线粒体膜表面的具体定位并使其保护作用最大化。如本发明所述，探究氮氧自由基-肽以及-肽电子等排体轭合物之间的构效关系对于开发以新机理为基础的有宜于治疗的有效药物是有帮助的。
靶向基团R4可以是源自作用于细菌细胞壁的抗生素分子的膜活性肽片段。此类抗生素的例子包括：杆菌肽，短杆菌肽，缬氨霉素，恩镰孢菌素，丙甲菌素，白僵菌素，serratomolide，葚孢霉酯，短杆菌酪肽，多黏菌素，摩那菌素，和海鞘胎.源自抗生素的膜活性肽片段可包括完整的抗生素多肽、或其中具有膜，最好是线粒体靶向能力的某些部分，这是容易确定的，例如，采用放射性标记肽的细胞分隔实验。有用的短杆菌肽衍生膜活性肽片段是Leu-D-Phe-Pro-Val-Orn和D-Phe-Pro-Val-Orn-Leu半短杆菌肽片段。由于短杆菌肽是环状的，可以推测任何半短杆菌肽5-mer都可用作膜活性肽片段，包括Leu-D-Phe-Pro-Val-Orn、D-Phe-Pro-Val-Orn-Leu、Pro-Val-Orn-Leu-D-Phe、Val-Orn-Leu-D-Phe-Pro和Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val(源自短杆菌肽S)。任何较长大或较小的短杆菌肽片段，甚至包含重复短杆菌肽序列(例如Leu-D-Phe-Pro-Val-Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val-Orn-Leu-D-Phe-Pro)的较大片段预计对膜靶向性是有用的，并能容易地测试这种活性。在一个实施方案中，短杆菌肽-S衍生肽包含一个β-转角，这似乎赋予肽对线粒体的高亲和性。短杆菌肽的衍生物，或其他抗生素片段，包括电子等排体(分子或离子具有相同数目的原子基相同数目的价电子，因此，它们可以表现出类似的药代动力学和药效学性质)，如(E)-烯烃电子等排体(见关于示范合成方法的美国专利No.20070161573和20070161544)。正如短杆菌肽，杆菌肽、其他短杆菌肽，缬氨霉素，恩镰孢菌素，丙甲菌素，白僵菌素，serratomolide，葚孢霉酯，短杆菌酪肽，多黏菌素，摩那菌素，和海鞘胎的结构(氨基酸序列)是众所周知的，并且这些片段可以容易地制备，对于本领域的普通技术人员，它们的膜靶向性能力能容易确认。
烯烃电子等排体如短杆菌肽S的(E)-烯烃电子等排体(即半短杆菌肽)被用作靶向序列的一部分。见图3关于(E)-烯烃电子等排体的合成路线及关于相应化学结构的文献2。首先，炔烃(图3，化合物1)用Cp2ZrHCl进行锆氢化，然后是Me2Zn的转移金属化和N-Boc-异戊醛亚胺的加成反应。然后所得化合物(未显示)与四丁基氟化铵(“TBAF”)和乙醚的溶液作用，收率为74％。然后将所得的化合物用醋酸酐、三乙胺(TEA)和4-N，N1-(二甲氨基)吡啶(“DMAP”)处理，用色谱分离获得非对映烯酰胺混合物，收率为94％。最后使产品与K2CO3在甲醇中作用获得(E)-烯烃，标识为化合物2。然后，将图3中标识为化合物2的(E)-烯烃经多步氧化生成化合物3(图3)一个(E)-烯烃电子等排体的例子。
然后，用-乙基-3-(3-二甲氨基亚胺盐酸盐)(EDC)作为偶联剂，将图3的化合物3与肽H-Pro-Val-Orn(Cbz)-OMe共轭。这种肽是对细胞线粒体具有亲和性的靶向序列的一个适宜的例子。由此获得的产品在图3中显示为化合物4a。化合物4a皂化后与4-氨基-TEMPO(4-AT)偶联获得共轭产物，在图3中显示为化合物5a，其中Leu-DPhe肽键被一个(E)-烯烃取代。
在一个可选择实施方案中，图3中轭合物5b是通过皂化和肽4b(Boc-Leu-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-OMe)与4-AT偶联制备。类似地，图3中轭合物5c由标识为化合物3的(E)-烯烃电子等排体与4-AT偶联制备。这些肽和肽类似物是另外一些适宜的对细胞线粒体具有亲和性的靶向序列的例子。
在另一实施方案中，肽电子等排体可以用作轭合物。这些适宜的肽电子等排体是三元取代的(E)-烯烃肽电子等排体、和环丙烷肽电子等排体，以及所有的用于合成二元取代和三元取代的(E)-烯烃和环丙烷肽电子等排体的含有氢-或有机金属的内和端炔的亚胺加成产物。见Wipf等：用于合成三元取代(E)-烯烃和环丙烷肽电子等排体的内炔-亚胺加成反应，Adv Synth Catal.2005，347：1605-1613.据发现这些肽模拟化合物可以起到β-翻转促进剂的作用。见Wipf等：(E)-烯烃和环丙烷肽电子等排体的加合方法，Org Lett.2005，7(1)：103-106.
连接剂R2，可以是任何有用的连接剂，根据其活性基团选择，例如；羧基，烷氧基，氨基，巯基，酰胺等。通常情况下，除了其活性基团外，剩余部分没有反应活性(如饱和烷基或苯基)，不会在与整个化合物的活性有关的负面作用(功能丧失)方面对空间的或任何其他的物理或化学属性，如极性、亲水/疏水性产生干扰。在一个实施方案中，除了活性基团，该连接剂包含线性的或支化的饱和C4～C20烷基。在一个实施方案中，连接剂R2具有结构
Figure BPA00001330558900441
其中n＝4～18，包含期间所有的整数，在一个实施方案中n＝8～12，在另一个实施方案中，n＝10。
一个有机合成领域的技术人员利用任何可获得的化学品通过R1和R3交联就能合成这些化合物。在一个实施方案中，利用连接剂的端羧基与R1和R3(或者反过来)上的氨基脱水(缩合反应)，使R1和R3通过胺(肽键)连接形成R2。在一个实施方案中，R1和R3相同或者不同，并且根据所含的基团进行选择：XJB-5-131，XJB-5-125，XJB-7-75，XJB-2-70，XJB-2-300，XJB-5-208，XJB-5-197，XJB-5-194，.JP4-039和JP4-049，见图26A和26B的连接方式。
在一个治疗的实施方案中，提供了一种在主体(例如，一名需要自由基清除治疗的患者)中清除自由基的方法，包括向主体提供一定数量的一种或多种本发明描述的并含有一个自由基清除基团，如有效清除自由基的含氮氧自由基的基团。如上所述，许多疾病、病例或伤患可以通过提供自由基清除化合物得到改善、治疗或预防。正如在本发明中所阐述的。
在任何情况下，本发明所用的用于预防、缓解或治疗由于辐照引起的损伤的主体的任何药剂都以能有效的预防、缓解或治疗这种损伤的剂量提供，亦即，一种有效预防或减少辐照引起的损伤的持续时间和/或严重程度的剂量和给药方案。根据一个非限制性实施方案，从0.1或1mg/kg～100mg/kg的有效剂量范围，包括该范围内任何增量和范围，包括1mg/kg，5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg，25mg/kg，50mg/kg，and 75mg/kg。然而，对于本发明所描述的每一种化合物，有效剂量或剂量范围预计会因任何原因而使本发明所述及的其他化合物而各不相同。包括化合物的分子量、生物利用度、具体活性等等。例如，并不限于本例，XJB-5-131作为抗氧化剂的情况下，其剂量范围可以大约在0.1和20mg/kg之间，或大约在0.3和10mg/kg之间，或大约在2和8mg/kg之间，或大约2mg/kg。在JP4-039、JED-E71-37或JED-E71-58作为抗氧剂的情况下，使用剂量可能大约在0.01和50mg/kg之间、或大约在0.1和20mg/kg之间，或大约在0.3和10mg/kg之间，或大约在2和8mg/kg、或大约是2mg/kg。对主体的最小有效剂量和最大耐受剂量之间的治疗窗可由本领域的技术人员根据经验地确定，终点可以通过体内或体外试验确定，如本发明描述的和/或获得这类关于辐射防护药剂的信息的方法在制药和治疗领域是可接受的。对于所提供的药品，本发明所述的不同的药剂浓度预计可达到类似的结果，例如，不限于本例，在预测的辐射剂量之前给药一次，如放射治疗或诊断遭受致电离辐射之前、遭受辐射过程中、或在辐照后任何有效的给药方案。可以连续性给药，如静脉注射，每天一次或多次，每隔2、3、4、5或更多天、周、月一次等包括治疗时间段之间的增量。一个制药和医疗领域普通的技术人员将会明白预防、缓解或治疗由于暴露于辐射导致的伤患而确定适宜的给药方案的问题关键是简单设计的选择和优化。
本发明所描述的化合物对预防、缓解(降低严重程度)和/或治疗辐射导致的损伤也是有用的。本发明中所述“辐射”一词，是指导致自由基，即本发明所述的活性氧类物质(ROS)产生的辐射类型。例如，但不限于本例，由于辐射的直接作用造成自由基的产生作为对辐射的生理反应和/或作为由辐射造成的一系列损害/损伤。在一个实施方案中，辐射是致电离辐射，致电离辐射包括能从原子或分子中分离(电离)至少一个电子的高能粒子或波。致电离辐射的例子有高能β粒子，中子和α粒子。光波(光子)使原子或分子电离的能力随其各不相同的电磁波谱而变化。X-射线和γ射线几乎使任何分子或原子电离；远紫外光可使大量原子和分子电离，而近紫外和可见光则仅使很少分子电离。微波和无线电波一般被认为是非致电离辐射，尽管损伤由例如微波造成，仍可导致自由基产生，成为损伤和/或损伤导致的生理反应的部分因素。
通常化合物一般以能预防、缓解或治疗主体由于暴露于辐射而遭受的影响的一定剂量及按照给药方案供药。化合物可以任何能有效治疗、缓解或预防由辐射引起的伤害的方式给药。输药路线的非限制性例子包括：局部的，如，皮肤、吸入、灌肠、眼、耳和鼻腔给药；肠内的，如，口服、胃饲管和直肠给药；及肠胃外的，如静脉、动脉内、肌肉注射、心内、皮下、骨内、皮内、膜内、腹腔内、透皮吸收，离子导入，转化粘液质、硬膜外和玻璃体。口服、静脉注射、肌肉注射和透皮方法在很多情况下是首选。
化合物可能会被复合或以其他方式制造成适于使用的组合物，如药物剂型或制剂中该化合物是一种活性成分。组合物可包括药学上可接受的载体或赋形剂。赋形剂是一种用作一种活性成分的药物载体惰性物质。尽管是惰性的，赋形剂也可以促进和帮助提高药物产品的输药能力或活性成分的生物利用度。有用的赋形剂的非限制性例子包括：抗附着剂、粘合剂、流变改性剂、涂料、崩解剂、乳化剂、油、缓冲剂、盐、酸、碱、填料、稀释剂、溶剂、香料、着色剂，助流剂、润滑剂、防腐剂、抗氧化剂、吸附剂、维生素、甜味剂等，作为制药/药物复合领域可提供的辅料。
常用剂型包括：静脉注射、肌肉注射、或腹腔内的方案，口服片剂或液体，外用药膏或乳膏及透皮贴(如贴片)。在一个实施方案中，化合物是无菌溶液，包含活性成分(药物或化合物)、溶剂比如水，生理盐水，乳酸林格氏液，或磷酸盐缓冲液(PBS)。附加的辅料，如聚乙二醇，乳化剂、盐和缓冲剂、也可以包括在溶液中。
在一个实施方案中，剂型是透皮贴或贴片。透皮贴的一般结构在制药领域是公知的，一个典型的贴片包括但不限于，一个用于存储并为为主体提供药物的可输送药物的贮药器，一个在近侧(指向主体皮肤)附有贮药器的封闭的基底，以及通常附着于基底近侧、贮药器周围的用于将贴片完全贴在患者皮肤上的黏胶。贮药器通常是由无纺布(如纱布)或凝胶基质形成，如公知的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚醋酸乙烯酯(PVA)。贮药器通常包括吸附在贮药器基质上或基质内的活性成分和皮肤渗透促进剂。渗透促进剂的选择通常取决于实验研究。如下文实施方案12中所示，某些有用的渗透促进剂的配方包括但不限于：DMSO；95％丙二醇+5％亚油酸；和50％EtOH+40％HSO+5％丙二醇+5％Brij30。
具体实施方式
示例1-7摘自美国专利NO.11/565779，列于此处提供利用短杆菌肽S-衍生线粒体靶向基团的某些线粒体靶向自由基清除化合物的有用的合成方法和效果的非限制性的说明。
示例1
材料。除非另有说明，所有化学品购自Sigma-Aldrich公司(St Louis，MO)。肝素，盐酸氯胺酮以及戊巴比妥钠购自雅培实验室(North Chicago，IL)。达氏修正依氏培养基(“DMEM”)购自Bio Whittaker(Walkersville，MD)。胎牛血清(FBS的；＜0.05EU/ml(内毒素单位))购自Hyclone(Logan，UT)。无热原无菌生理盐水购自Baxter(Deerfield，IL)。
一般地。所有水分敏感性反应都在N2保护条件下采用隔膜式注射器保护套技术进行，并且所有玻璃器皿使用前都需要在烘箱中150℃干燥2h。反应在-78℃进行采用CO2-丙酮浴实现。THF(四氢呋喃)是用钠/二苯甲酮羰游基回流蒸出；CH2Cl2(DCM)、甲苯和Et3N(三乙胺)是在CaH2存在条件下经蒸馏处理而得。Me2Zn购自Aldrich公司。
反应通过薄层色谱(“TLC”)分析法((EM Science预涂硅胶60F254薄层层析板，涂层厚度250μm)进行监测，其可视化是通过一个254nm的紫外光灯，并通过Vaughn′s试剂(4.8g(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2g Ce(SO4)2·4H2O溶于10ml H2SO4/90ml水溶液)染色实现。闪式硅胶柱层析法用于纯化反应混合物粗品。
熔点测定使用Laboratory Devices Mel-Temp II。红外光谱分析使用Nicolet Avatar 360FT-IR光谱仪。质谱数据以Waters Autospec双聚焦质谱仪(“EI”)或Waters Q-Tof质谱仪(“ESI”)获得。LC-MS数据通过Agilent 1100仪，并采用Waters Xterra MS CH 3.5μm RP柱(4.6x100mm)获得。
合成示例I，按照文献描述的步骤制备无色油(图3，化合物1)，见Edmonds，M.K.等。基于沙奎那韦(Saquinavir)和奈非那韦(Nelfinavir)的生物活性构象的构象限制型反式肽电子等排体的设计与合成，J Org Chem.66：3747(2001)；还见Wipf，P.等，Org Lett.7：103(2005)；还可见Xiao，J.等，缩氨酸模拟化合物的静电与空间位阻效应：带有(E)-烯烃肽电子等排体的短杆菌肽S类似物的合成和二级结构的分析，J Am Chem Soc.127：5742(2005)。
将2.20g(5.52mmol)化合物1(图3)溶于20.0mL干CH2Cl2形成的溶液在室温条件下用1.85g(7.17mmol)的Cp2ZrHCl处理。反应混合物在室温下搅拌5min，减压脱除CH2Cl2，并加入20.0mL甲苯。由此产生的黄色溶液冷却至-78℃，并用2.76mL(5.52mmol)的Me2Zn(溶于甲苯形成2.0M溶液)处理30min。该溶液在-78℃下搅拌30min，在5min内回温至0℃，其中一部分用2.05g(11.1mmol)的N-Boc-异戊醛亚胺处理，见Edmonds，M.K.等。J Org Chem.66：3747(2001)；还见于见Wipf，P.等，J Org Lett.7：103(2005)。还于见Xiao等人，J Am Chem Soc.127：5742(2005)。
由此产生的混合物在0℃条件下搅拌2h，用饱和NH4Cl溶液终止反应，并用EtOAc(乙酸乙酯)稀释，通过硅藻土薄滤垫过滤，并用EtOAc萃取。将有机层干燥(MgSO4)，真空浓缩，用SiO2色谱纯化(20∶1，正己烷/EtOAc)，制得3.13g(97％)无色油性1∶1的对映体混合物。
将4.19g(7.15mmol)上述过程制得的产物溶于100mL干四氢呋喃(“THF”)中形成的溶液在0℃条件下用9.30mL(9.30mmol)的氟化四丁铵(溶于THF形成1.0M的TBAF溶液)处理。该反应混合物在室温下搅拌20h，用EtOAc稀释，并用盐水洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，真空浓缩，用SiO2色谱纯化(4∶1，正己烷/EtOAc)，制得1.89g(76％)淡黄色泡沫状非对映异构体混合物。
将1.86g(5.23mmol)上述过程制得的产物溶于干40.0mLCH2Cl2形成的溶液在0℃条件下用1.46mL(10.5mmol)三乙胺(“TEA”)、2.02mL(21.4mmol)Ac2O和63.9mg(0.523mmol)4-N，N1-(二甲氨基)吡啶(“DMAP”)处理。该反应混合物在0℃条件下搅拌15min，在室温下搅拌3h，用EtOAc稀释，并用盐水洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，真空浓缩，用SiO2色谱纯化(20∶1，正己烷/Et2O)，制得1.97g(94％)的乙酸(2S)-苄基-(5R)-t-丁氧羰基氨基-7-甲基辛-(3E)-烯基酯(807mg，38.7％)，乙酸(2S)-苄基-(5S)-t-丁氧羰基氨基-7-甲基辛-(3E)-烯基酯(826mg，39.6％)，以及上述产物的混合物(337mg，16.2％)。
将350mg(0.899mmol)乙酸(2S)-苄基-(5S)-t-丁氧羰基氨基-7-甲基辛-(3E)-烯基酯溶于8.00mLMeOH形成的溶液在0C条件下用62.0mg(0.449mmol)K2CO3处理。该反应混合物在0℃条件下搅拌1h，再在室温下在继续搅拌4h，用EtOAc稀释，用水洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，真空浓缩，用SiO2色谱纯化(4∶1，正己烷/EtOAc)，获得312mg(定量的)无色油状的化合物2(图3)。
将23.0mg(66.2μmol)化合物2(图3)溶于2.00mL干CH2Cl2形成的溶液在0℃条件下用42.1mg(99.3μmol)戴斯-马丁氧化剂(Dess-Martin Periodinane)处理。反应混合物在0℃条件下搅拌1h，再在室温下在继续搅拌4h，用饱和Na2S2O3溶液(溶于饱和NaHCO3溶液形成)终止反应，在室温下搅拌30min，用CH2Cl2萃取。将有机层干燥(MgSO4)，真空浓缩，随后将制得的无色泡沫状产物溶于3.00mL THF，并在0℃条件下用300μL(600μmol)2-甲基-2-丁烯(溶于THF形成的2.0M溶液)处理，然后再用另一18.0mg(199μmol)NaClO2和18.2mg(132μmol)NaH2PO4·H2O(溶于3.00mL水形成的溶液)处理。该反应混合物在0℃条件下搅拌1h，再在室温下在继续搅拌3h，用EtOAc萃取，用水洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，真空浓缩，制得无色泡沫状的化合物3粗品(图3)无需纯化直接用于下一步反应。
将化合物3的粗品(图3)(66.2μmol)溶于3.00mL CHCl3所形成的溶液在0℃条件下用10.7mg(79.2μmol)的1-羟基苯并三氮唑(“HOBt”)和14.0mg(73.0μmol)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(“EDC”)处理，再用由62.9mg(132μmol)H-Pro-Val-Orn(Cbz)-OMc溶于1.00mLCHCl3和0.8mg(6.6μmol)DMAP形成的一种溶液处理，见Edmonds，M.K.等。J Org Chem.66：3747(2001)；还见于Wipf，P.等，J Org Lett.7：103(2005)；还见于Xiao，J.等，J Am Chem Soc.127：5742(2005)。反应混合物在室温下搅拌2天，用CHCl3稀释，并用水洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，真空浓缩，用SiO2色谱纯化(2∶1正己烷/EtOAc到20∶1CHCl3/MeOH)，制得51.3mg(94％)无色泡沫状的化合物4a(图3)。
将53.7mg(65.5μmol)的化合物4a(图3)溶于2.00mLMeOH形成的溶液在0℃条件下用655μL(655μmol)的1N NaOH处理。反应混合物在室温下搅拌6h，并用655μL(655μmol)的1N HCl处理。该溶液用CHCl3萃取，将有机层干燥(Na2SO4)，真空浓缩，制得无色泡沫状的粗酸。该酸溶于5.00mLCHCl3中，并在室温下用10.6mg(78.4μmol)的HOBt，15.1mg(78.8μmol)的EDC，20.2mg(118μmol)4-氨基-TEMPO和8.0mg(65.5μmol)的DMAP处理。该反应混合物在室温下搅拌36h，用CHCl3稀释，并用水洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，真空浓缩，用SiO2色谱纯化(1∶1正己烷/EtOAc到20∶1 CHCl3/MeOH)，制得62.0mg(99％)无色固体化合物5a(图3)。获得以下特征分析数据：LC-MS法(液相色谱-质谱联用)(Rt 8.81min，10min内线性梯度70％～95％CH3CN(水)，0.4mg/min；m/z＝959.5[M+H]+，981.5[M+Na]+)以及HRMS(ESI)(高分辨率质谱仪)m/z对于C53H80N7O9Na(M+Na)的计算值为981.5915，实测值为981.5956。
将60.0mg(71.7μmol)化合物4b(图3)，见Tamaki，M.等人。Bull Chem Soc Jpn.，66：3113(1993)，溶于2.15mL的MeOH形成的溶液在室温下用处理717tL(717μmol)的1N NaOH处理。该反应混合物在室温下搅拌5h，再在0℃条件下用717μL(717μmol)的1N NHCl处理。该溶液用CHCl3萃取，将有机层干燥(Na2SO4)，真空浓缩，制得无色泡沫状的粗酸。该酸溶于6.04mL CHCl3，在室温下用11.6mg(85.8μmol)的HOBt，16.5mg(85.1μmol)的EDC，18.5mg(108μmol)4-氨基-TEMPO和8.8mg(72.0μmol)的DMAP的处理。该反应混合物在室温下搅拌20h，用CHCl3稀释，并用水洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，真空浓缩，用SiO2色谱纯化(从2∶1正己烷/EtOAc到20∶1 CHCl3/MeOH)，制得69.6mg(99％)的黄色固体化合物5b(图3)。获得以下特征分析数据：LC-MS法(液相色谱-质谱联用)(Rt 7.02min，10min内线性梯度70％～95％CH3CN(水)，0.4mg/min；m/z＝976.5[M+H]，998.4[M+Na]+)以及HRMS(ESI)m/z对于C52H79N8O10Na(M+Na)计算值为998.5817，实测值为998.5774。
将化合物3粗品(40.3μmol)(图3)溶于3.00mL CH2Cl2形成的溶液，在0℃条件下用10.4mg(60.7μmol)的4-氨基-TEMPO，7.7mg(40.2μmol)的EDC，和5.4mg(44.2μmol)的DMAP处理。该反应混合物在室温下搅拌20h，用CHCl3稀释，并用水洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，真空浓缩，用SiO2色谱纯化(4∶1～1∶1，正己烷/EtOAc)，制得18.8mg(91％)的微黄色固体化合物5c(图3)。获得以下特征分析数据：LC-MS法(Rt 7.01min，10min内线性梯度70％～95％CH3CN(水)，0.4mg/min；m/z＝537.3[M+Na]+)以及HRMS(ESI)in/z对于C30H48N3O4Na(M+Na)计算值为537.3543，实测值为537.3509。
细胞内超氧自由基的测定氧化依赖性荧光染料，二氢乙锭(“DHE”，分子探针)被用于检测细胞内产生的超氧自由基。DHE具有细胞渗透性，并在超氧化物存在条件下被氧化成可以插入DNA的荧光性溴乙非锭。乙锭荧光的荧光性采用配备了488-nm氩离子激光器，并装有Cell Quest软件的FACscan(Becton-Dickinson，Rutherford，NJ)流式细胞仪测量。10000个细胞的平均荧光强度是采用585-nm的带通滤波器(FL-2channel)获得的。
细胞内ATP水平的测定。细胞用10μm化合物5a(图3)按照指示时间周期(2，4，6，12和14h)培养。在培养结束时，收集细胞，细胞内ATP的含量采用生物发光体细胞检测试剂盒(Sigma，St.Louis，MA)测定。作为阳性对照，细胞用2mM 2-脱氧-葡萄糖(一种竞争性抑制细胞摄取和利用葡萄糖的葡萄糖类似物)培养12和14h。
细胞。Caco-2BBe人类肠上皮样上皮细胞源自美国模式培养物集存库(Manassas，VA)。细胞一般保存在37℃，空气中含有8％CO2的潮湿的大气条件下。该培养基为含10％FBS(胎牛血清)的DMEM，非必需氨基酸补充(Sigma-Aldrich公司目录#M7145)，丙酮酸钠(2mM)，链霉素(0.1mg/ml)，青霉素G(100U/ml)和人类转铁蛋白(0.01mg/ml)。培养基每周更换3次。
获得血管通路的外科治疗。所有使用大鼠的研究方法都遵循了美国国家卫生研究院实验动物的使用准则和制度，并且获得了匹兹堡大学动物照顾与使用委员会认证。雄性无特殊病原体(SPF级)SD大鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)，重量150～250g，饲养在一个有12h昼/夜周期性温度控制的环境里。大鼠都可以自由进食和饮水。实验过程中，大鼠通过肌肉注射g他命盐酸(30mg/kg)和腹腔灌注戊巴比妥钠(35mg/kg)来进行麻醉。实验过程中动物保持仰卧位。利多卡因(0.5％溶液0.5ml)注入皮下，为外科手术切开部位提供局部麻醉。为了确保气道，进行气管切开术，将聚乙烯管(PE(聚乙烯)240；Becton Dickinson，Sparks，MD)插入气管。使动物能够自主呼吸。
右侧股动脉插管用聚乙烯管材(PE10)。这个导管连接到压力传感器以保证实验过程中的平均动脉压(MAP)的瞬时测量。对于采用定压控制式失血性休克(HS)模型的实验，右侧颈静脉被暴露，远端结扎，并插入聚乙烯管(PE10)以便采血。对于采用定容控制式失血性休克(HS)模型的实验，采用颈静脉导管灌注复苏溶液并且右股静脉插入一个硅导管(慢性-蛋白酶，NorfolkMedical，Skokie，IL)，被用于采血。
所有动物均在30min内完成装备。肝素(500U/kg)是在股静脉装备完成后立刻注入。动物被放置在一个热毯上以维持其体温在37℃。在上述不同的装备完成安装后检验。
肠黏膜通透性检测。实验前24h动物被允许饮水，但不允许进食，以减少肠道内容物的体积。将大鼠如上所述进行装备。实施中间线剖腹手术并取出十二指肠空肠交接处到回盲瓣之间的这段小肠。在近端小肠的系膜小肠对象部部位做一个小切口并注射盐溶液(1.5ml)。采用丝线4-0对肠的切口进行近端和远端结扎(Look，Reading，PA)。
小肠在对口方向沿其长度被轻轻压缩进入结肠以取出肠内容物。从回盲瓣开始5cm，回肠被分为六个毗连的水密段。每一段为3cm长，是通过压缩周界丝线4-0进行近端和远端结扎。小心操作确保为小肠供血的血管不受损伤并且每一段灌注良好。
从每只大鼠随机选取两个小肠段分别灌注0.3ml的介质，用作“无治疗”对照样本。为了灌注肠段，做一小切口，并用聚四氟乙烯导管灌注溶液(Abbocath 16Ga，Abbot Laboratories)。
剩余其他四个肠段分别灌注4-羟基-2，2，6，6-四甲基吡啶-N-氧基(TEMPOL)或者任意一种短杆菌肽S系化合物的溶液。TEMPOL在生理盐水中所形成的四种不同的最终浓度经检测为：0.1，1，5和20mM。该半短杆菌肽系化合物溶解于二甲基亚砜(DMSO)和生理盐水混合物(1∶99v/v)中，以0.1，1，10或100μM的最终浓度灌注。
肠段灌注生理盐水或实验化合物后，肠道被放回腹膜腔，腹部切口暂时使用Backhaus手术钳封口。
经过5min的稳定期，通过抽取颈静脉血液导致失血性休克。MAP保持在30±3mm Hg2h。将所抽取的血液重新输入以将MAP维持在需要的范围内。
休克2h后，动物采用心脏内氯化钾推注实施安乐死。回肠迅速从回盲瓣与肠近端之间切除。各肠段的顶端被丢弃。为了检测半胱天冬酶3和7(caspases)的活性和磷脂过氧化反应，大出血后立刻从肠段采集粘膜样本，保藏于-80℃。为了进行渗透性测量，每个肠段转变成外翻肠囊，如前文Wattanasirichaigoon等人所述，见Wattanasirichaigoon，S，等。肠系膜缺血再灌注或失血性休克对大鼠肠黏膜通透性和ATP含量的影响，Shock.12：127-133(1999)。
简言之，根据上文所述Wattanasirichaigoon的方法，肠囊在冰冷的改良Krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液(“KHBB”)(pH值7.4)中制作。肠段的一端用丝线4-0结扎；然后肠段外翻到一个细塑料棒上。所产生的肠囊装在与一个含1.5ml KHBB的3ml的塑料注射器相连接的聚四氟乙烯导管(Abbocath 16GA，Abbot Laboratories)上。肠囊悬浮在含有KHBB和异硫氰酸荧光素标记葡聚糖(平均相对分子质量4kDa；FD4；0.1mg/ml)的烧杯中。维持该溶液在37℃，以混合气体(O2 95％/CO2 5％)鼓泡充氧。30min后，收集肠囊内的液体。样品在2000g离心5min澄清。
烧杯和每段肠囊内溶液中的FD4的荧光度，都用荧光分光光度计(LS-50，Perkin-Elmer，Palo Alto，CA)在激发波长492nm和发射波长515nm处检测。如前面所述，黏膜通透性表示为利用肠囊长度归一化处理的清除率，其单位为nL·min-1·cm2，见Yang，R等。丙酮酸乙酯调节遭受失血性休克的小鼠的炎症基因表达，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 283：G212-G22(2002)。
特定实验条件(即单一浓度的特定试验化合物)的结果表示为根据下列公式计算的相对渗透率变化：相对渗透率变化(％)＝(CHs exp-Cnormal)/CHs cont-Cnormal)x100，其中CHS exp是测得的灌注了实验化合物的肠段的FD4的清除率，Cnormal是测得的取自没有遭受失血性休克的3例正常动物的6个肠段的FD4的清除率，而CHs cont是测得的取自用来检测CHS exp的同一动物的灌注了介质的两个肠段的平均FD4的清除率。Caco-2单层膜通透 性的测量。Caco-2BBe细胞以5×104细胞/孔的细胞密度涂布在12孔双室培养槽(Transwell，Costar，Corning，NY)的透滤器上(孔径0.4μm)。经过21～24天，通过测量从顶端到基底侧的FD4的清除率来测定细胞旁路通透性。
简单地说，基底外侧的介质被换成了对照介质或含有甲萘醌(终浓度50μM)的介质。含FD4(25mg/ml)的介质适用于顶端槽。在某些情况下，该短杆菌肽S系化合物之一，XJB-5-131，也以0.1，1，10或100μM的最终浓度被添加到顶部。经过6h的培养，通过两个舱室为介质供气。单层膜通透性表示为清除率(pL·h-1·cm-2)，见Han，X等。炎症细胞因子引起肠上皮细胞中的紧密连接蛋白的NO依赖性和非依赖性变化的表达和定位，Shock.19：229-237(2003)。
半胱天冬酶3和7的活性测定。半胱天冬酶3和7的活性测定采用市售的检测试剂盒，半胱天冬酶GIoTM 3/7检测试剂盒(Promega，Madison，WI)。简单地说，50μL大鼠肠粘膜胞液(20罐蛋白)与50μl半胱天冬酶-G1oTMμl试剂混合，并在室温下培养1h。在培养期结束时，每个样品的发光测定采用平板读数化学发光仪(ML1000，Dynatech Laboratories，Horsham，PA)。半胱天冬酶3和7的活性分别表示为发光强度(每mg蛋白任意单位)。蛋白质浓度采用BioRad法测定(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA)。
磷脂过氧化反应的测定。肠道黏膜样本均质化。脂类采用Folch法从胞液中萃取，见M.Lees和G.H.Sloan-Stanley，从动物组织中分离及纯化总脂的简单方法，J.BIOL.CHEM.226：497-509(1957)，以及如前所述通过2D HPTLC(高效薄层色谱法)解决，见Kagan，V.E.等，氧化应激在细胞凋亡中的作用：磷脂酰丝氨酸的氧化和外翻是清除遭受Fas介导的细胞凋亡的巨噬细胞所需要的，J Immunol.169：487-489(2002)。磷脂的斑点从HPTLC板上刮去和磷脂从SiO2萃取。脂质磷采用微量测定法测定，见Bottcher，C.J.F.等。一种快速、敏感的亚微量磷测定，AnalChim Acta.24：203-204(1961)。
氧化磷脂采用溶于含有1mM CaCl2、0.5mM EDTA和0.5mM十二烷基硫酸钠(SDS)的25mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0，室温，30min)的胰腺磷脂酶A2(2U/μl)水解。所生成的脂肪酸氢过氧化物是利用荧光HPLC通过测定在Amplex Red(在4℃40min)(8)存在条件下在其微过氧化物酶11催化的还原反应过程中按化学剂量比生成的试卤灵(9-羟基-3-异吩恶唑酮)来测定的。荧光高效液相色谱法(Eclipse XDB-C18柱，5μm，150×4.6mm，流动相由25mM磷酸二钠缓冲液(pH7.0)/甲醇(60∶40v/v组成)；激发波长560nm，发射波长590nm)在配有荧光检测器(RF-10Axl)和自动进样器(SIL-10AD)的Shimadzu LC-100ATHPLC系统进行。
遭受定容控制式失血性休克的大鼠的存活。继术前准备和一个获得基线读数的5min的稳定期之后，大鼠遭受失血性休克。出血分两个阶段进行。
初期，在20min内按照21ml/kg的量抽取血液。紧接着，又在40min内按照12.5ml/kg的量抽取血液。因此，出血发生总时间为60min，总失血量为33.5ml/kg或约为总血容量的55％。大鼠随机分配输入XJB-5-131(2μmol/kg)或其介质，一种33∶67(v/v)DMSO和生理盐水的混合物。XJB-5-131溶液或单纯的介质在出血的最后20min期间被安排连续输入。输液总量为2.8ml/kg，它是使用注射泵(KD100，KD Scientific，New Hope，PA)静脉注射。大鼠被观察6个h，或直至到死亡(被定义为停止呼吸＞1min)。在6h的观察期结束时，仍然活着的动物用过量的氯化钾安乐死。
使用市售应变片传感器，放大器和监测器(S90603a，SpaceLabs，Redmond，WA)连续记录血压。血液样本(0.5m1)在失血开始时(基准值)，在失血(性休克)终止时，于复苏(复活)结束时从颈静脉收集。血红蛋白浓度[Hb]，乳酸和血糖浓度采用自动分析仪测定(Model ABL 725，Radiometer Copenhagen，Westlake，OH)。
数据显示和统计。所有的变量都以平均值+标准误差平均值(SEM)的形式表示。统计显著性组间差异用恰当的ANOVA(方差分析)和LSD(最小明显差异)试验，或较恰当的用Kruskal-Wallis和Mann-Whitney法测试。存活数据采用对数秩实验进行分析。其显著性检验表明P值小于0.05。
实施例2
TEMPO选择性传送到线粒体可能导致有益于治疗的活性氧类物质的减少；因此，对4-氨基-TEMPO(“4-AT”)轭合物的使用研究进行了探讨。为了选择性靶线粒体，定位序列使用膜活性抗生素短杆菌肽(“GS”)，以及相应的烯烃电子等排体，图2和3所示。因此，使用短杆菌肽S肽酰片段和烯烃电子等排体作为“锚”的TEMPO“有效载荷”可以导入线粒体。
半短杆菌肽的Leu-DPhe-Pro-Val-Orn片段用作定位序列。烯烃-电子等排体，如短杆菌肽(即半短杆菌肽)的(E)-烯烃电子等排体被用作定位序列的一部分。图3是(E)-烯烃电子等排体和具有相应的化学结构的化合物3的合成途径。随后，图3中的(E)如化合物2所描述的(E)-烯烃被多步氧化产生化合物3的(E)-烯烃电子等排体示例中所描述的化合物。
然后，图3中化合物3所描述的化合物是通过用作偶联剂的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(“EDC”)与三肽H-Pro-Val-Orn(Cbz)-OMe耦合。该三肽是一个合适具有细胞线粒体亲和力的定位序列的例子。最终产品如图3中化合物4a所示。化合物4a皂化后再通过与4-氨基-TEMPO耦合产生如图3中的化合物5a所示的轭合物，其中Leu-DPhe肽键已被替换为一(E)-烯烃。
在一个可选实施方案中，通过肽4b(Boc-Leu-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-OMe)与(E)-烯烃电子等排体偶联得到的轭合物5b和5c如图3中被标识为化合物3到4-AT的化合物。肽是另外一个合适的具有细胞线粒体亲和力的定位序列的例子。
电子顺磁共振(″EPR″)光谱是用来监测小鼠胚胎细胞(″MEC″)中的如图3所示的化合物5a和5b的细胞传递。
下列条件用于小鼠胚胎细胞中氮氧自由基短杆菌肽S-肽基轭合物的结合和还原的EPR分析过程。浓度为1000万小鼠胚胎细胞/mL的小鼠胚胎细胞分别用10μM的4-AT和化合物5a培养。回收的全部细胞，线粒体和胞液中的氮氧自由基悬浮于分别含有或不含有2μM K3Fe(CN)6的磷酸盐缓冲液(“PBS”)中。简言之，图4A显示出含有K3Fe(CN)6的在小鼠胚胎细胞中占不同比率的化合物5a的EPR谱图。此外，图4B显示了总氮氧自由基的检测值。
用10μm的化合物5a(图3)培养的MECs以及从这些细胞中分离的线粒体中氮氧自由基的具有明显的特征的三组信号被检测。胞液的存在并没有引发氮氧自由基的EPR信号；通过轭合物5b(图3)可以观察到类似的结果(数据未显示)。
当添加一种单电子氧化剂，铁氰化物(图4B)时EPR信号强度的数值明显增大，这表明用化合物5a(图3)培养MECs可导致化合物5a的融合和单电子还原。(注：用化合物5b培养的MECs的EPR结果没有显示在图4中，但是5b的EPR结果与5a相似)。然而，与5a和5b相比，4-氨基-TEMPO(4-AT)的EPR结果并没有明显的振幅变化表明4-AT并不能有效地渗透细胞或线粒体。
5a，5b(图3)，和4-AT抑制细胞内超氧化物的能力通过荧光流式细胞仪监测二氢乙锭(“DHE”)氧化成荧光溴乙非锭被检验。对于5a，5b和4-AT抑制放线菌素D(“ActD”)引起的细胞凋亡的能力也进行了试验。MECs用10μM的4-AT，5a，或5b预处理，然后用浓度为100ng/mL的ActD培养。结果发现，5a及5b可完全抑制MECs内近2倍的细胞内超氧化物的产生(见图6A)。4-AT对于MECs内的超氧化物的产生并没有影响。
凋亡细胞反应使用三种生物标记物记录：(1)细胞表面的磷脂酰丝氨酸(“PS”)外翻(使用FITC标记-pS-结合蛋白，膜联蛋白V通过流式细胞仪进行，见图6B及6E)，(2)通过Z-DEVD-AMC底物降解活化半胱天冬酶-3(见图6C)，以及(3)利用流式细胞仪通过碘化丙啶染色DNA进行DNA破碎(见图6D)。
磷脂酰丝氨酸(“PS”)是一种主要分布于质膜内小叶上的酸性磷脂；细胞表面PS外翻是细胞凋亡特征。PS外翻利用膜联蛋白V检验试剂盒通过流式细胞仪分析。细胞在培养结束时通过胰蛋白酶化作用采集，然后用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶(“PS”)染色。一万个细胞事件通过一个FACScan流式细胞仪采集。膜联蛋白V-阳性和PI-阴性细胞被认为是细胞凋亡。
capase-3，一种只在细胞凋亡执行阶段被激活的半胱氨酸蛋白酶的活化，用EnzChek capsase-3检测试剂盒检验。
而且，细胞凋亡过程中钙和镁依赖性核酸酶被激活致DNA降解。这些DNA片段被洗提，用碘化丙啶染色，并流式细胞仪分析。一个DNA含量减少的细胞群被认为是凋亡细胞的一部分。
在相对较低的浓度(10μM)条件下观察化合物5a及5b的抗细胞凋亡作用。化合物5a和5b(图3)减少了膜联蛋白V阳性细胞数量，如图6B所示，抑制caspase-3的活化，如图6C所示，并阻止DNA分裂，如图所示6D所示。浓度大于10μm时，5a及5b抑制性下降，或者表现出细胞毒性(图6E所示)。相比之下，4-AT没有保护作用。
相比较而言，没有一个完整的靶向性组分的化合物5c在低浓度条件下对于保护MECs抑制ActD致细胞凋亡无效(图6B和6C)。因此，半短杆菌肽肽基定位序列是诸如含有TEMPO的那些氮氧自由基轭合物的抗凋亡活性所必须的。
最后，化合物5a和5b的还原反应也会导致线粒体氧化磷酸化作用的抑制，所以对于用这些化合物处理的MECs的ATP含量进行了试验。正如本领域技术普通人员所熟知的，ATP是生物有机体中的主要能量来源；ATP水平下降将会严重影响正常细胞的功能。将含有或不含有5a或2-脱氧葡萄糖(“2-DG”)的MECs中的ATP水平用作阳性对照(见图6F)。在抗细胞凋亡作用最大的浓度条件下(～10μM，图6E)，氮氧自由基轭化合物没有引起细胞内ATP水平的明显改变。因此，合成GS-肽基轭合物迁移进入细胞和线粒体，在那里他们被还原但不影响线粒体产生ATP的能力。
实施例3
在体内试验中，大鼠回肠被分成了在一定程度上类似于香肠的一系列良好血管供应的组分。每个回肠段管腔内都灌注了3μL小剂量的实验溶液。两节回肠段单纯灌注介质(即一种至少含有一定浓度的TEMPO衍生物的溶液)。这两段都用作内部对照，以解释休克严重程度或黏膜对休克反应的个体差异。
使用这种检测系统，对八化合物进行了评价，如图5所示：TEMPOL(图5A)，一个二肽TEMPO类似物(图5B-XJB-5-208)，3个半短杆菌肽-TEMPO轭合物(图5C XJB-5-125、5E XJB-5-131和5G XJB-5-197)，3个没有TEMPO组分的半短杆菌肽化合物(图5D-XJB-5-127，5F-XJB-5-133，和5H-XJB-5-194)。
大鼠失血性休克导致肠黏膜屏障功能明显紊乱-换句话说，在休克状态下肠段黏膜通透性明显高于正常大鼠的肠段通透性(分别为52.3+0.5对6.9+0.1nL·min-1·cm-2；p＜0.01)，见Tuominen，E.K.J.，磷脂细胞色素c的相互作用：脂质锚地延伸的证据，J.BIO L.CHEM.，277：8822-8826(2002)；还见于Wipf，P.等，线粒体靶向选择性电子清除剂：半短杆菌肽-TEMPO轭合物的合成和生物学分析，J.AM.CHEM.SOC.127：12460-12461。因此，小鼠遭受2h休克(平均动脉压(″MAP″)＝30 f 3mm Hg)，切取肠段，并对荧光异硫氰酸盐-葡聚糖(“FD4”)的黏膜渗透性进行离体检测。图5的数据表示为相对于同时检测的休克过程中输入生理盐水的对照肠段的渗透率变化的百分比。
因此，腔内TEMPOL被用作一种肠道粘膜保护检验的“阳性对照”。肠腔内的TEMPOL浓度＞1mM改善了失血性休克致回肠黏膜的过高通透性(图5A)。两种TEMPO轭合物，即XJB-5-208(图5B)和XJB-5-131(图5C)，也明显改善了失血性休克致回肠黏膜的通过高透性。XJB-5-208(图5B)和XJB-5-131最低有效浓度(图5E)为1μM；也就是说，这两种化合物药效均大于TEMPOL～1000倍以上。载有TEMPO的有效成分的另外两种化合物，XJB-5-125(图5C)和XJB-5-197(图5G)不能提供出血致肠屏障功能障碍防护。XJB-5-133(图5F)具有与XJB-5-131(图5E)相同的(半短杆菌肽基)线粒体靶向组分，但没有TEMPO的有效成分。因此，值得注意的是，XJB-5-133(图5F)不能提供保护抑制回肠黏膜过高通透性的增长。
还有其他两个半短杆菌肽系的化合物，XJB-5-127(图5D)和XJB-5-194(图5H)，也因缺乏TEMPO的有效成分而无效。对这些化合物进行筛选，XJB-5-131(图5E)似乎是最有效的，减少失血性休克致黏膜通透性约为对照值的60％。
基于图5A-5H反映的结果，TEMPO的有效成分，和“锚定”半短杆菌肽片段都是化合物XJB-5-131具备清除电子的有效活性所必须的。因此，有人发现，XJB-5-131可改善线粒体磷脂在遭受失血性休克的大鼠的肠道粘膜中过氧化反应(即ROS活性)。
在随后的一系列的体内实验中，对于腔内XJB-5-131对出血致肠黏膜磷脂过氧化反应的影响进行了研究。离体大鼠回肠段被分为一系列在一定程度上类似于香肠的良好血管供应的组分，并且每段回肠管腔都灌注含有介质或10μm的XJB-5-131溶液(此前已被表明是活性最大的半短杆菌肽-TEMPO轭合物)相同体积的实验溶液。在一个优选的实施方案中，每段回肠腔内都灌注0.3mL的实验溶液。
经过两个小时的HS后，取出灌注了介质和XJB-5-131的取自肠囊的回肠黏膜样本，并与正常MECs的回肠黏膜比较。所有样品都用caspase 3或caspase 7的活性以及卵磷脂(“PC”)、磷脂酰乙醇胺(“PE”)、磷脂酰丝氨酸(“PS”)和心磷脂(“CL”)的过氧化反应进行检测，总结在图7中。
在图7A-7D可以看出，用XJB-5-131处理明显改善出血致CL(唯在线粒体中检测发现的磷脂)过氧化反应。然而，用XJB-5-131处理只对PE过氧化反应有较小影响，而对PC和PS过氧化反应没有影响。基于在这些趋势，失血性休克与大量氧化应激相关，即使在不复苏的情况下。并且，这一数据还证实，XJB-5-131是一种有效的ROS清除剂，因为它主要位于线粒体内并能抑制CL过氧化反应。
相对于检测到的正常动物样本活性，用介质处理的取自失血性大鼠的黏膜样本中的caspases 3和7的活性明显增加(图8)。然而，当回肠段用XJB-5-131溶液替代介质灌注，失血性休克后caspase 3和7的活性水平明显下降。因此，失血性休克是与肠道粘膜细胞的促凋亡途径的活化相关的。此外，该数据证实，继XJB-5-131处理线粒体之后这个过程明显改善。
实施例4
在另一系列实验中，对肠上皮样细胞(Caco-2BBe)单层膜，进行了生理和病理生理研究，以确定肠屏障功能。正如与ROS暴露有关的优先例所述，当细胞用ROS，过氧化氢，或甲萘醌(一种促使超氧化物阴离子自由基的形成的氧化还原循环奎宁)培养时，Caco-2BBe膜通透性增加，见Baker，R.D.等。Caco-2细胞的分化，活性氧代谢物对肠屏障功能的影响，DIGESTIVE DIS.SCI.40：510-518(1995)；还见于Banan，A.等，蛋白激酶C的delta-异构体的活化是微管细胞骨架和肠上皮细胞透性障氧化-还原分解所必须的。J.PHARMACOL.EXP.THER.303：17-28(2002)。
由于有关XJB-5-131及其对于出血致体内粘膜细胞内CL过氧化反应的改良的结果(见上述第1和第2实施例)，对于一个采用XJB-5-131的可能性处理进行观察，以确定甲萘醌致上皮细胞过高通透性是否能进行体外改善。与之前的体内观察一致，Caco-2BBe单层膜别在有或没有甲萘醌存在的条件下培养。6h后，用甲萘醌培养Caco-2BBe单层膜引起了从顶端到基底侧的FD4清除率明显增加(图9)。以10μM的XJB-5-131处理可以提供保护明显抑制甲萘醌致过高通透性。
实施例5
正如上文在体内和体外研究反映，XJB-5-131对于若干生化和生理读数有明显有益的影响。因此，XJB-5-131全身给药研究关于是否会延长遭受由于大量失血而又没有进行规范的血液和晶体溶液复苏的情况下的深度失血性休克的患者的存活率。对于上述研究，大鼠被用作试验患者。
这项研究一共使用了十六只大鼠进行测试。大鼠在出血试验过程的最后20min用2.8ml/kg的介质或相同容量的XJB-5-131溶液治疗。输入XJB-5-131总剂量为2μmol/kg。以下是及与之前所述的研究过程一致的深度失血性休克之后，十三只大鼠的存活时间至少为60min，接收了所灌注的全部剂量的XJB-5-131溶液或介质(一种33∶67(v/v)的DMSO和生理盐水混合物)。如表2所示，在基线阶段和治疗之前以及短暂治疗之后，两组的血糖，乳酸和血红蛋白浓度相似。在组间无统计学意义上的明显差异。
表2
治疗开始后不久，两组的平均动脉压(“MAP”)都略有上升(参见图10A)。在两组的平均动脉压(“MAP”)在出血实验过程的第一阶段迅速下降，并在第二阶段开始几乎保持恒定在40mmHg。用介质治疗(对照组)的七个动物中有六个出血试验过程结束一个小时内死亡，所有动物均在125min内(图10B)死亡。采用静脉注射XJB-5-131治疗的大鼠存活时间明显大于用介质治疗的大鼠。在失血实验过程结束后，六大鼠中有3只存活时间超过3h，一只大鼠在出血观察期结束后整整存活了6h(图10B)。
因此，对XJB-5-131的研究分析表明，患者接触该化合物可以延长其由于外伤或其他灾难(如腹主动脉瘤破裂)失去大量的血后的生存时间。
在发生不可逆休克前，通过扩展治疗窗口，由XJB-5-131参与治疗可以“赢得”足够的时间使更多的严重受伤的患者可以转移到权威的治疗地点，包括出血控制和用血液制品及非血质液体复苏都可以提供。使用一种失血性休克的啮齿目动物模型的结果还开创了XJB-5-131类的药物可能会对与明显的组织低灌注，如中风，心肌梗死相关的其他病况有益。
所得结果也证实了线粒体靶向性ROS清除剂是一种合理的治疗策略的一般性概念。虽然以前的研究表明，采用TEMPOL治疗有益于啮齿目动物HS的情况，但是需要该化合物的剂量较大(30mg/kg丸+30mg/kg每小时)。相反，用XJB-5-131治疗以约低于上述剂量300倍的剂量就有明显的效果。XJB-5-131比TEMPOL具有更大的药效大概反映了XJB-5-131主要作用于线粒体膜的倾向，本发明的一个关键实施方案。如上所述，两个半短杆菌肽-4-氨基-TEMPO轭合物(即XJB-5-208和XJB-5-131，见图2)在用该化合物溶液培养后，集中作用于饲养小鼠的胚胎细胞的线粒体。
并且，XJB-5-131的使用明显延长了遭受大量失血大鼠存活时间，即使动物没有用血液或其他非血质液体复苏，它们仍然处于深度低血压状态。
鉴于上述情况，合成半短杆菌肽肽基-TEMPO轭合物渗透到细胞膜，及线粒体膜，并在那里起到ROS(例如包括但不限于，超氧化物阴离子自由基)的自由基清除剂的作用。然后轭合物在线粒体内通过包括细胞呼吸途径并由此耦合去偶合的活性氧类物质的电子传递蛋白还原。这些轭合物的优点，正如上文中讨论的，具备抗凋亡能力，特别是对于诸如化合物5a和5b而言。
通过有效地降低活性氧类物质的量，患者的状况，包括疾病或其他医疗状况，都可能会改善，在某些情况下，存活时间可能如示例IV研究所描述的被延长。这种状况的列子，包括疾病和其他医疗状况，包括(但不限于)以下的医疗状况，包括疾病和病症：心肌缺血和再灌注(如血管成形术后，以及用于不稳定心绞痛或心肌梗死支架置入术)，实质器官(肺肝、肾、胰、肠、心脏)移植，出血性休克，感染性休克，中风，致电离辐射造成的组织损伤，肺损伤，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，坏死性胰腺炎以及坏死性小肠结肠炎。
实施例6
在又一实施方案中，证实线粒体靶向基团的可交换性负载物，一种清除线粒体膜内自由基的组合物包括自由基清除剂或NOS抑制剂和对线粒体膜具有高亲和力的一种膜活性肽片段。膜活性肽片段最好是从含有抗氧化，抗辐射，防护性，抗细胞凋亡，益于治疗的，改良的，NOS拮抗剂及其制品的基团中选择。在一个相关的实施方案中，对于具有抗生素特性的化合物，一般优选采用其作用方式包括细菌壁标靶的化合物。
在另一实施方案中，膜活性化合物是优选的选自含有杆菌肽，短杆菌肽，缬氨霉素，恩镰孢菌素，丙甲菌素，白僵菌素，serratomolide，葚孢霉酯，短杆菌酪肽，多黏菌素，摩那霉素和海鞘肽的基团。
在一个相关的实施方案中，NOS拮抗剂选自含有XJB-5-234(a)，XJB-5-133(b)，XJB-5-241(c)，and XJB-5-127(d)的基团，其中包括AMT NOS拮抗剂负载物：
Figure BPA00001330558900701
实施例7
下面的实施例提供了可用于本发明所述的用作NOS拮抗剂的附加负载物的合成途径。
Figure BPA00001330558900702
化合物(1)是Boc-Leu-Ψ[(E)-C(CH3)＝CH]-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-AMT(XJB-5-241)，按照以下方法制备。将11.0mg(13.2μmol)的Boc-Leu-Ψ[(E)-C(CH3)＝CH]-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-OMe(2-48)溶于400μL的MeOH形成的溶液在0℃条件下，用132μL(132μmol)的1N NaOH处理。该反应混合物在室温下搅拌8h，并用132μL(132μmol)的1N HCl处理。该溶液用CHCl3萃取，将有机层干燥(Na2SO4)，真空浓缩，制得无色的粗酸。该酸溶解于2.00mL的CHCl3，并在室温下用2.1mg(16μmol)的HOBt，3.0mg(16μmol)的EDC，3.3mg(20μmol)的2-氨基-5，6-二氢-6-甲基-4氢-1，3-噻嗪·HCl和3.5mg(27μmol)的DMAP处理。该反应混合物在室温下搅拌48h，用CHCl3稀释，并用水洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，真空浓缩，用SiO2色谱纯化(先1∶1，正己烷/EtOAc然后20∶1，CHCl3/MeOH)，制得11mg(89％)的无色粉末状XJB-5-241。获得以下特征分析数据：LC-MS法(液相色谱-质谱联用)(Rt 8.37min，10min内线性梯度70％～95％CH3CN(水)，0.4mL/min；m/z＝932.4[M+H]+，954.3[M+Na]+)以及HRMS(ESI)(高分辨率质谱仪)m/z对于C49H72N7O8S(M+H)计算值为932.5320，实测值为932.5318。
Figure BPA00001330558900711
化合物(2)是Boc-Leu-Ψ[(E)-CH＝CH]-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-AMT(XJB-5-133)，并按照以下方法制备。20.0mg(24.3μmol)的2-85(XJB-5-194)溶于800μL的MeOH形成的溶液，在0℃条件下用243μL(243μmol)的1N NaOH处理。该反应混合物在室温下搅拌6h，并243μL(243μmol)的1N HCl处理。该溶液用CHCl3萃取，将有机层干燥(Na2SO4)，真空浓缩，制得无色的粗酸。该酸溶解于1.00mL的CHCl3，在室温下用3.9mg(29μmol)的HOBt，5.6mg(29μmol)的EDC，6.1mg(37μmol)的2-氨基-5，6-二氢-6-甲基-4氢-1，3-噻嗪·HCl和7.4mg(61μmol)的DMAP处理。该反应混合物在室温下搅拌20h，用CHCl3稀释，并用水洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，真空浓缩，然后用SiO2色谱纯化(先1∶1，正己烷/EtOAc，然后20∶1，CHCl3/MeOH)和再用C18反相HPLC制备色谱纯化(20min内80％到100％CH3CN(H2O)，5.0mL/min)，制得12.9mg(58％)的无色粉末状的XJB-5-133。获得以下特征分析数据：LC-MS法(Rt 7.89min，10min内线性梯度70％～95％CH3CN(水)，0.4mL/min；m/z＝918.3[M+H]+，940.3[M+Na]+)以及HRMS(ESI)m/z对于C49H72N7O8S(M+H)计算值为918.5163，实测值为918.5185。
Figure BPA00001330558900721
化合物(3)是Boc-Leu-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-AMT(XJB-5-127)，按照以下方法制备。24.0mg(28.7μmol)的Boc-Leu-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-OMe溶于800μL的MeOH形成的溶液在室温条件下，用287μL(287μmol)的1N NaOH处理。该反应混合物在室温下搅拌5h，并于0℃条件下用287μL(287μmol)的1N HCl处理。溶液用CHCl3萃取，将有机层干燥(Na2SO4)，真空浓缩，制得无色泡沫状的粗酸。该粗酸溶解于2.00mL的CHCl3，在室温下用4.6mg(34μmol)的HOBt，6.6mg(34μmol)的EDC，5.7mg(34μmol)的2-氨基-5，6-二氢-6-甲基-4氢-1，3-噻嗪·HCl和8.8mg(72.0μmol)的DMAP处理。反应混合物在室温下搅拌24h，用CHCl3稀释，并用水洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，真空浓缩，用SiO2色谱纯化(先2∶1，正己烷/EtOAc，然后20∶1CHCl3/MeOH)，制得17.0mg(63％)的无色粉末状XJB-5-127。获得以下特征分析数据：LC-MS法(Rt 6.32min，10min内线性梯度70％～95％CH3CN(水)，0.4mL/min；m/z＝935.3[M+H]+，957.3[M+Na]+)以及HRMS(ESI)m/z对于C49H71N8O9S(M+H)计算值为935.5065，实测值为935.5044。
Figure BPA00001330558900731
化合物(4)是Boc-Leu-Ψ[(E)-CH＝CH]-DPhe-AMT(XJB-5-234)。Boc-Leu-Ψ[(E)-CH＝CH]-DPhe-OH(2-84)粗品(30.5μmol)溶于2.00mL的CH2Cl2形成的溶液，在0℃条件下用6.1mg(37μmol)的2-氨基-5，6-二氢-6-甲基-4氢-1，3-噻嗪·HCl，7.0mg(37μmol)的EDC，4.9mg(37μmol)的HOBt，and 9.3mg(76μmol)的DMAP处理。该反应混合物在室温下彻夜搅拌，真空浓缩，用SiO2制备色谱纯化(2∶1，CH2Cl2/EtOAc)，制得9.1mg(63％)的无色泡沫状XJB-5-234。获得以下特征分析数据：LC-MS法(Rt 8.42min，10min内线性梯度70％～95％CH3CN(水)，0.4mL/min；m/z＝474.5[M+H]+)和HRMS(ESI)m/z对于C26H40N3O3S(M+H)计算值为474.2790，实测值为474.2781。
化合物(5)是Boc-Leu-Ψ[(Z)-CF＝CH]-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-TEMPO(XJB-7-53)。3.4mg(4.1μmol)的Boc-Leu-Ψ[(Z)-CF＝CH]-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-OMe XJB-5-66)溶于400μL的MeOH形成的溶液，在0℃条件下用41μL(41μmol)的1N NaOH处理。反应混合物在室温下搅拌12h，并用41μL(41μmol)的1N HCl处理。该溶液用CHCl3萃取，将有机层干燥(Na2SO4)，真空浓缩，制得无色的粗酸。该酸溶于400μL的CHCl3，在室温下用0.7mg(5μmol)的HOBt，0.9mg(5μmol)的EDC，0.5mg(4μmol)的4-氨基-TEMPO和1.1mg(6μmol)的DMAP处理。该反应混合物在室温下搅拌12h，用CHCl3稀释，并用水洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，真空浓缩，用SiO2色谱纯化(先1∶1，正己烷/EtOAc然后20∶1，CHCl3/MeOH)，制得3.6mg(91％)无色粉末状的XJB-7-53。获得以下特征分析数据：LC-MS法(Rt 8.45min，10min内线性梯度70％～95％CH3CN(水)，0.4mL/min；m/z＝977.5[M+H]+，999.5[M+Na]+)和HRMS(ESI)m/z对于C53H79FN7O9Na(M+Na)计算值为999.5821。
Figure BPA00001330558900751
化合物(6)是Boc-DPhe-Ψ[(E)-C(CH3)＝CH]-Ala-Val-Orn(Cbz)-Leu-AMT(XJB-7-42)，按照以下方法制备。4.5mg(5.6μmol)的Boc-DPhe-Ψ[(E)-C(CH3)＝CH]-Ala-Val-Orn(Cbz)-Leu-OMe(2-119)溶于0.35mL的MeOH形成的溶液，在0℃条件下用56μL(56μmol)的1N NaOH处理。该反应混合物在室温下搅拌12h，并用56μL(56μmol)的1N HCl处理。该溶液用CHCl3萃取，将有机层干燥(Na2SO4)，真空浓缩，制得无色的粗酸。该酸溶于0.80mL的CHCl3，在室温下用0.9mg(6.7μmol)的HOBt，1.3mg(6.7μmol)的EDC，1.4mg(8.4μmol)的2-氨基-5，6-二氢-6-甲基-4氢-1，3-噻嗪·HCl和1.7mg(14μmol)的DMAP处理。该反应混合物在室温下搅拌36h，真空浓缩，用SiO2色谱纯化(20∶1，CHCl3/MeOH)，制得5.0mg(99％)的无色泡沫状的XJB-7-42。获得以下特征分析数据：LC-MS法(Rt6.61min，10min内线性梯度70％～95％CH3CN(水)，0.4mL/min；m/z＝907.3[M+H]+，929.4[M+Na]+)以及HRMS(ESI)m/z对于C48H72N7O8S(M+H)计算值为906.5163，实测值为906.5190。
Figure BPA00001330558900752
化合物(7)是Boc-DPhe-Ψ[(E)-C(CH3)＝CH]-Ala-Val-AMT(XJB-7-43)。14.3μmolBoc-DPhe-Ψ[(E)-C(CH3)＝CH]-Ala-Val-OMe(2-111)粗品溶于1.00mL的CHCl3形成的溶液，在0℃条件下用2.3mg(17μmol)的HOBt，3.3mg(17μmol)的EDC，3.6mg(22μmol)的2-氨基-5，6-二氢-6-甲基-4氢-1，3-噻嗪·HCl和4.4mg(36μmol)的DMAP处理。反应混合物在室温下搅拌36h，真空浓缩，用SiO2色谱纯化(20∶1，CHCl3/MeOH)，制得7.5mg(96％)的无色泡沫状XJB-7-43。获得以下特征分析数据：LC-MS法(Rt5.41min，10min内线性梯度70％～95％CH3CN(水)，0.4mL/min；m/z＝545.3[M+H]+，567.3[M+Na]+)以及HRMS(ESI)m/z对于C29H44N4O4S(M+Na)计算值为567.2981，实测值为567.2971。
首选的自由基清除剂中有一种从包括类泛醌，类泛醌片段组分，无亲水性端基的类泛醌片段组分，超氧化物歧化酶模拟化合物，一种超氧化物歧化酶生物模拟化合物或salen-锰化合物材料组成的基团中选择的材料。
为本领域技术人员所熟知的是，致电离辐射激活线粒体氮氧自由基合酶(“mtNOS”)，导致呼吸链抑制，产生过量超氧自由基，过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite，ONOO)产物以及亚硝基化损伤。致电离辐射造成的伤害被认为是被缓解了[见Kanai，A.J等。Am J Physiol.383：F1304-F1312(2002)；以及Kanai，A.J等人，Am J Physiol.286：H13-H21(2004)]。这个实施方案的组合物的特点是抑制mtNOS，从而可以阻止过量超氧自由基，过氧化亚硝酸盐和亚硝基化损伤的发生。
采用全身性给药防止二次辐照损伤可能导致不想要的副作用。一种限制或防止这些不良的副作用的办法是使用肽载体法对线粒体靶向给药。
在一个实施方案中，一个强效NOS抑制剂，2-氨基-6-甲基-噻嗪(“AMT”)的非精氨酸类似物，被选定为负载物。膀胱上皮细胞辐射会引起超氧化物和一氧化氮(“NO”)产物增加，分别将AMT或4-氨基-TEMPO灌注入小鼠膀胱，以确定NO抑制或清除自由基是否更具辐射防护性。
非共轭和共轭NOS拮抗剂(AMT，100μM)或非共轭和共轭氮氧自由基衍生物(4-氨基-TEMPO，100μM)在37℃条件用于培养32D c13造血细胞两小时。
Figure BPA00001330558900771
4-NH2-TEMPO AMT
培养完成后，细胞破碎，线粒体分离用于质谱分析，将从线粒体分离的化合物表示为Na+加合物。由此产生的光谱(未显示)表明，借助所连接GS-源性定位序列，4-氨基-TEMPO只会渗透穿过线粒体膜。进一步光谱数据(未显示)表明，大量非共轭AMT不进入线粒体膜。因此，靶向性肽成功的将NOS拮抗剂和氮氧自由基导入线粒体。
进行进一步的生理研究，以确定肽定位AMT和4-氨基-TEMPO对辐照后的膀胱上皮细胞内的NO和过氧亚硝基盐的生成的影响。辐照后这些细胞被置于一个8孔玻板式培养槽内培养3天，然后用微传感器测量24h。
辐照后未经处理的细胞和用非共轭4-氨基-TEMPO(100μM)或非共轭AMT(10μM)，辣椒素处理的细胞，会引起NO的生成以及在相当数量的超氧化亚硝酸盐的生成。细胞用高剂量共轭4-氨基-TEMPO(100μM)处理，过氧化亚硝酸盐的生成量会降低大约4倍。未被辐照的细胞或用共轭AMT(10μM)处理细胞，其NO致过氧化亚硝酸盐的生成几乎完全被抑制。这说明，肽轭合物与膜非透性4-氨基-TEMPO或AMT耦合或以共价键连接，并可促进4-氨基-TEMPO穿过线粒体膜。此外，这一数据表明，肽轭合物对AMT的NOS抑制活性或4-氨基-TEMPO的自由基清除活性并无干扰，并且AMT是一中更有效的辐射防护剂[Kanai，A.J.等。利用肽基轭合物的线粒体靶向辐射防护剂，ORGANICAND BIOMOLECULAR CHEMISTRY(印刷中)]。
质谱定量研究，用于比较几个AMT肽轭合物，特别是XJB-5-234，XJB-5-33，XJB-5-241，和XJB-5-127的线粒体膜渗透效果。fmole/10μM(数微升，蛋白质含量以fmole计算)线粒体蛋白比率提供了一种集中于标靶部位的轭合物的相对量。表3显示，最有效轭合物XJB-5-241。
表3
Figure BPA00001330558900781
在三元取代(E)-烯基部分嵌入XJB-5-241比双取代(E)-烯基XJB-5-133或GS肽基片段XJB-5-127具有更强的构象影响，见Wipf，P.等，甲基-和(三氟甲基)烯烃肽电子等排体：合成及对其作为β-转角促进剂和肽类似化合物的潜力的评价。J ORG.CHEM.63：6088-6089(1998)；以及Wipf，P.等，用于三取代(E)-烯烃和环丙烷肽电子等排体合成的内炔的亚胺加成反应。ADV.SYNTH.CAT.347：1605-1613(2005)。这些数据表明，一个确定的二级结构和适当的构象改变对于完成可减少亚硝基化和氧化作用的化合物渗透通过线粒体很重要。
一个非水解烯烃等排体的存在起到代替不稳定肽键的作用，并能明显延长作用机制。较具刚性的(E)-烯烃(Ψ[(E)-C(R)＝CH])呈现出有用的，构象改变的结构模拟化合物，并用于替代许多酶抑制剂的水解不稳定氨基键。这一方法的主要目标是肽键精确的几何模拟；但是，(E)-烯烃也可以调节的理化特性，溶解性，和亲油性，氢供体和受体的数量，等，具有母结构，因此，与单肽相比普遍具有不同的代谢命运。
本发明所采用靶向传输法极为有利，因为有些二乙基溴乙酰胺NOS(nNOS)拮抗剂和大多数抗氧化剂，包括氮氧自由基衍生物，细胞渗透性差，如果不使用轭合物，所需要的有效治疗浓度大于100μM。
根据本发明的这个实施方案所述方法，其特征在于传递一种组合物到线粒体，包括将所需的负载物传递到所述的线粒体，例如，该负载物可以是(a)一种自由基清除剂(利用一种可能具有对线粒体膜有高亲和力的β-转角基元的膜活性肽基片段)或(b)键合了膜活性肽基片段的一氧化氮合酶拮抗剂
实施例8 JP4-039的合成(见图11)
根据如下步骤合成JP4-039。
Figure BPA00001330558900801
(R，E)-2-甲基-N-(3-甲基亚丁胺)丙烷-2-磺酰亚胺(1)(Staas，D.D.；Savage，K.L.；Homnick，C.F.；Tsou，N.；Ball，R.G.J.Org.Chem.，2002，67，8276)-向由异戊醛(3-甲基丁醛，5.41mL，48.5mmol)溶于CH2Cl2(250mL)形成的溶液中加入(R)-2-甲基丙烷-2-磺酰亚胺(5.00g，40.4mmol)，MgSO4(5.0eq，24.3g，202mmol)and PPTS(10mol％，1.05g，4.04mmol)并将所生成的悬浮液在室温(室温约为25℃)下搅拌24h。将反应产物用硅藻土滤片过滤，所得粗残余物用SiO2色谱纯化(3∶7，EtOAc∶正己烷)，制得6.75g(88％)无色的油状物。1H NMR δ8.07(t，1H，J＝5.2Hz)，2.47-2.38(m，2H)，2.18-1.90(m，1H)，1.21(s，9H)，1.00(d，6H，J＝6.7Hz)。可选择性的，在接下来的反应中，用SiO2滤片过滤获得粗亚胺会获得同样好的效果。
Figure BPA00001330558900802
(丁基-3-炔氧基)(t-丁基)二苯基硅烷(2)(Nicolaou，K.C.等。.J.Am.Chem.Soc.2006，128，4460)-向由3-炔-1-醇(5.00g，71.3mmol)溶于CH2Cl2(400mL)形成的溶液中加入咪唑和(5.40g，78.5mmol)和TBDPSC1(t-丁基)氯代二苯基硅烷)(22.0g，78.5mmol)，将该反应物在室温下搅拌22h。将反应物用SiO2滤片过滤，将SiO2用CH2Cl2洗涤，然后将得到的无色溶液浓缩的到21.4g(97％)粗炔烃，不需要进一步纯化即可使用。
Figure BPA00001330558900811
(S，E)-8-(t-叔丁基二苯基硅氧基)-2-甲基辛基-5-烯-4胺盐酸盐(3)-向由(2)(15.9g，51.5mmol)溶于CH2Cl2(300mL)形成的溶液中加入盐酸锆(15.1g，58.4mmol，分成3部分加入)，并将所生成的悬浮液在室温下搅拌10min。将所制得的黄色溶液冷却到0℃，加入Me3Al(溶于正己烷形成2.0M的溶液，27.5mL，54.9mmol)，搅拌5min，然后加入由亚胺(1)(6.50g，34.3mmol)溶于CH2Cl2(50mL)形成的一种溶液，将所制得的橙色溶液再搅拌4h，搅拌过程中使溶液回温到室温。用MeOH终止反应，并用H2O和CH2Cl2稀释。向溶液中加入HCl(1M)破乳(也可以使用Rochelle’s盐延长搅拌的方法)。将有机层分离，水层用CH2Cl2(2x)洗涤。将分离出的有机层合并，用盐水洗涤，用MgSO4干燥，用硅藻土滤片过滤并浓缩。因为油状物粗品被金属盐污染，将油状物溶于Et2O(乙醚，Et＝乙基)，静置2h，然后容硅藻土滤片过滤并浓缩。将粗残余物用1H NMR分析显示只有一种非对应异构体(＞95∶5dr)。
向由粗残余物溶于Et2O(800mL)形成的溶液中加入HCl(溶于二氧杂环乙烷形成4.0M溶液，17.2mL，68.7mmol)，将反应物搅拌30min，在搅拌过程中有白色沉淀物生成。将沉淀物过滤，用干Et2O洗涤，干燥后得到11.0g(74％经过2步)无色固体(3)。mp(熔点)：151～154℃；[α]D-2.9(c 1.0，CH2Cl2)；1H NMRδ8.42(bs，3H)，7.70-7.55(m，4H)，7.48-7.30(m，6H)，5.90(dt，1H，J＝14.9，7.5Hz)，5.52(dd，1H，J＝15.4，8.4Hz)，3.69(appt，3H，J＝6.5Hz)，2.45-2.20(m，2H)，1.80-1.50(m，3H)，1.03(s，9H)，0.95-0.84(m，6H)；13C NMRδ135.5，134.5，133.7，129.5，127.6，127.3，63.0，52.9，42.1，35.6，26.7，24.4，22.9，21.5，19.1；EIMS m/z 395([M-HCl]+，40)，338(86)，198(100)；HRMS(EI)m/z对于C25H37NOSi(M-HCl)的计算值为395.2644，实测值为395.2640。
Figure BPA00001330558900821
(S，E)-t-丁基8-(t-叔丁基二苯基硅氧基)-2-甲基辛基-5-烯-4-基氨基甲酸酯(4)一向由(3)(10.5g，24.3mmol)溶于CH2Cl2(400mL)形成的溶液中加入Et3N(三乙胺)(3.0eq，10.3mL，72.9mmol)和Boc2O(1.05eq，5.74g，25.5mmol)，并将所生成的悬浮液在室温下搅拌14h。用饱和NH4Cl溶液终止反应，将有机层分离，干燥(用MgSO4)，过滤和浓缩。所得粗残余物无需进一步纯化用于下一步反应。
Figure BPA00001330558900822
(S，E)-t-丁基8-羟基-2-甲基辛基-5-烯-4-基氨基甲酸酯(5)-向在0℃条件下由粗残余物(4)(12.0g，24.3mmol)溶于THF(200mL)形成的溶液中加入TBAF(1.0M in THF，1.25eq，30.4mL，30.4mmol)，并将反应物回温到室温搅拌2h。用饱和NH4Cl溶液终止反应，所得有机层用盐水洗涤、干燥(用MgSO4)、过滤并浓缩。所得粗残余物用SiO2色谱纯化(3∶7，EtOAc∶正己烷)，得到5.51g(88％，2步)无色油状物。[α]D-12.7(c1.0，CH2Cl2)；1H NMRδ5.56(dt，1H，J＝15.3，6.9Hz)，5.41(dd，1H，J＝15.4，6.4Hz)，4.41(bs，1H)，4.06(bm，1H)，3.65(appbq，2H，J＝5.7Hz)，2.29(q，2H，J＝6.3Hz)，1.76(bs，1H)，1.68(m，1H)，1.44(s，9H)，1.33(m，2H)，0.92(m，6H)；13C NMRδ155.4，134.3，126.9，79.2，61.5，50.9，44.5，35.6，28.3，24.6，22.5；EIMS m/z 257([M]+，10)，227(55)，171(65)；HRMS(EI)m/z对C14H27NO3计算值为257.1991，实测值为257.1994.
Figure BPA00001330558900831
(S，E)-5-(t-丁氧羰基氨基)-7-甲基辛基-3-十八碳烯酸(6)-向在0℃条件下由(5)(1.00g，3.89mmol)溶于丙酮形成的溶液中加入(40mL)新制备的琼斯试剂(Jones Reagent)(2.5M，3.89mL，9.71mmol)，并且将反应物在0℃条件下搅拌1h。将所生成的黑色溶液用Et2O(3x50mL)萃取，将有机层分别用水(2x75mL)、盐水(1x50mL)洗涤，干燥(用Na2SO4)，过滤并浓缩得到990mg(94％粗品)黄色油状羧酸(6)，其无需进一步纯化即可使用。
Figure BPA00001330558900832
TEMPO-4-基-(S，E)-5-(t-丁氧羰基氨基)-7-甲基辛基-3-烯己酰胺(7)-在0℃条件下由(6)(678mg，2.50mmol，粗品)溶于CH2Cl2(35mL)形成的溶液中加入4-氨基tempo(1.5eq，662mg，3.75mmol)，EDCI(1.2eq，575mg，3.00mmol)，DMAP(1.1eq，339mg，2.75mmol)和HOBt-水合物(1.1eq，377mg，2.75mmol)，并将所得橙色溶液在室温下搅拌14h。反应产物用CH2Cl2稀释，用饱和NH4Cl溶液洗涤，并将有机层干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。所得粗残余物用SiO2色谱纯化(1∶1到2∶1，EtOAc/正己烷)，得到857mg(76％，经过2步)桃红色固体。mp 61℃(软化点：51℃)；[]D 23+35.6(c 0.5，DCM)；ESIMS m/z 365(40)，391(50)，447([M+Na]+，100)，257(20)；HRMS(ESI)m/z对于C23H42N3O4Na的计算值为447.3073，实测值为447.3109.
该化合物，结构式见上文结构式4，可以用如图11B所示的过程合成。简言之，合成可以按如下步骤完成：向含(1)的CH2Cl2溶液中加入盐酸锆之后再加入Me2Zn，然后加入N-磷酸二苯 基-1-苯基亚甲胺(亚胺)溶液。将反应混合物回流、过滤、洗涤并干燥得到(2).用TBAF处理(2)除去TBDPS的保护基团，从而导致(3)的生成。将端醇脱水得到烯烃(4)，将(4)进一步进行臭氧分解得到酯(5)。与上文所述的用于JP4-039的合成的类似方法利用Boc保护基团也可用于酰化氨基，以及端羧酸与4-氨基TEMPO反应生成(6)。
实施例9-一种线粒体靶向氮氧自由基/半短杆菌肽S轭合物保护小鼠胚胎细胞防止γ射线(见，Jiang，J，等。，Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.，Vol.70，No.3，pp.816-825，2008)
氮氧自由基的融合与分布的EPR分析。为了比较融合效率，用10μM氮氧自由基培养小鼠胚胎干细胞(1×107/mL)10min。用2mMK3Fe(CN)6培养5min再与乙腈(1∶1v/v)混合后，培养基、细胞悬液或线粒体悬液中氮氧自由基的ESR谱在如下条件用EOL-RE1X电子顺磁共振光谱仪记录：中心场3350G；扫描范围25G；场调制0.79G，微波功率20mW；时间常数0.1s；扫描时间4min。融合效率用(Einitial-Emedium)/Einitial×100％计算。根据制造商的说明书用线粒体提取试剂盒(Pierce，Rockford，IL)分离线粒体。融合到线粒体中的氮氧自由基数量归一化到细胞色素c氧化酶IV亚型的含量。
超氧化物的生成。用氧化依赖性荧光染料DHE评估细胞内超氧自由基的生成。DHE是胞渗透性的，并且在超氧化物的存在时被氧化成能够嵌入DNA的荧光溴乙非啶。简而言之，在培养结束后用5μM DHE处理细胞30min。让后用胰蛋白酶消化收集细胞并在PBS中重悬。用附带CellQuest软件的FACScan流式细胞仪测定溴乙非锭荧光性，用585/42nm带通滤波器从10000个细胞获得平均荧光强度。
CL氧化。用与荧光底物Amplex Red在MP-11催化反应中所生成产品的荧光HPLC确定发光氢过氧化物。在含1mM CaCl2、0.5mM EDTA和0.5mM SDS(pH 8.0在室温下30min)的磷酸缓冲溶液中用胰磷脂酶A2(2U/ml)将氧化磷脂水解。之后加入Amplex Red和MP-11，将试样在4℃培养40min。用配有荧光检测器(RF-10Ax1，Ex/Em＝560/590nm)和自动进样器(SIL-10AD vp)的岛津LC-100AT高效液相色谱系统(Shimadzu LC-100AT vp HPLC)分析由高效液相色谱(HPLC)(Eclipse XDB-C18柱，5μm，150×4.6mm)分离得到的产品，流动相为NaH2PO4(25mM，pH 7.0)/甲醇(60∶40v/v)。
磷脂酰丝氨酸(PS)外翻。磷脂酰丝氨酸外翻用流式细胞计分析，使用膜联蛋白-V套件。简言之，获得的细胞在去流式细胞计分析之前在黑暗中用膜联蛋白-V型FITC和PI染色5min。用附带CellQuest软件的FACScan流式细胞计收集一万个事件。
小鼠胚胎干细胞的γ射线照射剂量存活曲线。用2ml培养基将细胞接种与35mm的Petri培养皿中，每只培养皿的细胞密度在100～1000之间。细胞在γ射线照射之前(10min)或照射之后(1h)用GS氮氧自由基(XJB-5-125)处理。照射4h后将XJB-5-125从培养基中除去。经过9天的培养期后，在80％的甲醇中用0.25％的结晶紫和10％的福尔马林(35％v/v)对集落进行固定并颜色30min。经计数有≥50个细胞是存活细胞。存活分数是以该样本的平板效率相对于对照样本进行计算的。
图12表明，融合到细胞和线粒体中氮氧共轭XJB-5-125比其未共轭的亲代非共轭4-氨基-TEMPO在小鼠胚胎肝细胞中的融合更有效。(A)表明他们在小鼠细胞和胚胎细胞线粒体中的融合效率。(B)显示了从线粒体中回收的氮氧自由基有代表性的EPR谱。
图13显示了氮氧共轭XJB-5-125保护小鼠胚胎细胞抑制γ辐照诱导产生超氧化物和磷脂过氧化作用。(A)超氧化物的生成。将细胞暴露在10Gy的γ射线辐照下。在辐照前10min或辐照后1h加入XJB-5-125(20μM)，经过5h培养后除去。在指定的时间点将细胞与5μM DHE培养30min。用附带CellQuest软件的FACScan流式细胞计分析溴乙非锭荧光。使用585nm带通滤波器从10000各细胞获得平均荧光强度。(B)心磷脂的氧化。心磷脂氢过氧化物采用荧光高效液相色谱为基础的AmplexRed法测定。所列数据是平均值±标准偏差(n＝3)。*p＜0.01对应未被辐射的细胞；*p＜0.01(0.05)对应在同样条件下未经过XJB-5-125处理的辐照后细胞。Insert是一典型的来自细胞的磷脂的2D-HPTLC剖面。
图14显示，氮氧自由基共轭XJB-5-125保护细胞抑制γ辐照诱导的细胞凋亡。(A)阻止γ辐照诱导的小鼠胚胎肝细胞胞质中细胞色素c的积累。(B)细胞色素c与肌动蛋白的密度比。使用Labworks图像采集和分析软件(UVP，Upland，CA)，由密度得到半定量的带宽。细胞色素c释放的水平以表示为细胞色素C与肌动蛋白的平均密度比。(C)剂量(5，10和20μM)取决于XJB-5-125(预处理)对γ射线辐照(10Gy)诱导的磷脂酰丝氨酸(PS)外翻的辐射防护作用。经过48h辐照后培养，在去流式细胞计分析之前收集细胞并用膜联蛋白-V-FITC和碘化丙啶试剂染色。(D)时间(2，3，4，5，and 6h)取决于XJB-5-125(20μM)对γ射线(10Gy)辐照诱导的小鼠胚胎肝细胞中中磷脂酰丝氨酸(PS)外翻(后辐照48h)的辐射防护作用。(E)XJB-5-125对γ射线(10Gy)引起的人支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞中的磷脂酰丝氨酸(PS)外翻的影响。细胞用XJB-5-125(5或10μM)在辐照前(10min)或辐照后(1h)进行处理。在后照72h后分析磷脂酰丝氨酸(PS)外翻。所列数据是平均值±标准偏差(n＝3)*(&)p＜0.01(0.05)对应没有经XJB-5-125处理的辐照后细胞，#p＜0.05对应经过用XJB-5-125预处理的细胞。
图15显示了氮氧自由基共轭XJB-5-125对γ辐照剂量与小鼠胚胎肝细胞存活曲线的影响。细胞在辐照10min前或辐照1h后用XJB-5-125(20μM)处理，经4h培养后除去。存活分数以相对于对照样本的平板效率计算。该数据通过SigmaPlot 9.0(Systat Software)用多靶单点模型拟合，所列数据是平均值+标准偏差(n＝3)。
图16说明了GS共轭氮氧自由基，XJB-5-125，对γ射线剂量/32D cl 3小鼠造血细胞的存活曲线的影响。与32D cl 3细胞(0.797Gy)相比，在XJB-5-125或Tempol中培养的细胞，其Do(剂量)(分别为1.138或1.209Gy，)增加了。在XJB-5-125中培养的细胞其存活曲线的肩区比tempol中培养的细胞的肩区值5.82增大了18.24n。
实施例10 JP4-039辐射防护性能试验
图17A和17B是显示GS-氮氧自由基化合物JP4-039提高小鼠暴露在9.75Gy下全身照射存活率的曲线图。在图17A中，小鼠按每公斤体重接受10mg的如图5所示每种化学品腹腔注射。根据公开的方法，24h后全身接受辐照9.75Gy。接下来按照IACUC准则，考察小鼠的存活率。与辐射照后对照样本(P＝.0008)相比，接受JP4-039的小鼠的存活率明显提高。在图17B中，小鼠在9.75Gy辐照前10min(正方形符号)或者在9.75Gy辐照后4h(三角形符号)接受JP4-039腹腔注射。
图18是显示出GS-氮氧自由基化合物JP4-039提高全身暴露在9.75Gy辐照下的小鼠存活率的曲线图。由15只小鼠构成的样本组按照每千克体重10mg剂量的每一种指定的GS-氮氧自由基化合物或载体(聚氧乙烯氢化蓖麻油与乙醇按1∶1比例混合，然后用蒸馏水稀释至10倍)接受腹腔注射。小鼠在全身辐照前24h接受10mg每千克剂量的腹腔注射。对比组只接受辐照。统计显示接受GS-氮氧自由基化合物(P＝.0005)的小鼠，其存活率有明显的提高。
图19显示，造血细胞经过辐照24h后供给GS-氮氧自由基JP4-039，表明P4-039是有效的辐射缓解剂。辐照存活曲线由32D c1 3小鼠造血祖细胞系的细胞获得，细胞辐照前在10μM JP4-039中培养1h或辐照后接种在含有10μM JP4-030的甲基纤维素中。细胞接受0～8Gy的辐射，接种在含有培养基的0.8％的甲基纤维素中，在37℃培养7天。对大于50个细胞的集落计数，采用二次线性方程和多靶单点模型进行数据分析与只有32Dc1 3细胞本身时n＝1.29+0.13(p分别为0.0109或0.0022)相比，培养在JP4-039中的细胞具有更好的抗辐射性，显示其存活曲线具有增大的肩峰，分别为n＝5.25±0.84(如果在辐照前加入药物)或者n＝4.55±0.47(如果在辐照后加入药物)。
图20显示，JP4-039是一种有效的KM101人骨髓基质细胞辐射损伤缓解剂。在辐照前1h或辐照后24h将KM101细胞置于单纯的培养基中或者JP4-039(10μM)中培养。这些细胞接受辐照的剂量范围在0～6Gy，并接种于4孔平板。7天后这些细胞用结晶紫染色并对集落大于50个细胞进行计数。辐照前或辐照后培养在JP4-039中的细胞显示更具有抗辐射性，与KM101细胞在n＝1.1±0.1处(p＝0.0309或0.0386，分别地)相比，分别在n＝2.3±0.2或n＝2.2±0.2处出现增大的肩峰。对于不同的剂量条件没有明显的变化。
实施例11 NOD/SCID小鼠模型优化JP4-039的临床试验
我们有大量关于用NOD/SCID鼠试验JP4-039用于人骨髓基质干细胞和造血干细胞从导致造血综合征的全身辐射恢复效果的初步数据。图21A显示了脐血移植I.V27天后收集的NOD/SCID鼠骨髓中的人类细胞监测结果，显示出继辐照、近端胫骨钻孔(见下文)和人脐血注射后的NOD/SCID鼠骨髓中的人类CD45+造血干细胞(浅灰色)的流式细胞仪分析和鉴定。
6只NOD/SCID鼠在接受350cGy辐射后，注入1x107人脐血(CB)单核细胞(MNC)。经CB MNC初次注射5个月后，6只小鼠的右腿接受10Gy辐射。辐照24h后在胫骨钻孔(见图21B)，钻头尺寸为直径1mm(Dremel Corp.)。钻孔24h后对6只小鼠中的3只注入1x107CB MNC。对照小鼠(3只)不接受CB注射。CB注入27天后，收集骨头进行组织化学分析，并用用PE标记的抗-CD45抗体(BD Biosciences)对BM中的人类CD45+细胞(浅灰色)进行流式细胞仪分析。分析在一台BD LSR II flow流式细胞仪(BD Biosciences)上进行。当与对照鼠(小鼠4)进行比较时，所有接受人类CB MNC的小鼠(编号1-3)中都可以检测到人类CD45+细胞。
在没有经过高剂量辐射的腿部和经过介于百分之0.028～0.892高辐照的腿部内，人类CD45+细胞的百分数介于百分之0.045～3.288范围内。对这些小鼠，大剂量辐照和非大剂量辐照的腿部之间没有差别。虽然数据表明有一种趋势(在高剂量辐照的腿部人CD45+细胞百分数较低)，但是将全身非大剂量辐照与1000cGy的大剂量腿部辐照相比没有明显的差异。第7天的骨照片见图21B。
图21B是通过用2mm直径的单一皮质骨钻头手术7天后胫骨创面横截面的显微照片，伤口在近端骨骺板下胫骨2毫米侧面。在伤口自发修复的中间阶段，鲁棒松质骨填充髓内腔以及皮质窗口。正如在本应用中所推荐的，这个时间点对于评估由辐射导致的骨髓基质细胞成骨抑制和用JP4-039恢复是最佳的。箭头指示伤口边缘.(甲苯胺蓝染色，x35)(58)
实施例12 GS-氮氧自由基化合物的局部和经皮吸收。
计划用实用的皮肤贴片输送JP4-039或其他在此需输送的化合物。这块皮肤贴片可以提供给一个在辐照之前、之间或之后的主体，包括24h或以上被辐照的主体。在初步研究中，我们试图表征在小鼠皮肤局部使用的典型GS-氮氧自由基XJB-5-125的吸收和渗透。基于其抑制ROS的产生、抑制细胞凋亡和抑制线粒体脂质氧化损伤过度表达的能力，选择XJB-5-125为一种潜在的局部用药。XJB-5-125包含了其中的(Leu-D-Phe-Pro-Val-Orn)片段并已被证明可减弱ActD诱导的剂量依赖性(2.5-20μM)的PS外翻。它也可以抑制细胞色素c从线粒体释放，抑制心磷脂过氧化反应。一种化学品的物理性质对其渗入并通过皮肤的能力是至关重要的。两个重要的因素是分配系数log(辛醛/水)(Ko/w)和分子量。对XJB-5-125，log Ko/w＝4.5，分子量是956，这种亲脂性“规则”是基于一种化合物从亲脂性角质层分出和进入更多亲水性表皮和真皮的需求。XJB-5-125的log Ko/w和分子量MW与酮康唑(log Ko/w＝4.34，MW＝532)、克霉唑(log Ko/w＝6.27，MW＝902)以及吲哚美辛(log Ko/w＝4.23，MW＝358)类似。暗示了用类似于那些用于高效输送这些药剂的配方的输送可行性。就像JP4-039，XJB-5-125是一个辐射缓解药剂以及防护药剂(见图15)。
将皮肤小贴片(2cm2)被放置于一Bronaugh式流通扩散细胞系统(PermeGear，Riegelsville，PA)(图22)。然后将其放置在两片惰性聚合物Kel-F之间并夹住以防泄漏。使表皮侧面朝上并暴露于供体溶液(试验溶液)，真皮一侧与受体流体接触。暴露表面积是0.79cm2(直径1cm的圆形腔室)。该皮肤在流通室内形成一个水密密封，因此，只有XJB-5-125穿透该皮肤时，在真皮一侧接受流体(PBS+25％乙醇)将含有XJB-5-125。受体腔用这种缓冲剂灌注，然后用特富龙管导入馏分收集器。使用PBS+25％乙醇是因为它对疏水化合物是高效的沉降剂，并能比其他手提溶液产生更好的体内外相关性。通过放置在金属块中的腔室内用循环水浴加热，将皮肤保持在32℃。在导入试验化合物之前将皮肤恒温60min。将75μL XJB-5-125放置在皮肤上，并允许留在实验过程中。将排出物收集24h。(图23-25)。
为了评估XJB-5-125在小鼠皮肤的渗透，用动物剪((#40刀片)将C57/BL6小鼠剃光。接着用Nair(脱毛剂)简单处理，出去剩余的毛。脱毛后立即清洗皮肤以防进一步刺激。在研究之前皮肤允许恢复24h。这将减少毛的干扰，并在皮肤渗透性研究之前让时间治愈小擦伤。
在研究完成后，从扩散室中取出皮肤。使用布鲁克曼胶带(3M公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州)通过顺序胶带剥离(15次)除去角质层，角质层含有大多数局部使用的化合物，但从治疗角度看是不相关的。将其余的皮肤(可自行生长发育的表皮和真皮)和透皮污水用ESR进行针对XJB-5-125的检测。
250℃下，将小鼠皮肤在400μL、50mM、pH 7.4的PBS中均质化。在从Alpha Wire Corp.(Elizabeth，NJ，USA)获得的透气性Teflon管(内径0.8mm，壁厚0.013mm)中用日本电子JES-RE1X谱仪进行电子顺磁共振(EPR)检测，Teflon管用(约8cm长)70μL含有28.5％乙腈和2mM K3Fe(CN)6的样品填充，对折后放入开口的EPR石英管(内径3.0mm).(图24)
在中心场334.7mT；功率20mW；场调制0.079mT；扫描宽度5mT；接收器增益400and 4000；时间常数，0.1s条件下记录EPR谱。用EPRware软件(Scientific Software Services，B1oomington，IL，USA)收集谱图。
这些初步的实验表明，XJB-5-125能充分渗透穿过完整的皮肤。此外，24h后的总透皮吸收和出现在可自行生长的皮肤中XJB-5-125水平可使用本发明所述的技术成功地测量。使用3个不同的供体溶液考察了配方对局部输药的影响(图25)。供体A＝1mM XJB-5-125在DMSO中，供体B＝1mM XJB-5-125在95％丙二醇+5％亚油酸中，供体C＝1mM XJB-5-125在50％EtOH+40％HSO+5％丙二醇+5％Brij30中。一共75nmole放置在每一块皮肤的上面以开始试验(75ul of 100mM)。XJB-5-125输送进入皮肤24h后，有0.07％-0.46％留在皮肤中。其较高的输送效率在其他局部输送产品的范围内。
鉴于观察到，在2.5～20μM浓度范围并假设组织密度为1g/cm3时，XJB-5-125在细胞内是具有活性的，基于这些数据的大量分析表明，XJB-5-125的局部输送方法通过增强全身血液水平来保护骨髓是可行的。
此外，通常认为总透皮吸收与供体浓度线性相关，该事实意味着提高供体的浓度将大幅度提高局部输送。这些初步的研究表明的XJB-5-125的传输达到治疗水平的可行性，并且表明，较小的JP4-039分子，以及本发明所述的其他化合物，作用作传输治疗造血综合症的辐射缓解剂的皮肤贴。
实施例13(推荐)
下述方法可以用来选择和优化最好的GS-氮氧自由基JP4-039(辐射损伤缓解药剂)，JP4-039能增强然骨髓基质细胞及更新人类基质细胞系进入NOD/S CID小鼠的受辐射肢体的种植效率。MnSOD-过度表达细胞是阳性对照样本。
A.KM101-MnSOD/ds-red(control KM101-ds-red)克隆细胞系实验。12NOD/SCID小鼠组接受300cGy全身辐射(低剂量腿)及左后腿(高剂量腿)接受1000cGy的高剂量辐射，然后在24h后对每一个细胞系静脉注射1x105或1x106个细胞(组1和组2)。第三组小鼠在辐射24h之前接受MnSOD-PL静脉注射，然后注射KM101-MnSOD/ds-red细胞。第四组在辐射24h之前进行MnSOD-PL静脉注射，然后注射对照KM101/ds-red细胞。该实验可以重复两次。在细胞移植第1、3、7、14天后小鼠后肢取出骨髓，对总细胞的百分数和形成细胞集落(细胞是呈阳性的人类源细胞)的可收回数打分。得分可以通过ds-red阳性，然后通过在体外利用基质细胞形成的集落进行。我们可以记录总分，然后是人源基质细胞的百分数。
B.通过线粒体靶向辐射防护药剂/缓解药剂JP4-039(GS-氮氧自由基)的给药改善人骨髓基质干细胞系KM101种植实验。这个试验，对所有的组，基本上可以按照上述(A)的方法进行，但对辐照后接受JP4-039(24h)的亚组(细胞系注射后同一天，或一个亚组腹腔接受JP4-039(细胞移植后每天或每周))。细胞可以高剂量到低剂量辐照的在第7天、14天、21天，从辐照后的股骨取出，并在体外培养以使人干细胞集落形成祖细胞(CFU-F)。进入高剂量和低剂量辐照四肢的人类细胞可通过ds-red的细胞分选定量。对每一个试验可进行2次。
C.如上述(A)的实验，但代换为从一个45岁的供体细胞取代新鲜人类骨髓Stro 1+基质细胞。
D.如上述(B)的实验，替换为Stro 1+人类骨髓基质细。
统计考虑-在(A)中，我们提出在4个不同的时间点对4个组样本进行对比：有或没有MnSOD、KM101细胞注射量，根据DsRed-KM101细胞的数目注入是105或106 KM101 cells。在(B)中，我们提出针对(A)中相同端点，采用不同的剂量和试验化合物使用方案，在3个不同的时间点对10组样本对比。除了使用人基质细胞代替KM101细胞外，(C)和(D)分别与(A)和(B)相同。该试验中所有的对比条件分别对高剂量受辐射腿和低剂量受辐射腿独立地进行。方差分析和杜克检验可用于这些分析。样本大小可以由两个样本t检验两两比较进行估计。由于缺少初步数据，样本大小的估计是基于预期的群组之间的差异即根据标准差σ进行检测。在每个时间点，每组6只小鼠可以牺牲。用这样的样本大小，使用具有显着性水平0.05的使用双面两样本t检验。将有82％功效来检测群体之间1.8σ的差异。
作为次要端点，(人类)成纤维细胞集落形成单位CFU-F的数量也能用与主要端点相同的方法进行群组之间的比较。
预计MnSOD在KM101-MnSOD/ds-red细胞中的超表达将会导致在NOD/SCID小鼠受高低两种剂量辐射的肢体中较高的种植效率。我们预计在KM101克隆系细胞系输液之前对造血微环境进行MnSOD-PL治疗，将进一步提高KM101-MnSOD/ds-red和KM101-ds-red细胞系的植入。我们预计种植效率的最高百分数将在辐照前接受MnSOD-PL和注射KM101-MnSOD/ds-red细胞的小鼠中被检测到。
我们预计，细胞移植后JP4-039每天给药将有助于通过降低因骨髓微环境的辐照而导致的自由基的产生，提高所有基质细胞系的植入稳定性。
也许使用一个对于JP4-039惰性的对照化合物，(JP4-039没有氮氧活性组分)。基于这些实验结果，可以导出骨髓基质干细胞种植的最佳条件，而这些条件可能会在下述实验中使用。
实施例14(推荐)
挑选和优化GS-氮氧自由基JP4-039治疗，以提高人类CD34+脐带血多向造血干细胞祖细胞移植进入已经植入了人类骨髓基质干细胞且遭受辐照后的NOD/SCID小鼠的四肢。
1.TBI处理C57BL/6J小鼠实验和小鼠骨髓筛查。(初步系统试验)
2.实验中采用最佳移植法将人类KM101细胞植入遭受辐照后的NOD/SCID小鼠(预先将MnSOD-PL(锰超氧化物歧化酶质粒，manganese superoxide dismutase plasmid liposome)输入接受辐照前的这些小鼠，然后注射KM101-MnSOD/ds-red，每日补充JP4-039)。小鼠静脉注射1×105或1×106的来自人类脐带血库的CD34+LIN-细胞。对照细胞可以每次注射105或106CD34+LIN+(分化型祖)细胞。每组12只小鼠。
这些实验可以按照两个方案进行。
a.脐血细胞与KM101-MnSOD/ds-red细胞同样的时间注入。
b.脐血细胞在从示例13的移植试验中回收KM101-MnSOD/ds-red细胞的最佳时间注入。这应该是在基质细胞注入后的第7天或第14天。
在这些实验中，小鼠可以在继脐血干细胞移植之后的两个月的一连串时间点内进行观察和试验。人类外周血造血干细胞的百分率可以以每周的外围血液样本记录，而形成CFU-GEMM集落细胞的数量可以在死去的小鼠的移植骨骼中测出。
在脐血移植后的第7天、14、21、28或60天，子组的小鼠可能被牺牲，并且可以从高剂量和低剂量辐照后的股骨采取所有细胞，并对人类多向造血祖细胞s-CFU-GEMM进行检测。检测可以用两种方法进行：
a.采用人类单克隆抗体规则为人类CD34+细胞打分。
b.集落在人类CFU-GEMM培养基上形成，然后按照完整小鼠子集对人类集落进行二次打分，人类细胞集落形成于7天14天进行体外检测。
体外实验可平行进行如下：
KM101-MnSOD-PL的平台期基质细胞可在体外辐照到100，200，500，1000cGy，然后CD34+LIN-人类脐血细胞中与基质细胞在体外进行共培养。对照组可以包括未辐照的KM101-MnSOD/ds-red，辐照的KM101-ds-red细胞，未辐照的KM101-ds-red。
我们可以每周记录这些培养过程中的人类鹅卵石群岛(干细胞集落)，标出累计鹅卵石岛的形成，以每周获取的细胞表示的累积产生的非贴壁细胞，检测每周获得的细胞以评价CFU-GEMM形成。这些研究可能会进行了两-三周。在体外共培养研究只能部分重复体内造血微环境，因此两个星期应该是检测贴壁KM101细胞层内的MnSOD-PL表达是否会增加脐血干细胞移植的最有效的时间。
3.以如上述(1)所述的JP4-039脐血移植的补充方案进行实验，以通过去除辐照骨髓基质干细胞环境中的ROS产物来提高人类脐带血干细胞的归巢，稳定平静，和复育能力。
在体外实验中每天向共培养的培养基补充药物JP4-039。将辐照后的KM101单克隆细胞系与脐血干细胞进行共培养实验，可以通过每天添加JP4-039，或活性类JP4-039实施。对照实验可以包括添加推测可能会随着时间推移产生越来越少的CFU-GEMM的CD34+LIN+分化型脐带血细胞。基质细胞培养可按照上述方法进行辐照，补充脐带血细胞，及培养记录。
12只小鼠的实验组，可以得到上述针对人类CFU-GEMM细胞植入的最佳治疗方法，然后子组可以按以下方式处理：
a.JP4-039每周两次
b.JP4-039每天一次
c.非活性JP4-039类似物，每天一次
4.上文所述实验(1)用新鲜的人类Stro 1+骨髓细胞取代KM101单克隆细胞系。
5.上文所述实验(2)用人类Stro 1+骨髓细胞取代KM101单克隆细胞系。
统计学考虑-在(1)中，我们用MnSOD-KM101和/或105/106 CD34+细胞，在7组间比较5个不同的时间点的CD45+细胞数量。在(2)中，针对(1)中同一端点，我们可以比较7组间5个不同时间点，使用KM101，CD34+细胞，KM101以及CD34+细胞，实验化合物单次或双次给药，或实验化合物无活性类似物单次或双次给药。除了我们可以利用人类Stro 1+骨髓细胞替代KM101细胞外，任务(3)及(4)分别与例13的(A)和(B)相同。这项任务中对于接受高或低剂量辐照的腿可以进行所有的比较。采用Tukey实验的方差分析可用于这些分析。类似于例13样本大小的考虑，我们每一个时间点每组将使用6只小鼠。作为次要端点，对CFU-GEMM数也可以作为主要端点以同样的方法在组间进行比较。
可能的结果-基于实施例13的结果，我们预期脐血干细胞和人骨髓基质干细胞在体外归巢可以在基质细胞移植前通过MnSOD-PL处置小微环境进行优化，而且MnSOD-PL过度表达KM101细胞将在辐照微环境中显示出更好的稳定性。我们预计JP4-039的治疗将进一步提高造血细胞的存活率，增加CFU-GEMM的数量。
实施例15(推荐)
这些实验通过JP4-039将利用人类基质细胞进行骨生成用作骨髓损伤的有效缓解手段。JP4-039可被实验用于通过源自格根包尔氏细胞的人类基质细胞产生的人类胶原蛋白修复在NOD/SCID小鼠的胫骨近端的人为骨折，通过抗氧化剂JP4-039的治疗能够增强骨折愈合度。
A.用KM101-MnSOD/ds-red移植的小鼠与KM101细胞相比较实验。小鼠可能如上所述在两个胫骨近端钻孔，然后辐照全身剂量300cGy，一后肢的剂量1000cGy，然后在24h后每个细胞系注射1×105骨髓基质细胞。小鼠可以观察21天，在连续七天时间点胫骨移植并测定骨骼愈合过程中人类胶原蛋白的相对含量。
B.在重复上述实验(A)中的实验中，每周或每天补充注射JP4-039(每组12只小鼠)。
C.在辐照前24h小鼠接受MnSOD-PL的静脉注射，然后注射KM101-MnSOD/ds-red或KM101。
D.根据上述(C)所述方法，在细胞系注入之前将顺序打乱注射MnSOD-PL。
E.根据(A-D)所述实验，用新鲜Stro 1+间质细胞取代KM101单克隆细胞。
统计考虑-在(A)中，我们针对人类胶原蛋白百分比，在3个不同时间点对17组进行比较，使用KM101细胞，MnSOD，实验性化合物单次或双次给药，脓毒症MnSOD，或者是其中的一些组合。(B)与(A)相同，除去用人类Stro 1+骨髓细胞代替KM101细胞。这项任务中所有可以进行的比较，分别为高，低剂量辐照的腿。其次采用Tukey实验的方差分析可用于这些分析。类似于例13样本大小的考虑，我们将利用每一个时间点每组使用6只小鼠。
可能的结果-我们希望KM101-MnSOD/ds-red将展示改善体内成骨能力。我们预计，辐照前24h对小鼠MnSOD-PL给药将进一步加强归巢和KM101-MnSOD/ds-red成骨细胞的分化。
初步数据显示利用MnSOD过度表达获得的骨髓基质细胞系辐照存活曲线和存活率的提高。其他初步数据预计将显示每个Stro 1+感染MnSOD-PL和KM101-MnSOD/ds-red以及KM101-DS-RED的细胞是有能力在体外和NOD/SCID小鼠体内的钻孔内分化成格根鲍尔氏细胞(成骨基质试验进展)。用JP4-039但是不用上文所述的JP4-039非活性类似物治疗的KM101-MnSOD/ds-red和KM101-DS-RED的辐射存活曲线。我们预计有三个状况：1)MnSOD-PL给药的微环境，2)取自人类的骨髓基质细胞系内的MnSOD的过度表达，以及3)补充JP4-039抗氧化剂疗法会导致最大的人类起源胶原蛋白生成细胞的成骨分化。作进一步的对照实验，我们可以判断是否人类起源的造血干细胞骨是髓基质干细胞的最佳功能所需要的。KM101-MnSOD/ds-red基质细胞移植给NOD/SCID小鼠可以通过注射人类脐血CD34+LIN-，或CD34+LIN+给药，或24h后，观察这些细胞是否产生最佳集落形成。其他对照组可以只是CD34+LIN-，CD34+LIN+造血细胞。另外的对照组可能包括来单独自脐带血或全部脐带血对照组的TRO1+脐血基质细胞祖细胞对照。
实施例16
为了评估XJB-5-131抑制病变和/或老化的迹象的功效，该化合物是在18-21周期间给药于早衰样ERCC1-/Δ小鼠，剂量为2mg/kg葵花籽油载体(促进溶解度)腹腔给药，每周三次(图32)。以葵花籽油按同样的时间表给药的双生ERCC1-/Δ小鼠作为对照。监测治疗组和对照组小鼠的体重及症状，每周两次。
图33提供了一个汇总表显示出从治疗直至死亡的5周的生命过程中，与对照组(葵花籽油)比较，用XJB-5-131的治疗效果(在本图中表示为“XJB”)。这些数字表明了与用XJB-5-131或只用介质(n＝5只小鼠/每组)治疗的小鼠的与年龄有关的症状发作的平均年龄。细胞以黄色突出显示表明，通过XJB-5-131治疗其症状发生有明显推迟。除大多数迹象改善的测量外，XJB-5-131治疗的小鼠的整体老化评分也明显改善。值得注意的是，对神经退行性疾病的所有迹象，包括肌张力障碍，颤抖，共济失调，消瘦和尿失禁对于治疗后的动物而言都被推迟，所提供的强有力的证据表明，XJB-5-131可以抑制氧化应激致神经元的退行性改变。
为了评估XJB-5-131抑制椎间盘退化(一种颈椎退行性病变的指数)的能力，对治疗和对照小鼠椎间盘内的黏多糖水平进行测量，其结果如图34所示。与对照组相比，治疗后的小鼠椎间盘中含有大约百分之三十多的黏多糖，表明其对椎间盘退变的抑制作用。
为了测量XJB-5-131对光老化，Ercc 1-/cond的影响；K14-Cre小鼠，只有其皮肤缺少ERCC1，被剃光毛并脱毛处置，然后用UV-B辐照导致灼伤(500J/m2，中等红斑值)。随后，小鼠用XJB-5-131(80g)乳液治疗每天一次，治疗五天。结果如图35所示，表明相对于对照组(仅用乳液治疗)，治疗组小鼠的皮肤显得更加光滑，健康。
在宏观层面，XJB-5-131给药似乎动物耐受性良好，结果表明他们并没有因为治疗而体重减轻。经过治疗，未经治疗以及对照组动物体重随时间变化图示如图36A-B所示。为了评估XJB-5-131在细胞水平的影响，采用取自Ercc 1-/-小鼠胚胎的小鼠胚胎成纤维细胞(“MEF”)进行了大量实验。如图37所示，这种MEF培养物在环境氧气(氧化应激)条件下制备和生长，然后或者未经治疗的(只用介质)，或用浓度为500nM XJB-5-131(溶于介质)治疗，然后用SA-β半乳糖苷酶染色法(一种细胞衰老的标志)实验。经过治疗的细胞的染色量明显较少。此外，还发现XJB-5-131的治疗可以减少DNA中H2AX焦点的数量(图38)(细胞衰老以及DNA双链断裂的第二标记)，虽然它并不能减少细胞凋亡数量(图39)。
实施例17-JP4-039的防护作用
为了评估JP4-039的治疗潜力，为了安全和保护活性进行了试验。图35和36显示测试结果可用来评估是否JP4-039的不同浓度会对分别取自Ercc 1-/-或野生型小鼠胚胎MEF细胞培养48h后产生毒性作用。即使在最高浓度测试(10μM)，在这两种培养系统没有观察到毒性的迹象，相对于未经治疗的对照细胞(只用介质治疗)细胞的增殖增强。
为了试验JP4-039保护活性，初级MEFs细胞培养物是通过ERCC1-/-小鼠胚胎制备并在会造成这些对活性氧类物质高度敏感的细胞氧化应激的20％氧气(环境空气)中生长。然后这些细胞既可以用1uMXJB-5-131，JP4-039，JED-E71-37或JED-E71-58治疗，也可以不及时治疗(只用介质)，48h后用免疫荧光染色测定p16表达水平(一种不可逆细胞衰老的标记)。如图37所示，用JP4-039治疗的MEF细胞的p16表达水平明显低于未经治疗的细胞中的水平，而XJB-5-131，JED-E71-37 and JED-E71-58据观察在此浓度不那么有效。
实施例18抗氧化剂在细胞培养物中的防护作用
为了评估JED-E71-37 and JED-E71-58的保护活性，原代MEFs细胞培养物是通过ERCC1-/-小鼠胚胎制备并在氧化应激条件下(20％氧气，环境空气)中生长。然后这些细胞或者不治疗或者用1μM的JED-E71-37 or JED-E71-58治疗48h。在图38中可以看出，这两个化合物尽管在氧化应激条件下仍能改善细胞的增殖。
接下来，是这两种药物以及XJB-5-131和JP4-039的能力，每种药物的浓度为1μM，试验其在如前面的段落所述的细胞培养制备，和氧化应激条件下防止氧化导致的DNA双链断裂的能力。治疗以及不治疗的细胞，经过48h的治疗后，用γ-H2AX免疫组织染色(一种DNA双链断裂以及细胞衰老的标记)。JED-E71-58的结果显示在图39，呈现出γ-H2AX的明显减少。JP4-039也有效，但据观察XJB-5-131和JED-E71-37在此浓度无效。
实施例19-氮氧自由基类似物的替代设计
为进一步考察GS-氮氧自由基化合物JP4-039高活性的结构要求，我们设计了几种氮氧自由基类似物。图40显示了氮氧自由基类似物的替代设计的示意图。该设计可以包含以下实验的一个或两个：改善目标基团以优化类药特性和/或考察含有可替代氮氧自由基的基团以改善其氧化剂效力(例如，没有限制地，见Reid，D.A.等，水溶性异吲哚啉氮氧自由基和超氮氧盐酸羟胺UV-VIS探针的合成，Chem Comm.1998，17：1907-8；Iwabuchi，Y.J.，乙醇氧化过程中氧代氨离子的合成应用的研究和开发。J.Synth.Org.Chem.Jpn.2008，66(11)：1076-84)。靶向基团的改性可以包括用Boc取代替代保护基团，如Ac(-C(O)CH3)，Cbz(-C(O)O-Bn，其中Bn是一种苄基)或二烃基磷酸盐。二烃基磷酸盐包括-P(O)-Ph2，其中Ph是苯基。其它改性还包括以电子等排取代靶向基团(例如环丙烷基)内的链(烯)烃基团。含氮氧自由基的基团包括TEMPO和TEMPOL，以及替代氮氧自由基组分，如TMIO(1，1，3，3-四甲基异吲哚啉-2-基氧杂)或1-Me-AZADO(1-甲基2-氮杂金刚烷N-氧基)。这些替代氮氧自由基组分合成途径如下。
图41显示出一个可用于制备各种替代设计的氮氧自由基类似物的合成方法，包括JP4-039，根据结构式2的化合物，根据结构式3的化合物，和其他类似物。对JP4-039专有合成技术如上文示例8所述。JP4-039及其类似物是采用之前由我们实验室开发的(Wipf P.& Pierce J.G.免疫刺激剂半乳糖基神经酰胺(KRN7000)的-C型糖苷类似物的有效合成，Org.Lett.2006，8(15)：3375-8)一个烯丙基胺的不对称高效合成法制备。图41中的一个关键步骤包括用锆法制备非对映烯丙基胺(7)。该方法包括用Cp2ZrHCl将炔(5)锆氢化，Me3Al转移金属转移化，并通过加合反应制得N-tBu-亚磺酰基胺(3)。采用Zn(CH2I)2将链烯烃(8b)Smith环丙烷化是图41中的另一个关键步骤。在这后一步，环丙烷环周围的立体结构在反应后测定。
化合物(10a，JP4-039)，(10b)，(10c)，(14a)，和(14b)的合成(图41所示)是根据以下步骤完成的。
(R，E)-2-甲基-N-(3-甲基亚丁基)丙烷-2-亚磺酰胺(3)。标题所述化合物的合成，在示例8中已被描述(化合物1)。
(丁烯-3-丙烯基氧基)(t-丁基)二苯基硅烷(5)。标题所述化合物的合成，在示例8中已被描述(化合物2)。
(S，E)-8-(t-丁基二苯基硅氧基)-2-甲基辛基-5-烯-4-胺盐酸盐(7)。标题所述化合物的合成，在示例8中已被描述(化合物3)。
Figure BPA00001330558901041
(S，E)-叔-丁基8-(t-丁基二苯基硅氧基)-2-甲基辛基-5-烯-4-叔丁氧羰基氨基(8a)。标题所述化合物的合成，在示例8中已被描述(化合物4)。
(S，E)-苄基8-(t-丁基二苯基硅氧基)-2-甲基辛基-5-烯-4-叔丁氧羰基氨基(8b)。向胺7(1.50g，3.79mmol)溶于干THF(15mL)形成的混合物中加入Et3N(1.65mL，11.75mmol)，然后加入在0℃条件下加入氯甲酸苄基酯(CbzCl，0.59mL，4.17mmol)溶于干THF(4mL)中形成一种溶液。所生成的白色悬浮液回温到室温并搅拌5h，然后用DCM和水稀释。水相用DCM(2x)萃取，合并的有机层用10％的HCl和饱和NaHCO3洗涤，干燥(用MgSO4)，过滤，真空浓缩。用闪式柱色谱(二氧化硅，8∶2，正己烷/EtOAc)纯化，制得1.45g(72％)黄色的油状标题所述化合物。1H NMR(300MHz，CDCl3)7.75-7.65(m，4H)，7.50-7.28(m，11H)，5.70-5.55(m，1H)，5.40(dd，1H，J＝15.4，6.2Hz)，5.11(s，2H)，4.58(m，1H)，4.21(m，1H)，3.71(t，2H，J＝6.6Hz)，2.30(q，2H，J＝6.6Hz)，1.67(m，1H)，1.40-1.22(m，2H)，1.07(s，9H)，0.92(m，6H)；HRMS(ESI)m/z对于C33H43NO3SiNa的计算值为552.2910，实测值552.2930。
(S，E)-N-(8(t-丁基二苯基硅氧基)-2-甲基辛基-5-烯-4-基)-p，p-二苯基磷酸酰胺(8c)。向胺7(400mg，1.01mmol)溶于DCM(7mL)形成的溶液中加入Et3N(0.44mL，3.13mmol)，然后加入0℃条件下二苯基次膦酰氯(Ph2POCl，0.22mL，1.11mmol)溶于DCM(3mL)中形成一种溶液。在0℃条件下搅拌15min，该反应混合物被回温到室温并搅拌4h，然后用DCM和10％HCl稀释。水相用DCM萃取，合并的有机层用饱和NaHCO3洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩制得720mg淡黄色固化油状标题所述化合物，该化合物无需纯化用于下一步反应。
Figure BPA00001330558901061
(S，E)-叔丁基8-羟基-2-甲基辛基-5-乙基-4-基氨基甲酸盐(9a)。标题中所述的化合物的合成，在示例8中已被描述(化合物5)。
(S，E)-苄基8-羟基-2-甲基辛基-5-烯-4-基氨基甲酸盐(9b)。向在0℃条件下TBDPS保护的醇8b(584mg，1.10mmol，粗品)溶于THF(9mL)形成的溶液中加入TBAF(1.0M/THF，1.38mL，1.38mmol)，该反应混合物在氩气保护下搅拌3.5h的同时被回温到室温，再用饱和NH4Cl溶液终止反应，并用EtOAc稀释。将水相分离并用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩。闪式柱色谱(二氧化硅，5∶5，正己烷/EtOAc)制得194mg(60％，2步)无色的油状标题所述化合物。[]D 23-6.4(c 1.0，DCM)；1H NMR(300MHz，CDCl3)7.20-7.40(m，5H)，5.65-5.49(m，1H)，5.44(dd，1H，J＝15.3，6.6Hz)，5.09(s，2H)，4.67(bs，1H)，4.16(m，1H)，3.63(bs，2H)，2.28(q，2H，J＝6.0Hz)，1.82(bs，1H)，1.65(m，1H)，1.40-1.25(m，2H)，0.80-1.00(m，6H)；HRMS(ESI)m/z对C17H25NO3Na计算值为314.1732，实测值314.1739。
(S，E)-N-(8-羟基-2-甲基辛基-5-烯-4-基)-p，p-二苯基次膦酰胺(9c)。向在0℃条件下TBDPS保护的醇8c(700mg，0.983mmol，粗品)溶于THF(8mL)形成的溶液中加入TBAF(1.0M/THF，1.23mL，1.23mmol)，该反应混合物在氩气保护下搅拌的同时被回温到室温。4h后由于反应没有结束，0℃条件下加入0.75eq的TBAF溶液(0.75mL)终止反应。反应混合物在室温条件下再被搅拌3h，然后用饱和NH4Cl溶液终止反应，并用EtOAc稀释。将水相分离并用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩。闪式柱色谱纯化(二氧化硅，5∶5，95∶5，EtOAc/MeOH)制得272mg(77％，2步)白色固体状标题所述化合物。mp 124.0-124.2℃；[]D 23-12.1(c 1.0，DCM)；1H NMR(300MHz，CDCl3)8.00-7.83(m，4H)，7.58-7.35(m，6H)，5.52(dd，1H，J＝15.3，9.0Hz)，5.24(m，1H)，4.58(bs，1H)，3.78-3.47(m，3H)，2.80(appdd，1H，J＝9.2，3.8Hz)，2.16(m，2H)，1.68(bs，1H)，1.55-1.43(m，1H)，1.43-1.31(m，1H)，0.87(dd，6H，J＝8.6，6.4Hz)；HRMS(ESI)m/z对与C21H28NO2PNa的计算值为380.1755，实测值为380.1725.
Figure BPA00001330558901071
TEMPO-4-基-(S，E)-5-(t-丁氧羰基氨基)-7-甲基辛基-3-烯己酰胺(10a，JP4-039)。标题中所述的化合物的合成，在示例8中已被描述(化合物7)。
TEMPO-4-基-(S，E)-5-(苄氧羰基氨基)-7-甲基辛基-3-烯己酰胺(10b)。向在0℃条件下醇9b(158mg，0.543mmol)溶于丙酮(5mL)形成的溶液中缓慢加入新制备好的琼斯试剂溶液(2.5M，0.54mL，1.358mmol)。所制得的黑色悬浮液在0℃条件下搅拌1h，然后用EtOAc和水稀释。将水相分离并用Et2O(2x)萃取。合并的有机层用水(2x)和盐水(1x)萃取，干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩制得166mg(定量)淡黄色油状标题所述化合物，该化合物无需进一步纯化用于下一步反应。
在0℃条件下，将该酸(160mg，0.524mmol，粗品)加入DCM(7mL)中形成一种溶液，再继续加入由4-氨基-TEMPO(139mg，0.786mmol)溶于DCM(0.5mL)、DMAP(71mg，0.576mmol)、HOBt·H2O(78mg，0.576mmol)和EDCI(123mg，0.629mmol)形成的一种溶液。所制得的橙色溶液在室温条件下在氩气保护中搅拌15h，再用饱和NH4Cl洗涤。将水相分离并用DCM萃取一次。合并的有机层干燥(Na2SO4)，过滤，真空浓缩。闪式柱色谱纯化(先SiO2 5∶5，再正己烷/EtOAc3∶7)制得171mg(71％)桃红色泡沫状标题所述化合物。mp 60.5℃(软化点：44℃)；[]D 23+26.5(c 0.5，DCM)；EIMS m/z 458([M]+，37)，281(19)，154(28)，124(47)，91(100)，84(41)；HRMS(EI)m/z对于C26H40N3O4的计算值为458.3019，实测值为458.3035.
TEMPO-4-基-(S，E)-5-(二苯基磷酰胺)-7-甲基辛基-3-烯己酰胺(10C)。向在0℃条件下由醇9c(166.5mg，0.466mmol)溶于丙酮(5mL)形成的溶液中缓慢加入新制备的琼斯试剂溶液(2.5M，0.47mL，1.165mmol)。所制得的黑色悬浮液在0℃条件下搅拌2h，然后用EtOAc和水稀释。将水相分离并用Et2O(2x)萃取。合并的有机层用水(2x)和盐水(1x)萃取，干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩制得114mg(66％)(定量)白色泡沫状粗酸，该酸无需进一步纯化用于下一步反应。
在0℃条件下，将该酸(110mg，0.296mmol，粗品)加入DCM(3.5mL)中形成一种溶液，再继续加入由4-氨基-TEMPO(78.4mg，0.444mmol)溶于DCM(0.5mL)，DMAP(40.2mg，0.326mmol)，HOBt·H2O(44.0mg，0.326mmol)和EDCI(69.5mg，0.355mmol)形成的溶液。所制得的橙色溶液在室温条件下在氩气保护中搅拌13h，再用饱和NH4Cl洗涤。将水相分离并用DCM萃取一次。将合并的有机层干燥(用Na2SO4)，过滤，真空浓缩。闪式柱色谱(SiO2，EtOAc 97∶3，EtOAc/MeOH)制得91.2mg(59％)橙色油状在真空条件下缓慢固化的标题所述化合物。mp 168.0-168.8℃(软化点：～75℃)；[]D 23-14.1(c 0.5，DCM)；EIMS m/z 525([M+H]+，10)，371(27)，218(28)，201(74)，124(100)，91(35)，84(26)；HRMS(EI)m/z对于C30H4 3N3O3P的计算值为524.3042，实测值为524.3040。
Figure BPA00001330558901091
苄基(1S)-1-(2-(2-(t-丁基二苯基硅氧基)乙基)环丙基)-3-甲基丁基氨基甲酸盐(11b)。向由ZnEt2(110mg，0.844mmol)溶于DCM(2mL)形成的溶液中加入DME(蒸馏所得，0.088mL，844mmol)。该反应混合物在室温条件下在氮气保护中搅拌10min，然后冷却到-20℃，再在4min内滴加CH2I2(0.137mL，1.687mmol)。搅拌10min，将一种链烯8b(149mg，0.281mmol)溶于DCM(1mL)形成的溶液在5min内滴加完全。搅拌的同时使反应混合物回温到室温。10h后，该反应混合物用饱和NH4Cl溶液终止反应，再用DCM和水稀释，将水相分离并用EtOAc萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，过滤，真空浓缩。用闪式柱色谱纯化(SiO2，正己烷/Et2O，9∶1)制得785mg(68％)无色油状标题所述化合物。1H NMR分析显示只有一种非对映异构体(＞95∶5dr)。[]D 23-26.8(c 1.0，DCM)；1H NMR(300MHz，CDCl3)7.73-7.66(m，4H)，7.48-7.28(m，11H)，5.13-4.96(m，2H)，4.62(appbd，1H，J＝8.4Hz)，3.72(appbt，2H，J＝6.4Hz)，3.21(m，1H)，1.80-1.63(m，1H)，1.60-1.25(m，4H)，1.08(s，9H)，0.92(appd，6H，J＝6.3Hz)，0.79(m，1H)，0.51(m，1H)，0.40(m，1H)，0.30(m，1H)；HRMS(ESI)m/z对于C34H45NO3SiNa的计算值为566.3066，实测值为566.3103.
(1S)-1-(2-(2-(t-丁基二苯基硅氧基)乙基)环丙基)-3-甲基丁-1-胺(12)。一只装有Cbz-保护胺11b(460mg，0.846mmol)溶于5∶1MeOH/EtOAc混合物mixture(12mL)形成的溶液的烧瓶，氩气吹扫并充满3次，然后加入10％的pd/C(50mg)。该烧瓶用氢气吹扫并充满3次，所产生的黑色悬浮液在室温条件下H2(1atm)中搅拌。3h后由于反应没有完全，补加10％的pd/C(30mg)，在H2中继续搅拌5h。然后该反应混合物通过一个硅藻土滤片过滤，硅藻土用MeOH和AcOEt洗涤，所得溶液在真空中浓缩制得317mg(92％)的淡黄色油状标题所述化合物粗品，该化合物无需进一步纯化用于下一步实验。
t-丁基(1S)-1-(2-(2-(t-丁基二苯基硅氧基)乙基)环丙基)-3-甲基丁基氨基甲酸盐(第11a)。在0℃条件下，向由胺12(309mg，0.755mmol)溶于DCM(12mL)形成的溶液中加入Et3N(0.21mL，0.153mmol)，然后再加入Boc2O(183mg，0.830mmol)。该反应混合物在室温及氮气保护下搅拌28h。用饱和NH4Cl溶液终止反应，水相用DCM萃取。将合并的橙色有机层干燥(Na2SO4)，过滤，真空浓缩得到471mg的无色油状标题所述化合物粗品，该化合物不用进一步纯化用于下一步反应。
t-丁基(1S)-1-(2-(2-羟乙基)环丙基)-3-甲基丁基氨基甲酸盐(13a)。向在0℃条件下由粗TBDPS保护的醇11a(464mg，0.742mmol)溶于干THF形成的溶液中加入(6mL)TBAF(1.0M/THF，0.93mL，0.927mmol)，在氮气保护下搅拌的同时，将反应混合物回温到室温。经过5h后由于TLC显示没有完全反应，因此加入0.75eq.TBAF(0.56mL)。9h后，该反应混合物用饱和NH4Cl水溶液终止反应，并用EtOAc稀释。将水相分离并用EtOAc萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)、过滤，真空浓缩，用闪式柱色谱纯化(SiO2，5∶5，正己烷/EtOAc)制得177mg(88％)无色油状标题所述化合物(高真空度条件下，固化后得到白色粉末)。mp 49.8-50.2℃；[]D 22-30.8(c 1.0，DCM)；1H NMR(300MHz，CDCl3)4.50(appbd，1H，J＝4.5Hz)，3.66(bs，2H)，2.94(m，1H)，2.36(bs，1H)，1.82(bs，1H)，1.71(m，1H)，1.45(s，9H)，1.39(t，2H，J＝7.2Hz)，1.01(bs，2H)，0.90(dd，6H，J＝10.2，6.6Hz)，0.50(m，1H)，0.43-0.27(m，2H)；HRMS(ESI)m/z对于C15H29NO3Na的计算值为294.2045，实测值为294.2064.
苄基(1S)-1-(2-(2-羟乙基)环丙基)-3-甲基丁基氨基甲酸盐(13b)。向在0℃条件下TBDPS保护的醇11b(320mg，0.588mmol)溶于干THF(5mL)形成的溶液中加入TBAF(1.0M/THF，0.74mL，0.735mmol)，该反应物混合物在氩气保护下搅拌7h的同时，回温到室温，然后用饱和NH4Cl水溶液终止反应，并用EtOAc稀释。将水相分离并用萃取EtOAc，将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)、过滤并在真空下浓缩。用闪式柱色谱纯化(SiO2，5∶5，正己烷/EtOAc)制得166mg(92％)无色油状标题所述化合物。[]D 23-21.6(c 1.0，DCM)；1H NMR(300MHz，CDCl3)7.42-7.28(m，5H)，5.10(m，2H)，4.76(appbd，1H，J＝5.7Hz)，3.63(bs，2H)，3.04(m，1H)，2.12-1.98(bs，1H)，1.83-1.62(m，2H)，1.42(t，2H，J＝7.0Hz)，1.16-0.95(m，2H)，0.90(appt，6H，J＝7.0Hz)，0.53(sept，1H，J＝4.3Hz)，0.42(dt，1H，J＝8.4，4.5Hz)，0.34(dt，1H，J＝8.4，5.0Hz)；HRMS(ESI)m/z对于C18H27NO3Na的计算值为328.1889，实测值为328.1860。
Figure BPA00001330558901121
TEMPO-4-基-2-(2-((S)-1-(t-丁氧羰基氨基)-3-甲基丁基)环丙基)乙酰胺(14a)。向在0℃条件下醇13a(130mg，0.477mmol)溶于丙酮(5mL)形成的一种溶液中缓慢地加入Jones试剂(2.5M，0.48mL，1.194mmol)溶液。将所得黑色悬浮液在0℃条件下搅拌1h，然后用Et2O和水稀释，将水相分离并用Et2O(2x)萃取。将合并的有机层用水(2x)和盐水(1x)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下浓缩得到133mg(97％)无色油状标题所述化合物粗品，该化合物不需进一步纯化用于下一步反应。
在0℃条件下，将该酸(127.6mg，0.447mmol，粗品)加入干DCM(5.5mL)形成一种溶液，继续加入一种由4-氨基-TEMPO(118.4mg，0.671mmol)溶于干DCM(0.5mL)、DMAP(60.7mg，0.492mmol)、HOBt·H2O(66.4mg，0.492mmol)及EDCI(105.0mg，0.536mmol)形成的溶液。将所制得的橙色溶液在室温及氩气保护下搅拌15h，然后用饱和NH4Cl溶液洗涤。将水相分离并用DCM萃取一次，并将合并的有机层干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下浓缩。用闪式柱色谱纯化(SiO2，5∶5～3∶7，正己烷/EtOAc)制得150.0mg(76％)桃红色泡沫状标题所述化合物。mp 139.5℃；[]D 23-15.7(c 0.5，DCM)；EIMS m/z 438([M]+，6)，252(57)，140(67)，124(80)，91(48)，84(59)，57(100)；HRMS(EI)m/z对于C24H44N3O4的计算值为438.3332，实测值为438.3352.
TEMPO-4-基-2-(2-((S)-1-(苄氧羰基氨基)-3-甲基丁基)环丙基)乙酰胺(14b)。向在0℃条件下由醇13b(110.5mg，0.362mmol)溶于丙酮形成的一种溶液中缓慢加入Jones试剂(110.5mg，0.362mmol)溶液。将所得黑色悬浮液在0℃条件下搅拌1h，然后用Et2O和水稀释。将水相分离并用Et2O(2x)萃取。将合并的有机层用水(2x)和盐水(1x)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空内浓缩得到133.5mg(98％)无色油状标题所述化合物粗品。该化合物用于下一步反应不需进一步纯化。
在0℃条件下，将该酸(110mg，0.344mmol，粗品)加入干燥DCM(4.5mL)形成一种溶液，再继续加入由4-氨基TEMPO(118.4mg，0.671mmol)溶于干DCM(0.5mL)、DMAP(46.7mg，0.379mmol)、HOBt·H2O(51.2mg，0.379mmol)及EDCI(80.8mg，0.413mmol)形成的一种溶液。将所得橙色溶液在室温和氩气保护下搅拌18h，然后用饱和NH4Cl溶液洗涤。将水相分离并用DCM萃取一次，并将合并的有机层干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下浓缩。用闪式柱色谱纯化(SiO2，5∶5～3∶7，正己烷/EtOAc)制得150.0mg(76％)桃红色泡沫状标题所述化合物。mp 51.8℃(软化点：44℃)；[]D 23-15.3(c 0.5，DCM)；EIMS m/z 472([M]+，42)，415(58)，322(43)，168(47)，140(46)，124(75)，91(100)，84(53)；HRMS(EI)m/z对于C27H42N3O4的计算值为472.3175，实测值为472.3165.
实施例20替代氮氧自由基组分的合成
替代氮氧自由基组分的合成见原理图，其中图42显示了5-氨基-1，1，3，3-四甲基异吲哚啉-2-基氧杂(5-氨基-TMIO)的合成方法，图43显示了6-氨基-1-甲基2-氮杂金刚烷N-氧基(6-氨基-1-Me-AZADO)合成方法。
图42所示的化合物5-氨基-1，1，3，3-四甲基异吲哚啉-2-基氧杂(5-氨基-TMIO)和(20)按照如下步骤制备。
Reid，D.A.等人之前曾描述过5-氨基-TMIO的合成。(水溶性异吲哚啉氮氧自由基和一种用于防辐射的pronitroxide hydroxylamine hydrochloride UV-VIS探针的合成。Chem Comm.1998，17，1907-8)，参考文献引自该处。
Figure BPA00001330558901141
2-苄基-1，1，3，3-四甲基异吲哚啉(16)。(第一步：Org.Synth.1998，9，649；第二步：Griffiths，P.G.等。自由基清除剂1，1，3，3-1，1，3，3-四甲基异吲哚啉-2-基氧杂的合成。Aust.J.Chem.1983，36，397-401)。向一个烘干的250ml三口圆底烧瓶中冲入液氮，然后加入镁(3.84g，156.5mmol)，上部用干Et2O(9mL)覆盖。在50min内边搅拌边用滴液漏斗将由MeI(9.45mL，150.2mmol)溶于干Et2O(80mL)形成的溶液一种溶液滴入。之后将所得到的反应混合物再搅拌30min，然后采用缓慢蒸出溶剂的方法进行浓缩直至内部温度达到80℃。所得残液冷却到60℃，在维持该温度的有效搅拌速度下，用滴液漏斗滴加一种由N-苄基邻苯二甲酰亚胺(6.00g，25.04mmol)溶于干甲苯(76mL)所形成的溶液。当滴加完成后，将溶剂从混合物中缓慢蒸出直至温度达到108～110℃。将该反应混合物在110℃回流4h，然后再用溶剂蒸馏的方法浓缩一次。然后冷却并用正己烷稀释(变成紫色)。将所的浆状物用硅藻土过滤并用正己烷洗涤。合并的黄色滤液在空气中静置一夜后变为暗紫红色。然后将其在真空下浓缩。将所得紫色残余物用正己烷(～1L)通过以碱性氧化铝短柱洗脱，得到2.585g(39％)无色油状标题所述化合物(凝固后得到白色固体)。mp 61.0-61.4℃.1H NMR(300MHz，CDCl3)7.48(appd，2H，J＝7.2Hz)，7.34-7.19(m，5H)，7.18-7.11(m，2H)，4.00(s，2H)，1.31(s，12H)；HRMS(EI)m/z对于C19H23N的计算值为265.1830，实测值为265.1824。
Figure BPA00001330558901151
1，1，3，3-四甲基异吲哚啉(17)。(Griffiths，P.G.等。自由基清除剂1，1，3，3-四甲基异吲哚啉-2-基氧杂的合成.Aust.J.Chem.1983，36，397-401；Chan，K.S.等。氮氧自由基与载有β氢的烷基金属卟啉的反应：用金属中心自由基激活脂肪族C-C键。J.Organomet.Chem.2008，693，399-407)。在Parr烧瓶中，将保护状态下的苄胺16(1.864g，7.02mmol)溶于AcOH(34mL)，加入10％Pd/C(169.5mg)。(将该反应物分成3批。)将该烧瓶放入以高压反应器内。将反应器通入H2置换5次，最后用氢气升压至4bar(60psi)。在室温下搅拌3h后，将反应混合物通过硅藻土过滤，并在真空下除去溶剂。将所得残余物溶解于水(5mL)中，用2.5N NaOH(pH 11.5)溶液中和，并用Et2O(3x50mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下浓缩得到1.165g(95％)淡黄色晶体状粗标题所述化合物。mp36.0-36.5℃.1H NMR(300MHz，CDCl3)7.30-7.23(m，2H)，7.18-7.11(m，2H)，1.86(bs，1H)，1.48(s，12H)。
1，1，3，3-四甲基异吲哚啉-2-基氧杂(18)。(Griffiths，P.G.等。自由基清除剂1，1，3，3-四甲基异吲哚啉-2-基氧杂的合成。Aust.J.Chem.1983，36，397-401；Chan，K.S.等。氮氧自由基与载有β氢的烷基金属卟啉的反应：用金属中心自由基激活脂肪族C-C键。J.Organomet.Chem.2008，693，399-407)。将胺17(1.46g，8.33mmol)加入一种按14∶1混合的MeOH/MeCN(16.6mL)的混合物，形成一种溶液，继续加入NaHCO3(560mg，6.67mmol)、Na2WO4·2H2O(83.3mg，0.25mmo1)和30％H2O2(3.12mL，27.50mmol)的水溶液。将所得悬浮液在室温下搅拌。18h后，向所制得的嫩黄色悬浮物中加入30％的H2O2(3.00mL，26.44mmol)水溶液。将该反应物搅拌2天，然后用水稀释并用正己烷(2x)萃取。将合并的有机层用1M H2SO4和盐水洗涤、干燥(Na2SO4)、过滤并在真空下浓缩得到1.55g(98％粗品)黄色晶体粉末状标题所述化合物。mp 122-125℃(软化点：108℃)；HRMS(EI)m/z对于C12H17NO的计算值为191.1310，实测值为191.1306。
5-硝基-1，1，3，3-四甲基异吲哚啉-2-基氧杂(19)。(Bolton，R.等。四甲基异吲哚啉-2-基氧杂自由基的EPR和NMR研究。J.Chem.Soc.Perkin Trans.2，1993，2049-52)。在冰-水浴中将浓H2SO4(13.5mL)滴加到18(1.345g，7.07mmol)中，形成一中暗红色溶液，然后将其加热到60℃恒温15min，接着冷却到0℃。滴加浓HNO3(0.90mL，19.09mmol)。反应结束后，将所得橙黄色溶液加热到100℃并恒温10min，颜色变为橙红色。冷却到室温后，将经过冰冷却的2.5N NaOH(30mL)小心地滴加到反应混合物进行中和。将水相用Et2O萃取至无色，将合并的有机层进行干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下浓缩得到1.64g(98％)橙黄色粉末状标题所述化合物，该化合物用于下一步反应不需进一步纯化。
5-氨基-1，1，3，3-四甲基异吲哚啉-2-基氧杂(5-氨基-TMIO)。(第一步：Reid，D.A.等。The synthesis of water soluble isoindoline nitroxides and a pronitroxide hydroxylamine hydrochlorideUV-VIS probe for free radicals.Chem Comm.1998，17，1907-8；Giroud，A.M.和Rassat，A.Nitroxydes LXXX：synthèsesde mono et biradicaux nitroxydes dérivés de l’isoindoline.Bull.Soc.Chim.Fr.1979，II，48-55；第二步：Keana，J.F.W.和Lee，T.D.Versatile synthesis of doxyl spin labels bypassing theusual ketone precursors.J.Am.Chem.Soc.1975，97，1273-4)。将含有一种由19(1.50g，6.38mmol，粗品)溶于MeOH(75mL)所形成的溶液的烧瓶用氩气置换，然后加入10％Pd/C(150mg)。接着将烧瓶用H2置换3次。在H2(1atm)气氛中将所得黑色悬浮液在室温下搅拌4h。然后将反应混合物用硅藻土过滤，再将硅藻土用MeOH洗涤，得到的溶液在真空下浓缩得到1.38g黄色固体状标题所述化合物，该化合物用于下一步反应不需进一步纯化。1H NMR(300MHz，CD3OD)6.89(d，1H，J＝8.1Hz)，6.25(dd，1H，J＝8.1，2.1Hz)，6.54(d，1H，J＝2.1Hz)，3.35(s，2H)，1.34(appd，12H，J＝5.7Hz)。
向由该羟胺粗品(1.38g，6.38mmol)溶于MeOH(75mL)所形成的溶液中加入Cu(OAc)2.H2O(26mg，0.128mmol)。在空气中将该反应混合物在室温搅拌1.5h，颜色变为深褐色。然后在真空下除去溶剂，用CHCl3回收残余物，用少量MeOH溶解不溶物，并用水洗涤。水相用CHCl3萃取两次，将合并的有机层用盐水洗涤、干燥(Na2SO4)、过滤并在真空下浓缩。用闪式柱色谱纯化(SiO2，6∶4～5∶5，正己烷/EtOAc)制得1.126g(86％)黄色粉末状标题所述化合物。mp 192-194℃(软化点：189℃)；HRMS(EI)m/z对于C12H17N2O的计算值为205.1341，实测值为205.1336。
Figure BPA00001330558901181
TMIO-5-基-(S，E)-5-(t-丁氧羰基氨基)-7-甲基辛基-3-烯己酰胺(20)。向在0℃条件下由醇9a(187mg，0.728mmol，根据前述实施例制备)溶于丙酮(7mL)所形成的溶液中缓慢加入Jones试剂溶液(2.5M，0.73mL，1.821mmol)。将所得黑色悬浮物在0℃条件下搅拌1h，然后用Et2O和水稀释。将水相分离并用Et2O(2x)萃取。合并的有机层用水(2x)和盐水(1x)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下浓缩得190mg(96％)浅黄色油状标题所述化合物，该化合物用于下一步反应不需进一步纯化。
在0℃条件下，将该酸(187.4mg，0.691mmol，粗品)加入干DCM(8mL)形成一种溶液，再继续加入5-氨基-TMIO(212.6mg，1.036mmol)，DMAP(93.7mg，0.760mmol)，HOBt·H2O(102.6mg，0.760mmol)和EDCI(162.1mg，0.829mmol)。将所得黄色溶液在室温及氩气保护下搅拌16h，然后用饱和NH4Cl溶液洗涤。将水相分离并用DCM萃取一次，将合并的有机层用1N HCl溶液洗涤两次和再用饱和NaHCO3溶液洗涤一次，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下浓缩。用闪式柱色谱纯化(SiO2，6∶4，正己烷/EtOAc)制得221.0mg(70％)橙灰色泡沫状标题所述化合物。mp 78-79℃(软化点：70℃)；[]D 22+72.2(c 0.5，DCM)；ESIMS m/z 481([M+Na]+，50)，939([2M+Na]+，100)。
图43所示化合物6-氨基-1-甲基2-氮杂金刚烷N-氧基(6-氨基-1-Me-AZADO)和(30)按照如下步骤制备。
Figure BPA00001330558901191
2-金刚烷甲腈(三环[3.3.1.13，7]癸烷-2-腈，22)。(Oldenziel，O.H.等。2-金刚烷甲腈.Org.Synth.1977，57，8；Rohde，J.J.等。强效和选择性2-氨基-N-(金刚烷-2-基)乙酰胺11-羟化类固醇脱氢酶1抑制剂的研究和代谢稳定性。J.Med.Chem.2007，50，149-64)。将2-金刚烷酮(三环[3.3.1.13，7]癸-2-酮，21)(21.0g，137mmol)、p-甲苯磺酰甲基异腈(TosMIC，35.5g，178mmol)和EtOH(14mL，233mmol)溶于1，2-乙二醇二甲醚(DME，470mL)形成的溶液将在3-5℃通过分次加入固体t-BuOK(39.2g，342mmol)进行处理，同时维持内部温度在10℃以下。添加完毕后，将所得浆状反应混合物在室温搅拌30min后在35～40℃再搅拌30min。将该非均相反应混合物过滤，所得固体用DME洗涤。滤液在真空下浓缩，然后转移到一短Al2O3柱中(活化，中性，Brockmann I，150mesh，7cm厚x15cm高)，用5∶1的正己烷/DCM(～1.5L)混合液洗出。将所得溶液在真空下浓缩制得19.0g(86％)白色粉末状标题所述化合物。1H NMR(300MHz，CDCl3)2.91(s，1H)，2.23-2.08(m，4H)，2.00-1.80(m，4H)，1.80-1.66(m，6H)。
2-金刚烷羧酸(23)。(Rohde，J.J.等。强效和选择性2-氨基-N-(金刚烷-2-基)乙酰胺11-羟化类固醇脱氢酶1抑制剂的研究和代谢稳定性。J.Med.Chem.2007，50，149-64)。将腈22(18.9g，117mmol)溶于AcOH溶液(56mL)和48％HBr(224mL)所形成的混合物在120℃下搅拌一夜。在反应混合物冷却到4℃，静置4h，然后过滤。固体用水洗涤并在真空下用硅胶干燥一夜获得20.6g(98％)白色晶体状标题所述化合物。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)12.09(s，1H)，2.55-2.47(m，1H)，2.20(bs，2H)，1.87-1.64(m，10H)，1.60-1.50(m，2H)。
Figure BPA00001330558901201
5，7-二溴-2-金刚烷羧酸(24)。(根据Rohde，J.J.等人方法改进。强效和选择性2-氨基-N-(金刚烷-2-基)乙酰胺11-羟化类固醇脱氢酶1抑制剂的研究和代谢稳定性。J.Med.Chem.2007，50，149-64)。将AlBr3(18.9g，69.6mmol)，BBr3(2.40g，9.49mmol)和Br2(40mL)形成的混合溶液在0℃条件下强力搅拌，并分次加入酸23(5.70g，31.6mmol)进行处理。在酸加入结束时，将反应混合物在70℃搅拌48h，然后在冰浴中冷却，并小心的用亚硫酸氢钠饱和溶液终止反应。在室温下持续搅拌一夜后。将所得灰褐色悬浮液过滤，所得固体用水洗涤，并在60℃条件下，真空干燥一夜，获得10.95g(定量)米色粉末状标题所述化合物。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)12.56(bs，0.3H)，2.85(appd，2H，J＝12.9Hz)，2.75-2.55(m，2H)，2.50-2.35(m，2H)，2.35-2.10(m，7H)。
Figure BPA00001330558901202
(5，7-二溴-金刚烷-2-基)-氨基甲酸t-丁酯(25)。将酸24(2.00g，5.92mmol)加入干丙酮(30mL)形成一种悬浮液，再继续依次用Et3N(1.0mL，7.10mmol)和叠氮磷酸二苯酯(DPPA，1.6mL，7.10mmol)处理。将所得混合物在85℃搅拌15h。在0℃条件下，通过滴液漏斗向盛有由t-BuOK(1.35g，11.8mmol)溶于干THF(80mL)形成的一种溶液的分离瓶中分次滴加异氰酸酯溶液。所得反应混合物在30min内回温到室温，然后用水终止反应。在真空下除去THF，将所得物质用EtOAc稀释。将有机层分别用1N HCl，NaHCO3饱和溶液和盐水洗涤，然后干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下浓缩。用闪式柱色谱纯化(SiO2，95∶5～8∶2，正己烷/EtOAc)得到1.20g(50％，2步)白色粉末状标题所述化合物。1H NMR(300MHz，CDCl3)4.68(bs，1H)，3.76(bs，1H)，2.87(s，2H)，2.47-2.13(m，10H)，1.46(s，9H)。
(7-亚甲基-二环[3.3.1]壬-3-酮-9-基)-氨基甲酸t-丁酯(26)。(第一步：Rohde，J.J.等。强效和选择性2-氨基-N-(金刚烷-2-基)乙酰胺11-羟化类固醇脱氢酶1抑制剂的研究和代谢稳定性。J.Med.Chem.2007，50，149-64)。将一种由25(125mg，0.305mmol)溶于氧杂环乙烷形成的溶液，用2N NaOH(0.70mL，1.37mmol)处理，并在180℃用微波(μw，Biotage)照射15min。在真空条件下除去氧杂环乙烷。将残余物溶于DCM，用水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下浓缩得到82.5mg黄色油状9-氨基-7-亚甲基-二环[3.3.1]壬-3-酮粗品，用于下一步反应不需进一步纯化。
在0℃条件下，向由这种粗胺溶于干DCM(5mL)形成的一种溶液加入Et3N(0.13mL，0.913mmol)，然后加入Boc2O(73.8mg，0.335mmol)。反应混合物在室温及N2保护下搅拌14h。用饱和NH4Cl水溶液终止反应，并将水相用DCM萃取两次。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下浓缩。用闪式柱色谱纯化(SiO2，7∶3，正己烷/EtOAc)制得48.0mg(59％，2步)白色粉末状标题所述化合物。1H NMR(300MHz，CDCl3)4.93(bs，0.25H)，4.84(s，2H)，4.81(bs，0.75H)，4.12(bs，0.25H)，3.91(appbd，0.75H，J＝3.6Hz)，2.64-2.37(m，6H)，2.37-2.23(m，3.25H)，2.17(appbd，0.75H，J＝13.8Hz)，1.48and 1.46(2s，9H)。
Figure BPA00001330558901221
(7-亚甲基-二环[3.3.1]壬-3-酮肟-9-基)-氨基甲酸t-丁酯(27)。向由酮26(137mg，0.515mmol)溶于干吡啶(1mL)形成的一种溶液中加入NH2OH·HCl(109mg，1.54mmol)。将反应混合物在室温及氩气保护下搅拌23h。将溶剂在真空下除去，用EtOAc稀释残余物，然后加入水。将各层分离并将水相用EtOAc萃取。合并的有机层用5％CuSO4水溶液(3x)和盐水(1x)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下干燥。用闪式柱色谱纯化(SiO2，4∶6，正己烷/EtOAc)制得133mg(92％)无色胶状标题所述化合物。1H NMR(300MHz，CDCl3)7.02(bs，0.6H)，4.90(bs，0.25H)，4.80(d，1H，J＝2.1Hz)，4.76(bs，0.75H)，4.69(d，1H，J＝2.1Hz)，3.87(bs，1H)，3.26(d，0.25H，J＝16.8Hz)，3.11(d，0.75H，J＝16.8Hz)，2.55-2.48(m，4H)，2.48-2.20(m，4H)，2.16(appd，0.25H，J＝17.1Hz)，2.04(dd，0.75H，J＝17.1，5.4Hz)，1.47(s，9H)。
Figure BPA00001330558901231
(1-碘甲基-2-氮杂金刚烷-6-基)-氨基甲酸t-丁酯(28)。在0℃和氩气保护下，向由肟27和MoO3(94mg，0.649mmol)溶于干MeOH(4.6mL)形成的混合物中分次加入NaBH4(179mg，4.64mmol)。反应混合物在0℃搅拌，分别在2.5h和5.5h分次加入2倍量的NaBH4(179mg，4.64mmol)。经过7h后加入丙酮使暗褐色的反应混合物终止反应，然后用硅藻土过滤，用丙酮洗涤硅藻土。将滤液在真空下浓缩。所得残余物用水稀释并用EtOAc萃取两次。合并的有机层用盐水洗涤，干燥(K2CO3)，过滤并在真空下浓缩制得136mg黄色油状粗胺，其用于下一步反应不需进一步纯化。
在0℃及氩气保护下，向由该粗胺溶于干乙腈(MeCN，2.3mL)形成的悬浮液中加入I2(117mg，0.462mmol)。反应混合物搅拌4h的同时回温到室温，然后用饱和NaHCO3水溶液和饱和Na2S2O3水溶液终止反应。将所得混合物用DCM/CHCl3萃取两次，将有机层干燥(K2CO3)，过滤并在真空下浓缩。用闪式柱色谱纯化(SiO2，95∶5 to 9∶1，DCM/MeOH)制得76.5mg(42％)褐色油状标题所述化合物。1H NMR(300MHz，CDCl3)4.83(bs，1H)，3.77(bs，1H)，3.30(bs，1H)，3.24(apps，2H)，2.14(appbs，2H)，1.94(appbd，2H，J＝13.5Hz)，1.75(m，6H)，1.46(s，9H)。
Figure BPA00001330558901232
(1-甲基-2-氮杂金刚烷-N-氧基-6-基)-氨基甲酸t-丁酯(29)。胺28脱典化可以通过用一种还原剂(如LiAlH4或NaBH4)，可能在催化剂(如InCl3)存在下及在极性非质子溶剂如THF或MeCN中处理28实现。
在MeOH和H2O的混合溶剂中，在催化剂量的Na2WO4·2H2O存在条件下，用H2O2处理所得到的胺，可将所述的胺氧化得到相应的氮氧自由基29。
Figure BPA00001330558901241
6-氨基-1-甲基-2-氮杂金刚烷-N-氧基(6-氨基-1-Me-AZADO)。在DCM中用三氟乙酸(TFA)处理保护状态下的胺29可将Boc保护的基团去除，从而得到游离态的胺6-氨基-1-Me-AZADO。
Figure BPA00001330558901242
(1-Me-AZADO-6-基)-(S，E)-5-(t-丁氧羰基氨基)-7-甲基辛基-3-烯己酰胺(30)。通过Jones氧化(S，E)-t-丁基8-羟基-2-甲基辛基-5-烯-4-基氨基甲酸酯(9a)可得到上述相应的酸。化合物(9a)根据前述实施例制备。
在CH2Cl2(DCM)中，按照上文描述的条件，通过偶联剂EDCI、DMAP、和HOBt-hydrate，使所述的酸与6-氨基-1-Me-AZADO耦合得到酰胺化合物(30)。
鉴于说明之目的，本发明特有的实施方案在上文中已经描述，本发明许多细节的变化，如所附本发明权利要求所定义的，对本领域的技术人员来说无需脱离本发明即可认识到，这是显而易见的。
在本发明指定的不同范围的数值的使用，除非另有明确说明，都表述为近似值，犹如在指定的最小值和最大值二者都冠以单词“大约”来陈述。在这种方式下，陈述范围内的数值在其之上或之下有略微变化也能大体上获得相同的结果。同时，除非另有明确说明，这些公开的范围是作为一个连续范围，包括每一个最小值和最大值之间的数值。

Claims (39)

1.一种化合物具有解结构：：
(结构式1)
其中X是
Figure FPA00001330558800012
和
Figure FPA00001330558800013
之一；
R1和R2是氢、C1～C6直链或支链烷基，或C1～C6的直链或支链烷基进一步含有没有被取代或被甲基、羟基或氟取代的苯基(C6H5)；R4是氢、C1～C6的直链或支链烷基，或C1～C6的直链或支链烷基进一步包含没有被取代或被甲基、羟基或氟取代的苯基(C6H5)；R3是-NH-R5、-O-R5或-CH2-R5，R5是含有-N-O·，-N-OH或N＝O的基团；R是-C(O)-R6、-C(O)O-R6或-P(O)-(R6)2，其中R6是C1～C6的直链或支链烷基，或是C1-C6直链或支链烷基进一步包含各自独立地未被取代或被甲基、乙基、羟基或氟取代的苯基(-C6H5)；其中该化合物不是XJB-5-208。
2.权利要求1所述的化合物，其特征在于具有结构
Figure FPA00001330558800014
或结构
Figure FPA00001330558800021
3.权利要求2所述的化合物，其特征在于具有结构
Figure FPA00001330558800022
4.根据权利要求3所述的化合物，其特征在于具有结构
Figure FPA00001330558800023
5.根据权利要求4所述的化合物，其特征在于具有结构
6.根据权利要求1所述的化合物，其中R是Ac(乙酰基，R＝-C(O-CH3)，Boc(R＝-C(O)O-t-丁基)，Cbz(R＝-C(O)O-苄基(Bn))基团。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中R1，R2，R4和R6是独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、2-丙基、丁基、t-丁基、戊(烷)基、己基、苄基、羟苄基、苯基和羟苯基。
8.根据权利要求1所述的化合物，其中当X是-CH＝CR4-时，R4是氢、甲基或乙基。
9.根据权利要求1所述的化合物，其中R5是2，2，6，6-四甲基-4-哌啶1-氧基、1-甲基2-氮杂金刚烷N-氧基或1，1，3，3-四甲基异吲哚啉-2-基氧杂.
10.根据权利要求1所述的化合物，其具有结构：
Figure FPA00001330558800031
或结构
Figure FPA00001330558800032
其中R是-NH-R1、-O-R1或-CH2-R1，且R1是含-N-O·、-N-OH或N＝O的基团。
11.根据权利要求1所述的化合物，其具有结构：
Figure FPA00001330558800033
(结构式2)
其中R1、R2或R3是，独立地，氢、C1-C6直链或支链烷基、或包含不饱和的苯基(C6H5)、甲基、羟基或氟取代的C1～C6的直链或支链烷基；R4是包含-N-O·、-N-OH或N＝O的基团；R是-C(O)-R5、-C(O)O-R5、或-P(O)-(R5)2，其中R5是C1～C6直链或支链烷基、或包含不饱和的苯基(C6H5)、甲基、羟基或氟取代的C1～C6的直链或支链烷基。
12.根据权利要求11所述的化合物，其中R是Ac(乙酰基，R＝-C(O-CH3)，Boc(R＝-C(O)O-t-丁基)，Cbz(R＝-C(O)O-苄基(Bn))基团。
13.根据权利要求11所述的化合物，其特征在于R1，R2和R3各自是甲基、乙基、丙基、二丙基、丁基、t-丁基、戊(烷)基，己基，苄基，羟苄基，苯基和羟苯基。
14.根据权利要求11所述的化合物，其中R4是2，2，6，6-四甲基-4-哌啶1-氧基、1-甲基2-氮杂金刚烷N-氧基或1，1，3，3-四甲基异吲哚啉-2-基氧杂。
15.根据权利要求11所述的化合物，其具有一种结构选自
Figure FPA00001330558800041
Figure FPA00001330558800051
其中Ac是乙酰基。
16.根据权利要求1所述的化合物，其具有结构：
Figure FPA00001330558800052
(结构式3)
其中R1、R2和R3各自是氢、C1～C6直链或支链烷基、或包含不饱和的苯基(C6H5)、甲基、羟基或氟取代的C1～C6的直链或支链烷基；R4是包含-N-O·、-N-OH或N＝O的基团；R是-C(O)-R5、-C(O)O-R5或-P(O)-(R5)2，其中R5是C1～C6直链或支链烷基、或包含不饱和的苯基(C6H5)、甲基、羟基或氟取代的C1～C6的直链或支链烷基。
17.根据权利要求16所述的化合物，其中R是Ac(乙酰基，R＝-C(O-CH3)，Boc(R＝-C(O)O-t-丁基)，Cbz(R＝-C(O)O-苄基(Bn))基团。
18.根据权利要求16所述的化合物，其特征在于R1、R2和R3各自是甲基，乙基，丙基，2-丙基，丁基，t-丁基，戊(烷)基，己基，苄基，羟苄基，苯基和羟苯基。
19.权利要求16所述的化合物，其中R4是2，2，6，6-四甲基-4-哌啶1-氧基、1-甲基2-氮杂金刚烷N-氧基)或1，1，3，3-四甲基异吲哚啉-2-基氧杂。
20.根据权利要求16所述的化合物，其具有一种结构选自：
Figure FPA00001330558800061
其中Ac是乙酰基。
21.根据权利要求1所述的化合物，其具有结构
Figure FPA00001330558800062
22.根据权利要求1所述的化合物，其具有结构
23.根据权利要求1所述的化合物，其具有结构
Figure FPA00001330558800072
24.一种化合物具有结构
Figure FPA00001330558800073
(结构式4)，
其中X是
Figure FPA00001330558800074
和
Figure FPA00001330558800075
之一；且
R1是氢、C1～C6直链或支链烷基、或C1～C6直链或支链烷基进一步包含一个未被取代或被甲基、羟基或氟取代的苯基(C6H5)；R4是氢、C1-C6直链或支链烷基、或C1～C6直链或支链烷基进一步包含一个未被取代或被甲基、羟基或氟取代的苯基(C6H5)；R3是-NH-R5、-O-R5或-CH2-R5，且R5是包含-N-O·、-N-OH或N＝O的基团；且R是-C(O)-R6、-C(O)O-R6、或-P(O)-(R6)2，其中R6是C1～C6直链或支链烷基、或C1-C6直链或支链烷基进一步包含一个或多个各自未被取代或被甲基、羟基或氟取代的苯基(C6H5)。
25.根据权利要求24所述的化合物，其特征在于具有结构
Figure FPA00001330558800081
或结构
26.根据权利要求25所述的化合物，其具有结构
Figure FPA00001330558800083
其中R4是氢或甲基。
27.一种制备靶向抗氧化剂化合物的方法，包括：
a.具有结构R1-C(O)-的醛与(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺反应生成亚胺，其中R1是C1～C6的直链或支链烷基，选择包括苯基(C6H5)，任意可选择是甲基、羟基或氟取代的苯基；
b.端炔-1-醇(HCC-R2-CH2-OH)与(t-丁基)二苯基硅烷盐反应生成炔烃，其中R2不出现或者是支链或直链的亚烯基；
c.在有机锆催化剂存在下，亚胺与炔反应生成烯烃；
d.烯烃酰化生成氨基甲酸酯；
e.从氨基甲酸酯中除去t-丁基二苯硅烷基团生成醇；
f.醇氧化生成羧酸；以及
g.羧酸与包含羟基或胺基之一的含氮氧自由基的化合物发生缩合反应生成抗氧化剂化合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于在步骤d烯烃酰化生成氨基甲酸酯之前进一步包含烯烃环丙烷化。
29.一种具有R1-R2-R3结构的化合物，其中R1和R3相同或不同，并具有-R4-R5的结构，其中R4是线粒体靶向基团，R5是-NH-R6，-O-R6或-CH2-R6，其中R6是含有-N-O·、-N-OH或N＝O的基团，对R1和R3中的每一个R4和R5可以相同或不同；R2是连接体。
30.根据权利要求29所述的化合物，其特征在于R1和R2相同。
31.根据权利要求29所述的化合物，其特征在于R1和R2的其中之一或二者中的R6是2，2，6，6-四甲基-4-哌啶1-氧基。
32.根据权利要求29所述的化合物，其特征在于R1和R3具有结构：
Figure FPA00001330558800091
(结构式1)
其中X是
Figure FPA00001330558800092
和
Figure FPA00001330558800093
之一；
R1和R2是氢、C1～C6直链或支链烷基，或C1～C6直链或支链烷基进一步包含被甲基、羟基或氟取代的苯基；R4是氢、C1～C6直链或支链烷基，或C1～C6直链或支链烷基进一步包含被甲基、羟基或氟取代的苯基；R3是-NH-R5、-O-R5或-CH2-R5，R5是含有-N-O·，-N-OH or N＝O的基团；R是-C(O)-R6、-C(O)O-R6、或-P(O)-(R6)2，其中R6是C1～C6直链或支链烷基或C1～C6直链或支链烷基进一步包含各自独立地未被饱和或被甲基、羟基或氟取代的苯基。
33.根据权利要求29所述的化合物，该化合物是JED-E71-58和JED-E71-37之一。
34.权利要求29所述的化合物，其特征在于对每一个独立的R1和R3的R4包含含有β-转角和TEMPO的半短杆菌肽衍生物。
35.根据权利要求34所述的化合物，其中R1和R3，各自独立地选自XJB-5-131和XJB-5-125。
36.根据权利要求29所述的化合物，其特征在于R2包含线性或支化饱和C4～C20的烷基。
37.根据权利要求36所述的化合物，其特征在于R2具有结构：
其中n＝4-18.
38.根据权利要求37所述的化合物，其特征在于n＝10。
39.在清除主体中自由基的一种方法，包括在主体受到辐照之前、遭受辐射过程中或遭受辐射之后，向主体提供一定量的权利要求1、24或29所述的能有效清除主体中自由基的化合物。
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