ES2527958T3 - Agentes de nitróxido dirigidos - Google Patents

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Abstract

Compuesto que tiene la estructura:**Fórmula** en la que X es uno de **Fórmula** y**Fórmula** R1 es hidrógeno, alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, o un alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada que comprende además un grupo fenilo (C6H5), que está no sustituido o está sustituido con metilo, hidroxilo o fluoro; R2 es hidrógeno, alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, R4 es hidrógeno, alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, o un alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada que comprende además un grupo fenilo (C6H5), que está no sustituido o está sustituido con metilo, hidroxilo o fluoro; R3 es -NH-R5, -O-R5 o -CH2-R5, y R5 es un grupo que contiene -N-O, -N-OH o N>=O; R es -C(O)-R6, -C(O)O-R6, o -P(O)-(R6)2, en los que R6 es alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada o alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada que comprende además uno o más grupos fenilo (-C6H5) que están independientemente no sustituidos, o sustituidos con metilo, etilo, hidroxilo o fluoro.

Description

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pueden reducirse sus concentraciones tisulares requeridas 1.000 veces desde 10 mM hasta 10 µM) en comparación con nitróxidos no conjugados parentales. El enriquecimiento en mitocondrias de los nitróxidos dirigidos a mitocondrias se ha demostrado mediante espectroscopia de RPE así como mediante análisis de EM de su contenido en mitocondrias obtenido de células incubadas con nitróxidos dirigidos a mitocondrias. El suministro de nitróxidos 5 dirigidos a mitocondrias en mitocondrias no depende del potencial de la membrana mitocondrial. Por tanto, los nitróxidos dirigidos a mitocondrias pueden acumularse no sólo en las mitocondrias intactas, sino también en las mitocondrias desactivadas o dañadas con bajo potencial de membrana. Además, los conjugados de nitróxido dirigido a mitocondrias se suministran a las mitocondrias sin afectar al potencial de membrana mitocondrial. Por tanto, no afectan a la principal función mitocondrial, la producción de energía, en las células. Además, los nitróxidos
10 conjugados proporcionan una nueva característica importante, la protección tras la irradiación.
Al igual que otros nitróxidos, los nitróxidos conjugados dirigidos a mitocondrias podrían reducir potencialmente la tensión arterial y la actividad de los nervios simpáticos. Sin embargo, la dosis considerablemente reducida de los nitróxidos dirigidos a mitocondrias (aproximadamente 1.000 veces), en comparación con los nitróxidos parentales no
15 conjugados, puede ser significativamente más baja que las que inducen efectos secundarios.
El contenido de la presente invención es un compuesto que tiene la estructura:
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25 y
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R1 es hidrógeno, alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, o un alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada que
30 comprende además un grupo fenilo (C6H5), que está no sustituido o está sustituido con metilo, hidroxilo o fluoro; R2 es hidrógeno, alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, R4 es hidrógeno, alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, o un alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada que comprende además un grupo fenilo (C6H5), que está no sustituido o está sustituido con metilo, hidroxilo o fluoro; R3 es -NH-R5, -O-R5 o -CH2-R5, y R5 es un grupo que contiene -N-Oí, -N-OH o N=O; R es -C(O)-R6, -C(O)O-R6, o -P(O)-(R6)2, en los que R6 es alquilo C1-C6 de cadena
35 lineal o ramificada o alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada que comprende además uno o más grupos fenilo (-C6H5) que están independientemente no sustituidos, o sustituidos con metilo, etilo, hidroxilo o fluoro o un compuesto que tiene la estructura
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5
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R1 es hidrógeno, alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, R4 es hidrógeno, alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, o un alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada que comprende además un grupo fenilo (C6H5), que está
10 no sustituido o está sustituido con metilo, hidroxilo o fluoro; R3 es -NH-R5, -O-R5 o -CH2-R5, y R5 es un grupo que contiene -N-Oí, -N-OH o N=O; y R es -C(O)-R6, -C(O)O-R6, o -P(O)-(R6)2, en los que R6 es alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada o alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada que comprende además uno o más grupos fenilo (-C6H5) que están independientemente no sustituidos, o sustituidos con metilo, etilo, hidroxilo o fluoro.
15 Breve descripción de los dibujos
La figura 1 proporciona ejemplos no limitativos de determinados nitróxidos. Los valores de logP se estimaron usando la calculadora en línea de propiedades moleculares y similitud de fármacos en el sitio web de Molinspiration (www.molinspiration.com/cgi-bin/properties). TIPNO = nitróxido de terc-butil-isopropil-fenilo.
20 La figura 2 proporciona ejemplos de estructuras de determinados compuestos antioxidantes de direccionamiento a mitocondrias a los que se hace referencia en el presente documento, y la estructura de TEMPOL.
La figura 3 representa un ejemplo de una ruta sintética para los conjugados de TEMPO-hemigramicidina.
25 La figura 4 muestra un análisis basado en EPR de integración y reducción de conjugados de nitróxido-gramicidina Speptidil-TEMPO en MEC.
La figura 5 muestra una lectura con isocianato de fluoresceína-dextrano (FD4) que refleja el efecto de los
30 conjugados de gramicidina-S-TEMPO en la permeabilidad de la mucosa ilieal de rata tras choque hemorrágico profundo. Los datos se expresan como un porcentaje del cambio de permeabilidad en relación con el observado en segmentos de control sometidos a ensayo simultáneamente cargados durante el choque con solución salina normal. La figura 5A muestra una lectura con FD4 de TEMPOL que se usa como “control positivo” para el ensayo de protección de la mucosa intestinal. La figura 5B muestra una lectura con FD4 de XJB-5-208 conjugado con TEMPO
35 que refleja la protección de la mucosa intestinal. La figura 5C muestra una lectura con FD4 de XJB-5-125 que tiene la carga de TEMPO, pero no proporciona protección frente a la disfunción de la barrera intestinal inducida por hemorragia. La figura 5D muestra una lectura con FD4 de XJB-5-127 que carece de la carga de TEMPO y no proporciona protección frente a la disfunción de la barrera intestinal inducida por hemorragia. La figura 5E muestra una lectura con FD4 de XJB-5-131 conjugado con TEMPO que refleja la protección de la mucosa intestinal. La figura
40 5F muestra una lectura con FD4 de XJB-5-133 que carece de la carga de TEMPO aunque posee el mismo resto de direccionamiento a mitocondrias de hemigramicidina que el compuesto más activo, XJB-5-131. La figura 5G muestra una lectura con FD4 de XJB-5-197 que tiene la carga de TEMPO, pero no proporciona protección frente la disfunción de la barrera intestinal inducida por hemorragia. La figura 5H muestra una lectura con FD4 de XJB-5-194 que carece de la carga de TEMPO y no proporciona protección frente la disfunción de la barrera intestinal inducida por
45 hemorragia.
La figura 6 muestra representaciones gráficas del efecto de conjugados de nitróxido sobre la apoptosis inducida por ActD. La figura 6A es una representación gráfica de la producción de superóxido basada en la intensidad de fluorescencia media de 10.000 células ileales. La figura 6B es una representación gráfica de la externalización de 50 fosfatidilserina (PS) tal como se indica mediante el porcentaje de células positivas para anexina V. La figura 6C es una representación gráfica de la actividad de caspasa-3 tal como se indica mediante la cantidad de su sustrato específico presente, Z-DVED-AMC, en nmol/mg de proteína. La figura 6D es una representación gráfica de la fragmentación de ADN tal como se indica mediante fluorescencia con yoduro de propidio. La figura 6E es una representación gráfica de la externalización de PS a diferentes concentraciones del compuesto 5a (tal como se 55 muestra en la figura 3). La figura 6F es una representación gráfica de los niveles de adenosín trifosfato (ATP) en
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antioxidante del ácido ascórbico en al menos un ensayo que mide la actividad antioxidante.
En el presente documento se proporcionan compuestos y composiciones que comprenden un grupo de direccionamiento y una carga, tal como un grupo que contiene nitróxido. La carga puede ser cualquier compuesto 5 útil, tal como un antioxidante, tal como se conoce bien en las técnicas médicas y químicas. La carga puede comprender un factor que tiene actividad antimicrobiana. Por ejemplo, los grupos de direccionamiento pueden reticularse con enzimas antibacterianas, tales como lisozima, o antibióticos, tales como penicilina. Otros métodos para unir los grupos de direccionamiento a una carga se conocen bien en la técnica. En una realización, la carga es un antioxidante, tal como un grupo que contiene nitróxido. En otra realización, la carga transportada por agentes de 10 direccionamiento selectivos de mitocondrias puede incluir un inhibidor de actividad NOS. La carga puede tener una propiedad seleccionada del grupo que consiste en antioxidante, radioprotectora, protectora, antiapoptótica, terapéutica, paliativa, antagonista de NOS y combinaciones de las mismas. En otra realización, la carga puede tener la capacidad para inhibir la actividad de la enzima óxido nítrico sintasa. Se apreciará que pueden emplearse una amplia variedad de cargas en la composición descrita en el presente documento. Los ejemplos no limitativos de
15 cargas incluyen: una 2-amino-6-metil-tiazina, un análogo de ubiquinona, un resto de fragmento de análogo de ubiquinona, un resto de fragmento de análogo de ubiquinona que carece de una cola hidrófila, un mimético de superóxido dismutasa, un biomimético de superóxido dismutasa y un compuesto de salen-manganeso.
Aunque la generación de ROS en pequeñas cantidades es un subproducto típico de la ruta de respiración celular,
20 pueden producirse determinados estados, incluyendo una enfermedad u otro estado médico, en el paciente cuando la cantidad de ROS es excesiva hasta el punto de que los mecanismos enzimáticos naturales no pueden eliminar la cantidad de ROS que está produciéndose. Por tanto, en el presente documento son útiles y se proporcionan compuestos, composiciones y métodos que eliminan especies reactivas de oxígeno que están presentes dentro de la membrana mitocondrial de la célula. Estos compuestos, composiciones y métodos tienen la utilidad de poder
25 eliminar una cantidad en exceso de ROS que está produciéndose a la que no pueden hacer frente, entre otras, las enzimas SOD y catalasa que se producen de manera natural.
En una realización no limitativa, el compuesto tiene la estructura:
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y
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40 y
R1, y R4 son, independientemente, hidrógeno, alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, incluyendo opcionalmente un grupo fenilo (C6H5), que opcionalmente está sustituido con metilo, hidroxilo o fluoro, incluyendo: metilo, etilo, propilo, 2-propilo, butilo, t-butilo, pentilo, hexilo, bencilo, hidroxibencilo (por ejemplo, 4-hidroxibencilo), fenilo e
45 hidroxifenilo, R2 es hidrógeno, alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, R3 es -NH-R5, -O-R5 o -CH2-R5, en los que R5 es un grupo que contiene -N-Oí, -N-OH o N=O. En una realización, R3 es
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(1-Me-AZADO o 1-metil-2-azaadamantano-N-oxilo). En otra realización R3 es
5
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(TMIO; 1,1,3,3-tetrametilisoindolin-2-iloxilo).
R es -C(O)-R6, -C(O)O-R6, o -P(O)-(R6)2, en los que R6 es alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada que
10 comprende opcionalmente uno o más grupos fenilo (-C6H5), y que están sustituidos opcionalmente con metilo, etilo, hidroxilo o fluoro, incluyendo grupos Ac (Acetilo, R =-C(O)-CH3), Boc (R=-C(O)O-terc-butilo), Cbz (R=-C(O)O-bencilo (Bn)). R también puede ser un grupo difenilfosfato, que es,
R=
15
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Queda excluido de esto el enantiómero XJB-5-208. En determinadas realizaciones, R1 es t-butilo y R2 y R4 son H; por ejemplo:
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25 Tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique otra cosa, por ejemplo en una estructura, todos los compuestos y/o estructuras descritos en el presente documento comprenden todos los estereoisómeros posibles, individualmente o mezclas de los mismos.
Tal como se indicó anteriormente, R5 es un grupo que contiene -N-Oí, -N-OH o -N=O (no -N-Oí, -N-OH o -N=O
30 solos, sino grupos que contienen estos restos, tal como TEMPO, etc., tal como se describe en el presente documento). Tal como conoce el experto habitual en la técnica, el nitróxido y los derivados de nitróxido, incluyendo TEMPOL y derivados de TEMPO asociados son radicales estables que pueden soportar entornos biológicos. Por tanto, la presencia de 4-amino-TEMPO, TEMPOL u otra “carga” de nitróxido dentro de la membrana mitocondrial puede servir como eliminador de electrones eficaz y eficiente de las ROS que están produciéndose dentro de la
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membrana. Los ejemplos no limitativos de esto incluyen TEMPO (2,2,6,6-tetrametil-4-piperidin-1-oxilo) y TEMPOL (4-hidroxi-TEMPO), en los que, cuando se incorporan en el compuesto descrito en el presente documento, por ejemplo, cuando R3 es -NH-R5, -O-R5:
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Ejemplos adicionales no limitativos del grupo que contiene -N-Oí, -N-OH o N=O se facilitan en la tabla 1 y en la figura 1 (de Jiang, J., et al. “Structural Requirements for Optimized Delivery, Inhibition of Oxidative Stress, and Antiapoptotic Activity of Targeted Nitroxides”, J Pharmacol Exp Therap. 2007, 320(3):1050-60). Un experto habitual
10 en la técnica podría conjugar (unir covalentemente) cualquiera de estos compuestos al resto del compuesto usando elementos de unión comunes y/o químicas de conjugación, tales como las químicas descritas en el presente documento. La tabla 1 proporciona un extracto no limitativo de una lista de más de 300 compuestos que contienen -N-Oí, -N-OH o N=O disponibles comercialmente identificados que pueden ser útiles en la preparación de los compuestos o composiciones descritos en el presente documento.
15
Tabla 1 – Grupos que contienen -N-Oí, -N-OH o N=O disponibles comercialmente
Estructura
Nombre N.º CAS
N-óxido de trimetilamina
1184-78-7
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N-óxido de N,N-dimetildodecilamina 1643-20-5 70592-80-2
N-benzoil-N-fenilhidroxilamina
304-88-1
N,N-dietilhidroxilamina
3710-84-7
imagen22
N,N-dibencilhidroxilamina 14165-27-6 621-07-8
Nitróxido de di-terc-butilo
2406-25-9
Clorhidrato de N,N-dimetilhidroxilamina
16645-06-0
Metobromuron
3060-89-7
N-óxido de bencil-di-betahidroxietilamina
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Bis(trifluorometil)nitróxido
2154-71-4
N-óxido de trietilamina
2687-45-8
N-metilcarbamato de N-metoxilo
6919-62-6
N,N-bis(2-cloro-6-fluorobencil)-N[(([2,2-dicloro-1-(1,4-tiazinan-4il)etiliden]amino)carbonil)oxi]amina
N-óxido de tri-N-octilamina
13103-04-3
(N-metoxi-Nmetilcarbamoilmetil)fosfonato de dietilo
124931-12-0
N-metoxi-N-metil-2(trifenilfosforaniliden)acetamida
129986-67-0
N-metoxi-N-metil-N’-[5-oxo-2(trifluorometil)-5H-cromeno[2,3B]piridin-3-il]urea
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N-[(4-clorobencil)oxi]-N-([5-oxo-2-fenil1,3-oxazol-4(5H)-iliden]metil)acetamida
Ácido N-metilfurohidroxámico
109531-96-6
N-óxido de N,N-dimetilnonilamina
2536-13-2
N’-metoxi-N’-metilamida de N-(tercbutoxicarbonil)-L-alanina
87694-49-3
1-(4-Bromofenil)-3-(metil([3(trifluorometil)benzoil]oxi)amino)-2propen-1-ona
2-([[(Anilinocarbonil)oxi](metil) amino]metilen)-5-(4-clorofenil)-1,3ciclohexanodiona
N-Metoxi-N-metil-2-(trifluorometil)-1,8naftiridin-3-carboxamida
N-metoxi-N-metil-indol-6-carboxamida
Desferrioxamina
AKOS 91254
127408-31-5
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N-[(3S,4R)-6-ciano-3,4-dihidro-3hidroxi-2,2-dimetil-2H-1-benzopiran-4il]-N-hidroxiacetamida
127408-31-5
N-Metoxi-N-metil-1,2-dihidro-4-oxopirrolo[3,2,1-il]quinolin-5-carboxamida
Fr-900098
Sal de disodio del ácido 2,2’(hidroxiimino)bis-etanosulfónico
133986-51-3
Fmoc-N-etil-hidroxilamina
Hidroxooxovanadato de bis(N,Ndimetilhidroxamido)
Piraclostrobina
175013-18-0
1-Boc-5-cloro-3-(metoxi-metilcarbamoil)indazol
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N-metoxi-N-metil-tiazol-2-carboxamida
HCl de 4,4-difluoro-N-metil-N-metoxi-Lprolinamida
Ácido 3-fluoro-4(metoxi(metil)carbamoil)fenilborónico
913835-59-3
1-Isopropil-N-metoxi-N-metil-1Hbenzo[D][1,2,3]triazol-6-carboxamida
467235-06-9
(Trans)-2-(4-clorofenil)-N-metoxi-Nmetilciclopropanocarboxamida
Metoximetilamida del ácido biciclo[2.2.1]heptano-2-carboxílico
Akos Bc-0582
Éster de pinacol del ácido 3-(N,Odimetilhidroxilaminocarbonil) fenilborónico
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Metoximetilamida del ácido
1
triisopropilsilanil-1H-pirrolo[2,3
B]piridin-5-carboxílico
Según una realización, el compuesto tiene la estructura
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o la estructura
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10 en la que R es -NH-R1, -O-R1 o -CH2-R1, y R1 es un grupo que contiene -N-Oí, -N-OH o N=O. En una realización, R es -NH-R1, y en otra R es -NH-TEMPO.
En otra realización no limitativa, el compuesto tiene la estructura:
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en laqueXes unode
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y
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5 y R1 es hidrógeno, alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada R4 es hidrógeno, alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, incluyendo opcionalmente un grupo fenilo (C6H5), que opcionalmente está sustituido con metilo, hidroxilo
o fluoro, incluyendo: metilo, etilo, propilo, 2-propilo, butilo, t-butilo, pentilo, hexilo, bencilo, hidroxibencilo (por ejemplo, 4-hidroxibencilo), fenilo e hidroxifenilo. R3 es -NH-R5, -O-R5 o -CH2-R5, en los que R5 es un grupo que contiene -N-O, -N-OH o N=O. En una realización, R3 es
10
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(1-Me-AZADO o 1-metil-azaadamantano-N-oxilo). En otra realización R3 es
15
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(TMIO; 1,1,3,3-tetrametilisoindolin-2-iloxilo).
R es -C(O)-R6, -C(O)O-R6, o -P(O)-(R6)2, en los que R6 es alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada que
20 comprende opcionalmente uno o más grupos fenilo (-C6H5), y que están sustituidos opcionalmente con metilo, etilo, hidroxilo o fluoro, incluyendo grupos Ac (Acetilo, R =-C(O)-CH3), Boc (R=-C(O)O-terc-butilo), Cbz (R=-C(O)O-bencilo (Bn)). R también puede ser un grupo difenilfosfato, que es,
R=
25
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En una realización no limitativa, el compuesto tiene una de la estructuras
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Aún en otra realización no limitativa, el compuesto tiene la estructura
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en la que R4 es hidrógeno o metilo.
5 Los compuestos descritos anteriormente, tales como el compuesto de fórmula 1, pueden sintetizarse mediante cualquier método útil. El compuesto JP4-039 se sintetizó mediante el método del ejemplo 8. En una realización, se proporciona un método de obtención de un compuesto de fórmula 1. Los compuestos se sintetizan mediante las etapas siguientes:
10 A. hacer reaccionar un aldehído de estructura R1-C(O)-, en la que, por ejemplo y sin limitación, R1 es alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, incluyendo opcionalmente un grupo fenilo (C6H5), que opcionalmente está sustituido con metilo, hidroxilo o fluoro, incluyendo: metilo, etilo, propilo, 2-propilo, butilo, t-butilo, pentilo, hexilo, bencilo, hidroxibencilo (por ejemplo, 4-hidroxibencilo), fenilo e hidroxifenilo, con (R)-2-metilpropano-2-sulfinamida para formar una imina, por ejemplo
15
imagen33
B. hacer reaccionar un alquin-1-ol (HCC-R2-CH2-OH) terminal, en el que, por ejemplo y sin limitación, R2 no está
presente o es alquileno de cadena lineal o ramificada, incluyendo metilo, etilo, propilo, etc., con una sal de terc20 butildifenilsilano para producir un alquino, por ejemplo
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C. hacer reaccionar (mediante hidrozirconación) el alquino con la imina en presencia de un catalizador de 25 organozirconio para producir un alqueno, por ejemplo
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D1. acilar el alqueno para producir un carbamato, por ejemplo
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en el que, por ejemplo y sin limitación, R3 es alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, incluyendo opcionalmente un grupo fenilo (C6H5), que opcionalmente está sustituido con metilo, hidroxilo o fluoro, incluyendo: metilo, etilo,
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propilo, 2-propilo, butilo, t-butilo, pentilo, hexilo, bencilo, hidroxibencilo (por ejemplo, 4-hidroxibencilo), fenilo e hidroxifenilo;
D2. opcionalmente, ciclopropanar el alqueno y luego acilar el alqueno para producir un carbamato, por ejemplo
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en el que, por ejemplo y sin limitación, R3 es alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, incluyendo opcionalmente un grupo fenilo (C6H5), que opcionalmente está sustituido con metilo, hidroxilo o fluoro, incluyendo: metilo, etilo, 10 propilo, 2-propilo, butilo, t-butilo, pentilo, hexilo, bencilo, hidroxibencilo (por ejemplo, 4-hidroxibencilo), fenilo e hidroxifenilo;
E. eliminar el grupo t-butildifenilsililo del carbamato para producir un alcohol, por ejemplo
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F. oxidar el alcohol para producir un ácido carboxílico, por ejemplo
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20 y
G. hacer reaccionar el ácido carboxílico con un compuesto que contiene nitróxido que comprende uno de un hidroxilo o amina en una reacción de condensación para producir el compuesto antioxidante, por ejemplo
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en el que R4 es -NH-R4 o -O-R4, y R4 es un grupo que contiene -N-Oí, -N-OH o N=O, tal como se describió anteriormente.
Se proporciona un compuesto que tiene la estructura R1-R2-R3 en la que R1 y R3 son un grupo que tiene la estructura -R4-R5, en la que R4 es un grupo de direccionamiento a mitocondrias y R5 es -NH-R6, -O-R6 o -CH2-R6, en los que R6 es un grupo que contiene -N-Oí, -N-OH o N=O, tal como TEMPO. R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes. Asimismo, R4 y R5 por cada uno de R1 y R3 pueden ser iguales o diferentes. R2 es un elemento de unión que, en una realización no limitativa, es simétrico. Las figuras 26A y 26B representan dos ejemplos de tales compuestos. En una realización, R1 y R2 tienen la estructura mostrada en las formulas 1, 2 ó 3 anteriores, con todos los grupos tal como se definieron anteriormente, incluyendo las estructuras A, A1, A2, A3, D, D1, D2 y D3 anteriores, un ejemplo de las cuales es el compuesto JED-E71-58, mostrado en la figura 26B. En otra realización, R1 y R2 son, independientemente, un derivado de gramicidina, por ejemplo, como en el compuesto JED-E71-37, mostrado en la figura 26A. En el presente documento se proporcionan ejemplos de derivados de gramicidina, tales como XJB-5-131 y XJB-5-125 (véase la figura 2), y se describen adicionalmente tanto estructural como funcionalmente en las publicaciones de patente estadounidense n.os 20070161573 y 20070161544 así como en Jiang, J, et al. (Structural Requirements for Optimized Delivery, Inhibition of Oxidative Stress, and Antiapoptotic Activity of Targeted Nitroxides, J Pharmacol Exp Therap. 2007, 320(3):1050-60, véase también, Hoye, AT et al., Targeting Mitochondria, Acc Chem Res. 2008, 41(1):87-97, véase también, Wipf, P, et al., Mitochondrial Targeting of Selective Electron Scavengers: Synthesis and Biological Analysis of Hemigramicidin-TEMPO Conjugates, (2005) J Am Chem Soc. 2005, 127:1246012461). Los compuestos XJB pueden unirse dando lugar a un dímero, por ejemplo y sin limitación, mediante la reacción con el nitrógeno de los grupos BocHN (por ejemplo, como en XJB-5-131), o con una amina, si está presente, por ejemplo, si uno o más grupos amina del compuesto no están acilados para formar una amida (tal como NHBoc o NHCbx).
En Jiang, J, et al. (J Pharmacol Exp Therap. 2007, 320(3):1050-60), usando un modelo de apoptosis inducida por ActD en células embrionarias de ratón, los autores examinaron una biblioteca de nitróxidos para explorar las relaciones estructura-actividad entre sus propiedades antioxidantes/antiapoptóticas y la composición química y la estructura tridimensional (3D). Una alta hidrofobicidad y una integración mitocondrial eficaz se consideraron necesarias pero no suficientes para la alta actividad antiapoptótica/antioxidante de un conjugado de nitróxido. Mediante el diseño de conjugados de nitróxido con peptidilo preorganizados conformacionalmente y la caracterización de su estructura 3D experimental (dicroísmo circular y RMN) y teóricamente (dinámica molecular), se estableció que la presencia de la estructura secundaria en giro β/lámina β es esencial para la actividad deseada. Las simulaciones de Montecarlo en membranas lipídicas modelo confirmaron que la conservación del giro inverso de D-Phe-Pro en análogos de hemi-GS garantiza la colocación específica del resto nitróxido en la superficie de contracto de la membrana mitocondrial y maximiza sus efectos protectores. Estas revelaciones en cuanto a las relaciones estructura-actividad de conjugados de nitróxido-péptido e isóstero peptídico son útiles en el desarrollo de nuevos agentes terapéuticamente eficaces basados en nuevos mecanismos, tal como se describe en el presente documento.
El grupo de direccionamiento R4 puede ser un fragmento peptídico activo de membrana derivado de una molécula de antibiótico que actúa mediante el direccionamiento a la pared celular bacteriana. Ejemplos de tales antibióticos incluyen: bacitracinas, gramicidinas, valinomicinas, eniatinas, alameticinas, beauvericina, serratomolida, esporidesmolida, tirocidinas, polimixinas, monamicinas y péptidos de Lissoclinum. El fragmento peptídico activo de membrana derivado de un antibiótico puede incluir el polipéptido antibiótico completo, o partes del mismo que tienen capacidades de direccionamiento a membrana, y preferiblemente a mitocondrias, que se determina fácilmente, por ejemplo, mediante experimentos de división celular usando péptidos radiomarcados. Ejemplos de fragmentos peptídicos activos en la membrana derivados de gramicidina son los fragmentos de hemigramicidina Leu-D-Phe-Pro-Val-Orn y D-Phe-Pro-Val-Orn-Leu. Puesto que la gramicidina es cíclica, se espera que cualquier fragmento de 5 meros de hemigramicidina sea útil como fragmento peptídico activo de membrana, incluyendo Leu-D-Phe-Pro-Val-Orn, D-Phe-Pro-Val-Orn-Leu, Pro-Val-Orn-Leu-D-Phe, Val-Orn-Leu-D-Phe-Pro y Orn-Leu-D-Phe-Pro-Val (de gramicidina S). Se espera que cualquier fragmento de gramicidina más grande o más pequeño, o incluso fragmentos más grandes que contienen secuencias de gramicidina repetidas (por ejemplo, Leu-D-Phe-Pro-Val-Orn-Leu-D-Phe
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Pro-Val-Orn-Leu-D-Phe-Pro) sea útil para el direccionamiento a membrana, y puede someterse a prueba fácilmente tal actividad. En una realización, el péptido derivado de gramicidina S comprende un giro β, que parece conferir al péptido una alta afinidad por mitocondrias. Los derivados de gramicidina, u otros fragmentos de antibiótico, incluyen isósteros (moléculas o iones con el mismo número de átomos y el mismo número de electrones de valencia – como resultado, pueden presentar propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas similares), tales como isósteros de (E)-alqueno (véanse, las publicaciones de patente estadounidenses n.os 20070161573 y 20070161544 para métodos de síntesis a modo de ejemplo). Al igual que con la gramicidina, la estructura (secuencia de aminoácidos) de bacitracinas, otras gramicidinas, valinomicinas, eniatinas, alameticinas, beauvericina, serratomolida, esporidesmolida, tirocidinas, polimixinas, monamicinas y péptidos de Lissoclinum se conoce bien, y pueden prepararse fácilmente fragmentos de las mismas y pueden confirmarse fácilmente sus capacidades de direccionamiento a membrana por un experto habitual en la técnica.
Se usaron isósteros de alqueno tales como isósteros de (E)-alqueno de gramicidina S (es decir, hemigramicidina) como parte de la secuencia de direccionamiento. Véase la figura 3 para una ruta sintética para isósteros de (E)alqueno y el número de referencia 2 para la estructura química correspondiente. En primer lugar, la hidrozirconación de alquino (figura 3, compuesto 1) con Cp2ZrHCl va seguida por transmetalación a Me2Zn y la adición de N-Bocisovaleraldimina. Entonces se realizó el tratamiento final del compuesto resultante (no mostrado) usando una disolución de fluoruro de tetrabutilamonio (“TBAF”) y dietil éter con un rendimiento del 74%. Entonces se trató el compuesto resultante con anhídrido acético, trietilamina (TEA) y 4-N,N1-(dimetilamino)piridina (“DMAP”) para proporcionar una mezcla de amidas alílicas diastereoméricas con un rendimiento del 94% que se separó mediante cromatografía. Finalmente, se realizó el tratamiento final del producto con K2CO3 en metanol para producir el (E)alqueno, representado como compuesto 2. El (E)-alqueno, representado como compuesto 2 de la figura 3, se oxidó entonces en un procedimiento de múltiples etapas para producir el compuesto 3 (figura 3) -un ejemplo del isóstero de (E)-alqueno.
Entonces se conjugó el compuesto 3 de la figura 3 con el péptido H-Pro-Val-Orn (Cbz)-OMe usando clorhidrato de 1etil-3-(3-dimetilaminopropilcarbodiimida) (EDC) como agente de acoplamiento. El péptido es un ejemplo de una secuencia de direccionamiento adecuada que tiene afinidad por las mitocondrias de una célula. El producto resultante se muestra como compuesto 4a en la figura 3. La saponificación del compuesto 4a seguido por el acoplamiento con 4-amino-TEMPO (4-AT) proporcionó el conjugado resultante mostrado como compuesto 5a en la figura 3, en la que el enlace peptídico Leu-DPhe se ha sustituido por un (E)-alqueno.
En una realización alternativa, se prepararon los conjugados 5b en la figura 3 mediante la saponificación y el acoplamiento del péptido 4b (Boc-Leu-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-OMe) con 4-AT. De manera similar, se preparó el conjugado 5c en la figura 3 mediante el acoplamiento del isóstero de (E)-alqueno indicado como compuesto 3 en la figura 3 con 4-AT. Este péptido y análogos de péptido son ejemplos adicionales de secuencias de direccionamiento adecuadas que tienen afinidad por las mitocondrias de una célula.
En otra realización, pueden emplearse isósteros peptídicos como conjugado. Entre los isósteros peptídicos adecuados están isósteros peptídicos de (E)-alqueno trisustituido e isósteros peptídicos de ciclopropano, así como todos los productos de adición de imina de alquinos internos y terminales hidro-o carbometalados para la síntesis de isósteros peptídicos de ciclopropano y (E)-alqueno di-y trisustituidos. Véase Wipf et al. Imine additions of internal alkynes for the synthesis of trisustituted (E)-alkene and cyclopropane isosteres, Adv Synth Catal. 2005, 347:16051613. Se ha encontrado que estos miméticos peptídicos actúan como promotores de giro β. Véase Wipf et al. Convergent Approach to (E)-Alkene and Cyclopropane Peptide Isosteres, Org Lett. 2005, 7(1):103-106.
El elemento de unión, R2, puede ser cualquier elemento de unión útil, elegido por sus grupos activos, por ejemplo, carboxilo, alcoxilo, amino, sulfhidrilo, amida, etc. Normalmente, aparte de los grupos activos, el resto es no reactivo (tal como fenilo o alquilo saturado) y no interfiere, estéricamente ni mediante ningún otro atributo físico o químico, tal como polaridad o hidrofobicidad/hidrofilicidad, en una capacidad negativa (pérdida de función) con la actividad del compuesto global. En una realización, aparte de los grupos activos, el elemento de unión comprende un alquilo C4-C20 saturado lineal o ramificado. En una realización, el elemento de unión, R2 tiene la estructura
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en la que n es 4-18, incluyendo todos los número enteros entre ellos, en una realización, 8-12, y en otra realización,
10. Un experto en las técnicas de síntesis orgánica puede sintetizar estos compuestos mediante la reticulación de
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En una realización relacionada, el antagonista de NOS se selecciona del grupo que consiste en XJB-5-234 (a), XJB5-133 (b), XJB-5-241 (c) y XJB-5-127 (d), que comprenden cargas de antagonista de NOS AMT:
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Ejemplo 7
Los siguientes ejemplos proporcionan protocolos para una carga adicional que puede usarse en los compuestos 10 descritos en el presente documento que sirven como antagonistas de NOS.
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El compuesto (1) es Boc-Leu-ψ[(E)-C(CH3)=CH]-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-AMT (XJB-5-241) y se preparó según el
15 siguiente protocolo. Se trató una disolución de 11,0 mg (13,2 µmol) de Boc-Leu-ψ[(E)-C(CH3)=CH]-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-OMe (2-48) en 400 µl de MeOH a 0ºC con 132 µl (132 µmol) de NaOH 1 N. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 8 h y se trató con 132 µl (132 µmol) de HCl 1 N. Se extrajo la disolución con CHCl3 y se secó la fase orgánica (Na2SO4) y se concentró a vacío para dar el ácido en bruto como una forma incolora. Se disolvió este ácido en 2,00 ml de CHCl3 y se trató a temperatura ambiente con 2,1 mg (16 µmol) de HOBt, 3,0 mg
20 (16 µmol) de EDC, 3,3 mg (20 µmol) de 2-amino-5,6-dihidro-6-metil-4H-1,3-tiazina • HCl y 3,5 mg (27 µmol) de DMAP. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 48 h, se diluyó con CHCl3 y se lavó con H2O. Se secó la fase orgánica (Na2SO4), se concentró a vacío y se purificó mediante cromatografía sobre SiO2 (1:1, hexanos/EtOAc seguido por 20:1, CHCl3/MeOH) para producir 11 mg (89%) de XJB-5-241 como un polvo incoloro. Se obtuvieron los siguientes datos de caracterización: CL-EM (Rt 8,37 min, gradiente lineal del 70% al 95% de
25 CH3CN (H2O) en 10 min, 0,4 ml/min; m/z = 932,4 [M+H]+, 954,3 [M+Na]+) y EMAR (ESI) m/z calculado para C50H74N7O8S (M+H) 932,5320, hallado 932,5318.
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El compuesto (2) es Boc-Leu-ψ[(E)-CH=CH]-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-AMT (XJB-5-133) y se preparó según el siguiente protocolo. Se trató una disolución de 20,0 mg (24,3 µmol) de 2-85 (XJB-5-194) en 800 µl de MeOH a 0ºC 5 con 243 µl (243 µmol) de NaOH 1 N. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 6 h y se trató con 243 µl (243 µmol) de HCl 1 N. Se extrajo la disolución con CHCl3 y se secó la fase orgánica (Na2SO4) y se concentró a vacío para dar el ácido en bruto como una forma incolora. Se disolvió este ácido en 1,00 ml de CHCl3 y se trató a temperatura ambiente con 3,9 mg (29 µmol) de HOBt, 5,6 mg (29 µmol) de EDC, 6,1 mg (37 µmol) de 2amino-5,6-dihidro-6-metil-4H-1,3-tiazina • HCl y 7,4 mg (61 µmol) de DMAP. Se agitó la mezcla de reacción a 10 temperatura ambiente durante 20 h, se diluyó con CHCl3 y se lavó con H2O. Se secó la fase orgánica (Na2SO4), se concentró a vacío y se purificó mediante cromatografía sobre SiO2 (1:1, hexanos/EtOAc seguido por 20:1, CHCl3/MeOH) y se realizó una purificación mediante HPLC de fase inversa C18 preparativa adicional: del 80% al 100% de CH3CN (H2O) en 20 min, 5,0 ml/min) para proporcionar 12,9 mg (58%) de XJB-5-133 como un polvo incoloro. Se obtuvieron los siguientes datos de caracterización: CL-EM (Rt 7,89 min, gradiente lineal del 70% al 95%
15 de CH3CN (H2O) en 10 min, 0,4 ml/min; m/z = 918,3 [M+H]+, 940,3 [M+Na]+) y EMAR (ESI) m/z calculado para C49H72N7O8S (M+H) 918,5163, hallado 918,5185.
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20 El compuesto (3) es Boc-Leu-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-AMT (XJB-5-127) y se preparó según el siguiente protocolo. Se trató una disolución de 24,0 mg (28,7 µmol) de Boc-Leu-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-OMe en 800 µl de MeOH a temperatura ambiente con 287 µl (287 µmol) de NaOH 1 N. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 5 h y se trató a 0ºC con 287 µl (287 µmol) de HCl 1 N. Se extrajo la disolución con CHCl3 y se secó la fase orgánica (Na2SO4) y se concentró a vacío para dar el ácido en bruto como una espuma incolora. Se disolvió el ácido
25 en bruto en 2,00 ml de CHCl3 y se trató a temperatura ambiente con 4,6 mg (34 µmol) de HOBt, 6,6 mg (34 µmol) de EDC, 5,7 mg (34 µmol) de 2-amino-5,6-dihidro-6-metil-4H-1,3-tiazina • HCl y 8,8 mg (72,0 µmol) de DMAP. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 24 h, se diluyó con CHCl3 y se lavó con H2O. Se secó la fase orgánica (Na2SO4), se concentró a vacío y se purificó mediante cromatografía sobre SiO2 (2:1, hexanos/EtOAc seguido por 20:1, CHCl3/MeOH) para producir 17,0 mg (63%) de XJB-5-127 como un polvo incoloro. Se obtuvieron
30 los siguientes datos de caracterización: CL-EM (Rt 6,32 min, gradiente lineal del 70% al 95% de CH3CN (H2O) en 10 min, 0,4 ml/min; m/z = 935,3 [M+H]+, 957,3 [M+Na]+) y EMAR (ESI) m/z calculado para C48H71N8O9S (M+H) 935,5065, hallado 935,5044.
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El compuesto (4) es Boc-Leu-ψ[(E)-CH=CH]-DPhe-AMT (XJB-5-234). Se trató una disolución de Boc-Leu-ψ[(E)-CH=CH]-DPhe-OH (2-84) en bruto (30,5 µmol) en 2,00 ml de CH2Cl2 a 0ºC con 6,1 mg (37 µmol) de 2-amino-5,6dihidro-6-metil-4H-1,3-tiazina • HCl, 7,0 mg (37 µmol) de EDC, 4,9 mg (37 µmol) de HOBt y 9,3 mg (76 µmol) de DMAP. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche, se concentró a vacío y se purificó mediante cromatografía sobre SiO2 (2:1, CH2Cl2/EtOAc) para producir 9,1 mg (63%) de XJB-5-234 como una espuma incolora. Se obtuvieron los siguientes datos de caracterización: CL-EM (Rt 8,42 min, gradiente lineal del 70% al 95% de CH3CN (H2O) en 10 min, 0,4 ml/min; m/z = 474,5 [M+H]+) y EMAR (ESI) m/z calculado para C26H40N3O3S (M+H) 474,2790, hallado 474,2781.
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El compuesto (5) es Boc-Leu-ψ[(Z)-CF=CH]-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-TEMPO (XJB-7-53). Se trató una disolución de 3,4 mg (4,1 µmol) de Boc-Leu-ψ[(Z)-CF=CH]-DPhe-Pro-Val-Orn(Cbz)-OMe XJB-5-66) en 400 µl de MeOH a 0ºC con 41 µl (41 µmol) de NaOH 1 N. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 12 h y se trató con 41 µl (41 µmol) de HCl 1 N. Se extrajo la disolución con CHCl3 y se secó la fase orgánica (Na2SO4) y se concentró a vacío para dar el ácido en bruto como una forma incolora. Se disolvió este ácido en 400 µl de CHCl3 y se trató a temperatura ambiente con 0,7 mg (5 µmol) de HOBt, 0,9 mg (5 µmol) de EDC, 0,5 mg (4 µmol) de 4-amino-TEMPO y 1,1 mg (6 µmol) de DMAP. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 12 h, se diluyó con CHCl3 y se lavó con H2O. Se secó la fase orgánica (Na2SO4), se concentró a vacío y se purificó mediante cromatografía sobre SiO2 (1:1, hexanos/EtOAc seguido por 20:1, CHCl3[MeOH) para producir 3,6 mg (91%) de XJB7-53 como un polvo incoloro. Se obtuvieron los siguientes datos de caracterización: CL-EM (Rt 8,45 min, gradiente lineal del 70% al 95% de CH3CN (H2O) en 10 min, 0,4 ml/min; m/z = 977,5 [M+H]+, 999,5 [M+Na]+) y EMAR (ESI) m/z calculado para C53H79FN7O9Na (M+Na) 999,5821.
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El compuesto (6) es Boc-DPhe-ψ[(E)-C(CH3)=CH]-Ala-Val-Orn(Cbz)-Leu-AMT (XJB-7-42) y se preparó según el siguiente protocolo. Se trató una disolución de 4,5 mg (5,6 µmol) de Boc-DPhe-ψ[(E)-C(CH3)=CH]-Ala-Val-Orn(Cbz)-Leu-OMe (2-119) en 0,35 ml de MeOH a 0ºC con 56 µl (56 µmol) de NaOH 1 N. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 12 h y se trató con 56 µl (56 µmol) de HCl 1 N. Se extrajo la disolución con CHCl3 y se secó la fase orgánica (Na2SO4) y se concentró a vacío para dar el ácido en bruto como una forma incolora. Se disolvió este ácido en 0,80 ml de CHCl3 y se trató a temperatura ambiente con 0,9 mg (6,7 µmol) de HOBt, 1,3 mg (6,7 µmol) de EDC, 1,4 mg (8,4 µmol) de 2-amino-5,6-dihidro-6-metil-4H-1,3-tiazina • HCl y 1,7 mg (14 µmol) de DMAP. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 36 h, se concentró a vacío y se purificó mediante cromatografía sobre SiO2 (20:1, CHCl3/MeOH) para producir 5,0 mg (99%) de XJB-7-42 como una espuma incolora. Se obtuvieron los siguientes datos de caracterización: CL-EM (Rt 6,61 min, gradiente lineal del 70% al 95% de CH3CN (H2O) en 10 min, 0,4 ml/min; m/z = 907,3 [M+H]+, 929,4 [M+Na]+) y EMAR (ESI) m/z calculado para C48H72N7O8S (M+H) 906,5163, hallado 906,5190.
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El compuesto (7) es Boc-DPhe-ψ[(E)-C(CH3)=CH]-Ala-Val-AMT (XJB-7-43). Se trató una disolución de 14,3 µmol de Boc-DPhe-ψ[(E)-C(CH3)=CH]-Ala-Val-OMe (2-111) en bruto en 1,00 ml de CHCl3 a temperatura ambiente con 2,3 mg 5 (17 µmol) de HOBt, 3,3 mg (17 µmol) de EDC, 3,6 mg (22 µmol) de 2-amino-5,6-dihidro-6-metil-4H-1,3-tiazina • HCl y 4,4 mg (36 µmol) de DMAP. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 36 h, se concentró a vacío y se purificó mediante cromatografía sobre SiO2 (20:1, CHCl3/MeOH) para producir 7,5 mg (96%) de XJB-7-43 como una espuma incolora. Se obtuvieron los siguientes datos de caracterización: CL-EM (Rt 5,41 min, gradiente lineal del 70% al 95% de CH3CN (H2O) en 10 min, 0,4 ml/min; m/z = 545,3 [M+H]+, 567,3 [M+Na]+) y EMAR (ESI)
10 m/z calculado para C29H44N4O4S (M+Na) 567,2981, hallado 567,2971.
Entre los agentes de eliminación de radicales preferidos está un material seleccionado del grupo que consiste en un análogo de ubiquinona, un resto de fragmento de análogo de ubiquinona, un resto de fragmento de análogo de ubiquinona que carece de una cola hidrófila, un mimético de superóxido dismutasa, un biomimético de superóxido
15 dismutasa o un compuesto de salen-manganeso.
Tal como conoce un experto habitual en la técnica, la radiación ionizante activa una óxido nítrico sintasa mitocondrial (“mtNOS”), conduciendo a la inhibición de la cadena respiratoria, generación de radicales superóxido en exceso, producción de peroxinitrito y daño nitrosativo. Se cree que se alivia el daño realizado por la radiación ionizante
20 [véase Kanai, A.J. et al., Am J Physiol. 383: F1304-F1312 (2002); y Kanai, A.J. et al., Am J Physiol. 286: H13-H21 (2004)]. La composición de esta realización se caracteriza por la propiedad de inhibir mtNOS, resistiendo de ese modo la generación de radicales superóxido en exceso, peroxinitrito y daño nitrosativo.
La protección frente al daño por irradiación usando suministro de fármaco sistémico puede dar como resultado
25 efectos secundarios no deseados. Un enfoque para limitar o prevenir estos efectos secundarios adversos es dirigir el suministro del fármaco a la mitocondria usando una estrategia de portador peptídico.
En una realización, se seleccionó un potente inhibidor de NOS, el análogo distinto de arginina de 2-amino-6-metiltiazina (“AMT”), como carga. La irradiación del ureoepitelio da como resultado un aumento de la producción de
30 superóxido y óxido nítrico (“NO”), se instilaron vejigas de ratón con AMT o 4-amino-TEMPO para determinar si la inhibición de NO o la eliminación de radicales libres es más radioprotectora.
Se incubaron un antagonista de NOS conjugado y no conjugado (AMT, 100 µM) y un derivado de nitróxido conjugado y no conjugado (4-amino-TEMPO, 100 µM) durante dos horas a 37ºC con células hematopoyéticas 32D
35 c13.
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Tras la incubación, se lisaron las células y se aislaron las mitocondrias para un análisis de espectrometría de masas
40 en el que se identificaron compuestos aislados de mitocondrias como aductos de Na+. Los espectros resultantes (no mostrados) demuestran que 4-amino-TEMPO sólo permea la membrana mitocondrial con la ayuda de la secuencia de direccionamiento derivada de GS unida. Espectros adicionales (no mostrados) indican que AMT no conjugado no entra en la membrana de la mitocondria en cantidades sustanciales. Por tanto, los péptidos de direccionamiento dirigen satisfactoriamente un antagonista de NOS y un nitróxido a la mitocondria.
45 Se realizaron estudios fisiológicos adicionales para determinar los efectos de AMT dirigido por péptidos y 4-amino-TEMPO sobre la producción de NO y peroxinitrito en células ureoepiteliales irradiadas. Se cultivaron las células en una cámara de portaobjetos de 8 pocillos durante 3 días y entonces se tomaron mediciones con microsensores 24 horas tras la irradiación.
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En células irradiadas no tratadas y células tratadas con 4-amino-TEMPO no conjugado (100 µM) o AMT no
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conjugado (10 µM), la capsaicina provocó la producción de NO y dio como resultado la formación de una cantidad comparable de peroxinitrito. En células tratadas con 4-amin-TEMPO conjugado a alta dosis (100 µM), la producción de peroxinitrito disminuyó aproximadamente 4 veces. En células no radiadas o células tratadas con AMT conjugado (10 µM), la formación de peroxinitrito inducida por NO se inhibió casi completamente. Esto sugirió que los 5 conjugados peptídicos se acoplan o se unen covalentemente con 4-amino-TEMPO o AMT que no permea la membrana y facilitan el transporte de 4-amin-TEMPO a través de la membrana mitocondrial. Además, estos datos sugieren que los conjugados peptídicos no interfieren con la actividad inhibidora de NOS de AMT o la actividad de eliminación de radicales libres de 4-amino-TEMPO y que AMT es un radioprotector más eficaz [Kanai, A.J. et al., Mitochondrial Targeting of Radioprotectants Using Peptidyl Conjugates, ORGANIC AND BIOMOLECULAR
10 CHEMISTRY (en prensa)].
Se usaron estudios de espectrometría de masas cuantitativos para comparar la eficacia de varios conjugados de AMT-péptido en la permeación de la membrana mitocondrial, específicamente XJB-5-234, XJB-5-133, XJB-5-241 y XJB-5-127. La razón de fmol/proteína mitocondrial 10 µM proporciona una cuantificación relativa de la concentración
15 de conjugado en el sitio diana. La tabla 3 indica que el conjugado más eficaz era el compuesto XJB-5-241.
Tabla 3
Compuesto
fmol/proteína mitocondrial 10 µM
XJB-5-234 XJB-5-133 XJB-5-241 XJB-5-127
1,45 89,8 103,3 50,8
20 El resto de (E)-alqueno trisustituido incrustado en XJB-5-241 tiene un efecto conformacional más fuerte que el (E)alqueno disustituido menos activo biológicamente en XJB-5-133 o el fragmento de GS-peptidilo en XJB-5-127, véase Wipf, P. et al., Methyl-and (Triluoromethyl)alquene Peptide Isosteres: Synthesis and Evaluation of Their Potential as β-Turn Promoters and Peptide Mimetics J ORG. CHEM. 63:6088-6089 (1998); también Wipf, P. et al., Imine Additions of Internal Alkynes for the Synthesis of Trisustituted (E)-Alquene and Ciclopropane Peptide Isosteres ADV.
25 SYNTH. CAT. 347:1605-1613 (2005). Los datos indican que una estructura secundaria definida y una preorganización conformacional apropiada es importante en el logro de la permeación mitocondrial de compuestos que reducen efectos nitrosativos y oxidativos.
La presencia de un isóstero de alqueno no hidrolizable funciona en lugar de enlaces peptídicos lábiles y es
30 significativa para un mecanismo de acción prolongado. Los (E)-alquenos relativamente rígidos (ψ[(E)-C(R)=CH]) representan miméticos estructurales preorganizados conformacionalmente y se han usado como sustitutos de enlaces amida hidrolíticamente lábiles en varios inhibidores enzimáticos. El objetivo primario de esta estrategia es la imitación precisa de la geometría del enlace peptídico; sin embargo, los (E)-alquenos también modulan las propiedades fisicoquímicas, solubilidad y lipofilicidad, número de donadores y aceptores de hidrógeno, etc., de las
35 estructuras originales, y por tanto tienen generalmente un destino metabólico diferente que los péptidos sencillos.
Una estrategia de suministro dirigido empleada en esta invención es ventajosa puesto que algunos antagonistas de NOS neuronal (nNOS) y la mayoría de los antioxidantes, incluyendo derivados de nitróxido, permean escasamente en células y requieren concentraciones terapéuticamente eficaces mayores de 100 µM si se usan sin un conjugado.
40 El método relacionado con esta realización de la invención suministra una composición a mitocondrias que comprende transportar a dichas mitocondrias una carga deseada que puede ser, por ejemplo, (a) un agente de eliminación de radicales mediante el uso de un fragmento peptidilo activo en la membrana que tiene preferiblemente un motivo de giro β que tiene una alta afinidad por la membrana mitocondrial o (b) un antagonista de óxido nítrico
45 sintasa unido al fragmento peptidilo activo en la membrana.
Ejemplo 8 -Síntesis de JP4-039 (véase la figura 11)
Se logró la síntesis de JP4-039 según lo siguiente.
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(R,E)-2-Metil-N-(3-metilbutiliden)propano-2-sulfinamida (1) (Staas, D. D.; Savage, K. L.; Homnick, C. F.; Tsou, N.;
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Ball, R. G. J. Org. Chem., 2002, 67, 8276) -A una disolución de isovaleraldehído (3-metilbutiraldehído, 5,41 ml, 48,5 mmol) en CH2Cl2 (250 ml) se le añadió (R)-2-metilpropano-2-sulfinamida (5,00 g, 40,4 mmol), MgSO4 (5,0 eq., 24,3 g, 202 mmol) y PPTS (al 10% en moles, 1,05 g, 4,04 mmol) y se agitó la suspensión resultante a TA (temperatura ambiente, aproximadamente 25ºC) durante 24 h. Se filtró la reacción a través de un lecho de Celite® y se purificó el residuo en bruto mediante cromatografía sobre SiO2 (3:7, EtOAc:hexanos) para producir 6,75 g (88%) como un aceite incoloro. 1H-RMN δ 8,07 (t, 1 H, J = 5,2 Hz), 2,47-2,38 (m, 2 H), 2,18-1,90 (m, 1 H), 1,21 (s, 9 H), 1,00 (d, 6 H, J = 6,7 Hz). Como alternativa, la filtración a través de un lecho de SiO2 proporciona imina en bruto que funciona igualmente bien en las reacciones posteriores.
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(But-3-iniloxi)(terc-butil)difenilsilano (2) (Nicolaou, K. C. et al. J. Am. Chem. Soc. 2006,128, 4460) -A una disolución de 3-butin-1-ol (5,00 g, 71,3 mmol) en CH2Cl2 (400 ml) se le añadió imidazol (5,40 g, 78,5 mmol) y TBDPSCl ((cloruro de terc-butil)difenilsilano) (22,0 g, 78,5 mmol) y se agitó la reacción a TA durante 22 h. Se filtró la reacción a través de un lecho a SiO2, se lavó el SiO2 con CH2Cl2 y se concentró la disolución incolora para producir 21,4 g (97%) de alquino en bruto que se llevó a cabo sin purificación adicional.
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Clorhidrato de (S,E)-8-(terc-butildifenilsililoxi)-2-metiloct-5-en-4-amina (3) -A una disolución de (2) (15,9 g, 51,5 mmol) en CH2Cl2 (300 ml) se le añadió clorhidrato de zirconoceno (15,1 g, 58,4 mmol) en 3 porciones y se agitó la suspensión resultante a TA durante 10 min. Se enfrió la disolución amarilla resultante hasta 0ºC y se añadió Me3Al (2,0 M en hexanos, 27,5 ml, 54,9 mmol) y se agitó durante 5 minutos seguido por la adición de una disolución de imina (1) (6,50 g, 34,3 mmol) en CH2Cl2 (50 ml) y se agitó la disolución naranja durante 4 h adicionales mientras se permitía que se calentase hasta ta. Se extinguió la reacción con MeOH, se diluyó con H2O y CH2Cl2 y se añadió HCl (1 M) para romper la emulsión (también puede utilizarse agitación prolongada con sal de Rochelle). Se separó la fase orgánica y se lavó la fase acuosa con CH2Cl2 (2x). Se combinaron las fases orgánicas, se lavaron con salmuera, se secaron (MgSO4), se filtraron a través de un lecho de Celite® y se concentraron. Puesto que el aceite en bruto estaba contaminado con sales de metales, se disolvió el aceite en Et2O (dietil éter, Et = etilo), se permitió que se asentase durante 2 h y entonces se filtró a través de un lecho de Celite® y se concentró. El análisis del residuo en bruto mediante 1H-RMN mostró sólo 1 diastereómero (r.d.> 95:5).
Al residuo en bruto en Et2O (800 ml) se le añadió HCl (4,0 M en dioxano, 17,2 ml, 68,7 mmol) y se agitó la reacción durante 30 minutos, tiempo durante el cual se formó un precipitado blanco. Se filtró el precipitado, se lavó con Et2O seco y se secó para proporcionar 11,0 g (el 74% a lo largo de 2 etapas) de (3) como un sólido incoloro. P.f. 151154ºC; [α]D -2,9 (c 1,0, CH2Cl2); 1H-RMN δ 8,42 (sa, 3 H), 7,70-7,55 (m, 4 H), 7,48-7,30 (m, 6 H), 5,90 (dt, 1 H, J = 14,9, 7,5 Hz), 5,52 (dd, 1 H, J = 15,4, 8,4 Hz), 3,69 (t ap., 3 H, J = 6,5 Hz), 2,45-2,20 (m, 2 H), 1,80-1,50 (m, 3 H), 1,03 (s, 9 H), 0,95-0,84 (m, 6 H); 13C-RMN δ 135,5, 134,5, 133,7, 129,5, 127,6, 127,3, 63,0, 52,9, 42,1, 35,6, 26,7, 24,4, 22,9, 21,5, 19,1; EMEI m/z 395 ([M-HCl]+, 40), 338 (86), 198 (100); EMAR (EI) m/z calc. para C25H37NOSi (M-HCl) 395,2644, hallado 395,2640.
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(S,E)-8-(terc-Butildifenilsililoxi)-2-metiloct-5-en-4-ilcarbamato de terc-butilo (4) -A una disolución de (3) (10,5 g, 24,3 mmol) en CH2Cl2 (400 ml) se le añadió Et3N (trietilamina) (3,0 eq., 10,3 ml, 72,9 mmol) y Boc2O (1,05 eq., 5,74 g, 25,5 mmol) y se agitó la suspensión resultante a TA durante 14 h. Se extinguió la reacción con NH4Cl ac. sat., se separaron las fases orgánicas, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. Se llevó el residuo en bruto a la siguiente etapa sin purificación adicional.
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(S,E)-8-Hidroxi-2-metiloct-5-en-4-ilcarbamato de terc-butilo (5) -A una disolución de (4) en bruto (12,0 g, 24,3 mmol)
en THF (200 ml) a 0ºC se le añadió TBAF (1,0 M en THF, 1,25 eq., 30,4 ml, 30,4 mmol) y se calentó la reacción
5 hasta TA y se agitó durante 2 h. Se extinguió la reacción con NH4Cl ac. sat., se lavó la fase orgánica con salmuera,
se secó (MgSO4), se filtró y se concentró. Se purificó el residuo en bruto mediante cromatografía sobre SiO2 (3:7,
EtOAc:hexanos) para producir 5,51 g (88%, 2 etapas) como un aceite incoloro. [α]D -12,7 (c 1,0, CH2Cl2); 1H-RMN δ
5,56 (dt, 1 H, J = 15,3, 6,9 Hz), 5,41 (dd, 1 H, J = 15,4, 6,4 Hz), 4,41 (sa, 1 H), 4,06 (ma, 1 H), 3,65 (ca ap., 2 H, J =
5,7 Hz), 2,29 (q, 2 H, J = 6,3 Hz), 1,76 (sa, 1 H), 1,68 (m, 1 H), 1,44 (s, 9 H), 1,33 (m, 2 H), 0,92 (m, 6 H); 13C-RMN δ 10 155,4, 134,3, 126,9, 79,2, 61,5, 50,9, 44,5, 35,6, 28,3, 24,6, 22,5; EMEI m/z 257 ([M]+, 10), 227 (55), 171 (65); EMAR
(EI) m/z calc. para C14H27NO3 257,1991, hallado 257,1994.
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15 Ácido (S,E)-5-(terc-butoxicarbonilamino)-7-metiloct-3-enoico (6) -A una disolución de (5) (1,00 g, 3,89 mmol) en acetona (40 ml) a 0ºC se le añadió una disolución preparada de manera reciente de reactivo de Jones (2,5 M, 3,89 ml, 9,71 mmol) y se agitó la reacción a 0ºC durante 1 h. Se extrajo la disolución oscura con Et2O (3 x 50 ml), se lavaron las fases orgánicas con agua (2 x 75 ml), salmuera (1 x 50 ml), se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron para producir 990 mg (en bruto al 94%) de ácido (6) como un aceite amarillo que se usó sin
20 purificación adicional.
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TEMPO-4-il-(S,E)-5-(terc-butoxicarbonilamino)-7-metiloct-3-enamida (7) -A una disolución de (6) (678 mg,
25 2,50 mmol, en bruto) en CH2Cl2 (35 ml) a 0ºC se le añadió 4-amino tempo (1,5 eq., 662 mg, 3,75 mmol), EDCI (1,2 eq., 575 mg, 3,00 mmol), DMAP (1,1 eq., 339 mg, 2,75 mmol) y HOBt-hidratado (1,1 eq., 377 mg, 2,75 mmol) y se agitó la disolución naranja resultante a TA durante 14 h. Se diluyó la reacción con CH2Cl2, se lavó con NH4Cl ac. sat. y se secó la fase orgánica (Na2SO4), se filtró y se concentró. Se purificó el residuo en bruto mediante cromatografía sobre SiO2 (de 1:1 a 2:1, EtOAc/hexanos) para producir 857 mg (76%, 2 etapas) como un sólido de
30 color melocotón. P.f. 61ºC (punto de ablandamiento: 51ºC); [α]D23 +35,6 (c 0,5, DCM); ESI-EM m/z 365 (40), 391 (50), 447 ([M+Na]+, 100), 257 (20); EMAR (ESI) m/z calc. C23H42N3O4Na 447,3073, hallado 447,3109.
Los compuestos mostrados como fórmula 4, anteriormente pueden sintetizarse tal como se muestra en la figura 11B. En resumen, se logró la síntesis tal como sigue: A una disolución de compuesto (1) en CH2Cl2 se le añadió 35 clorhidrato de zirconoceno, seguido por la adición de Me2Zn, luego una disolución de N-difenilfosforil-1fenilmetanimina (imina). Se sometió a reflujo la mezcla de reacción, se filtró, se lavó y se secó para proporcionar (2). La escisión del grupo protector de TBDPS se logró tratando (2) con TBAF, lo que dio como resultado la formación de (3). Se deshidrató el alcohol (3) terminal para dar el alqueno (4), que se trató adicionalmente mediante ozonólisis para proporcionar el éster (5). Se usaron protocolos similares al facilitado para la síntesis de JP4-039, anterior, para
40 acilar el grupo amino con el grupo protector Boc y para hacer reaccionar el ácido carboxílico terminal con 4-amino-TEMPO para proporcionar (6).
Ejemplo 9 -El conjugado de nitróxido/hemigramicidina S dirigido a las mitocondrias protege células embrionarias de ratón frente a la irradiación gamma (véase, Jiang, J, et al., Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., vol. 70, n.º 3, págs. 45 816-825, 2008)
Análisis basado en EPR de integración y distribución de nitróxidos. Para comparar la eficacia de integración, se incubaron células embrionarias de ratón (1×107/ml) con nitróxidos 10 µM durante 10 min. Se registraron los espectros de ESR de radicales nitróxido en el medio de incubación, la suspensión celular o la suspensión 50 mitocondrial tras mezclar con acetonitrilo (1:1 v/v) tras una incubación de 5 min con K3Fe(CN)6 2 mM usando un
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que XJB-5-131, JED-E71-37 y JED-E71-58 eran menos eficaces a esta concentración.
Ejemplo 18 – Efectos protectores de antioxidantes en cultivo celular
Para evaluar las actividades protectoras de JED-E71-37 y JED-E71-58, se prepararon células MEF primarias a partir de ratones Ercc1 -/-y se hicieron crecer en condiciones de estrés oxidativo (aire ambiental, 20% de oxígeno). Entonces las células o bien no se trataron o bien se trataron con JED-E71-37 o JED-E71-58 1 µM durante un periodo de 48 horas. Tal como puede observarse en la figura 38, ambos compuestos mejoraron la proliferación celular a pesar del estrés oxidativo.
A continuación, se sometieron a prueba las capacidades de estos dos agentes, así como de XJB-5-131 y JP4-039, cada uno a una concentración de 1 µM, para determinar su capacidad para impedir las roturas de doble hebra de ADN inducidas por oxidación en cultivos celulares preparados, y sometidos a estrés oxidativo, como en el párrafo anterior. Se sometieron a inmunotinción las células tratadas así como las no tratadas células, tras 48 horas de tratamiento, para detectar γ-H2AX, un marcador de las roturas de doble hebra de ADN así como la senescencia celular. Se muestran los resultados para JED-E71-58 en la figura 39, que muestran una disminución marcada en γ-H2AX. JP4-039 también fue eficaz, pero se observó que XJB-5-131 y JED-E71-37 eran menos eficaces a esta concentración.
Ejemplo 19 – Diseños alterativos de análogos de nitróxido
Para investigar adicionalmente los requisitos estructurales para una alta actividad del compuesto de GS-nitróxido JP4-039, se diseñaron varios análogos de nitróxido. La figura 40 muestra un esquema de diseños alternativos de análogos de nitróxido. El diseño puede abarcar uno o ambos de: modificación del grupo de direccionamiento para optimizar las propiedades similares a fármacos y/o la investigación de grupos alternativos que contienen nitróxido para mejorar su eficacia oxidante (por ejemplo y sin limitación, véanse Reid, D.A. et al. The synthesis of water soluble isoindoline nitroxides and a pronitroxide hydroxylamine hydrocloride UV-VIS probe for free radicals. Chem Comm. 1998, 17:1907-8; Iwabuchi, Y.J., Exploration and Exploitation of Synthetic Use of Oxoammonium Ions in Alcohol Oxidation. J. Synth. Org. Chem. Jpn. 2008, 66(11): 1076-84). La modificación del grupo de direccionamiento puede incluir el reemplazo de Boc por grupos protectores alternativos, tales como Ac (-C(O)CH3), Cbz (-C(O)O-Bn, en el que Bn es un grupo bencilo, o dialquilfosfatos. Los dialquilfosfatos incluyen -P(O)-Ph2, en el que Ph es un grupo fenilo. Otras modificaciones también incluyen el reemplazo isostérico del grupo alqueno dentro del grupo de direccionamiento, tal como por un grupo ciclopropano. El grupo que contiene nitróxido incluye TEMPO y TEMPOL, así como restos nitróxido alternativos, tales como TMIO (1,1,3,3-tetrametilisoindolin-2-iloxilo) o 1-Me-AZADO (1metil-2-azaadamantano-N-oxilo). A continuación se proporcionan protocolos de síntesis de estos restos nitróxido alternativos.
La figura 41 muestra un protocolo de síntesis que puede usarse para producir diversos diseños alternativos de análogos de nitróxido, incluyendo JP4-039, compuestos según la fórmula 2, compuestos según la fórmula 3, y otros análogos. Se ha descrito la síntesis específica de JP4-039 anteriormente en el ejemplo 8. Se prepararon JP4-039 y sus análogos mediante un método eficaz para la síntesis asimétrica de aminas alílicas, desarrollado previamente en este laboratorio (Wipf P. & Pierce J.G. Expedient Synthesis of the α-C-Glycoside Analogue of the Immunostimulant Galactosylceramide (KRN7000), Org. Lett. 2006, 8(15):3375-8). Una etapa clave en la figura 41 incluye el uso de la metodología del zirconio para producir una amina alílica diastereomérica (7). Esta metodología incluye la hidrozirconación del alquino (5) con Cp2ZrHCl, transmetalación para dar Me3Al y la adición a la N-tBu-sulfinil-amina (3). La ciclopropanación de Smith del alqueno (8b) con Zn(CH2I)2 es otra etapa clave en la figura 41. En esta última etapa, la estereoquímica alrededor del anillo de ciclopropano ha de determinarse tras la reacción.
Se logró la síntesis de los compuestos (10a, JP4-039), (10b), (10c), (14a) y (14b) (mostrado en la figura 41) según lo siguiente.
(R,E)-2-Metil-N-(3-metilbutiliden)propano-2-sulfinamida (3). La síntesis del compuesto del título ya se ha descrito en el ejemplo 8 (compuesto 1).
(But-3-iniloxi)(terc-butil)difenilsilano (5). La síntesis del compuesto del título ya se ha descrito en el ejemplo 8 (compuesto 2).
Clorhidrato de (S,E)-8-(terc-butildifenilsililoxi)-2-metiloct-5-en-4-amina (7). La síntesis del compuesto del título ya se ha descrito en el ejemplo 8 (compuesto 3).
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(S,E)-8-(terc-Butildifenilsililoxi)-2-metiloct-5-en-4-ilcarbamato de terc-butilo (8a). La síntesis del compuesto del título ya se ha descrito en el ejemplo 8 (compuesto 4).
(S,E)-8-(terc-Butildifenilsililoxi)-2-metiloct-5-en-4-ilcarbamato de bencilo (8b). A una mezcla de la amina 7 (1,50 g, 3,79 mmol) en THF seco (15 ml) se le añadieron Et3N (1,65 ml, 11,75 mmol), y entonces una disolución de cloroformiato de bencilo (CbzCl, 0,59 ml, 4,17 mmol) en THF seco (4 ml) a 0ºC. Se permitió que se calentase la suspensión blanca resultante hasta ta y se agitó durante 5 h, entonces se diluyó con DCM y agua. Se extrajo la fase acuosa con DCM (2x), y se lavaron las fases orgánicas combinadas con HCl al 10% y NaHCO3 sat., se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron a vacío. La cromatografía ultrarrápida (SiO2, 8:2, hexanos/EtOAc) proporcionó 1,45 g (72%) del compuesto del título como un aceite amarillo. 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,75-7,65 (m, 4 H), 7,50-7,28 (m, 11 H), 5,70-5,55 (m, 1 H), 5,40 (dd, 1H, J = 15,4, 6,2 Hz), 5,11 (s, 2 H), 4,58 (m, 1 H), 4,21 (m, 1 H), 3,71 (t, 2 H, J = 6,6 Hz), 2,30 (q, 2 H, J = 6,6 Hz), 1,67 (m, 1 H), 1,40-1,22 (m, 2 H), 1,07 (s, 9 H), 0,92 (m, 6 H); EMAR (ESI) m/z calculado para C33H43NO3SiNa 552,2910, hallado 552,2930.
Amida (S,E)-N-(8-(terc-butildifenilsililoxi)-2-metiloct-5-en-4-il)-P,P-difenilfosfínica (8c). A una disolución de la amina 7 (400 mg, 1,01 mmol) en DCM seco (7 ml) se le añadieron Et3N (0,44 ml, 3,13 mmol), y entonces una disolución de cloruro difenilfosfínico (Ph2POCl, 0,22 ml, 1,11 mmol) en DCM seco (3 ml) a 0ºC. Tras agitarse a 0ºC durante 15 min, se permitió que se calentase la mezcla de reacción hasta ta y se agitó durante 4 h, entonces se diluyó con DCM y HCl al 10%. Se extrajo la fase acuosa con DCM y se lavaron las fases orgánicas combinadas con NaHCO3 sat., se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron a vacío para proporcionar 720 mg del compuesto del título en bruto como un aceite solidificado de color amarillo pálido, que se usó durante la siguiente etapa sin purificación adicional.
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(S,E)-8-Hidroxi-2-metiloct-5-en-4-ilcarbamato de terc-butilo (9a). La síntesis del compuesto del título ya se ha descrito en el ejemplo 8 (compuesto 5).
(S,E)-8-hidroxi-2-metiloct-5-en-4-ilcarbamato de bencilo (9b). A una disolución del alcohol protegido con TBDPS 8b (584 mg, 1,10 mmol, en bruto) en THF seco (9 ml) a 0ºC se le añadió TBAF (1,0 M / THF, 1,38 ml, 1,38 mmol), y se permitió que se calentase la mezcla de reacción hasta ta mientras se agitaba bajo argón durante 3,5 h, entonces se extinguió con NH4Cl ac. sat. y se diluyó con EtOAc. Se separó la fase acuosa y se extrajo con EtOAc. Se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron a vacío. La cromatografía ultrarrápida (SiO2, 5:5, hexanos/EtOAc) proporcionó 194 mg (60%, 2 etapas) del compuesto del título como un aceite incoloro. [α]D23 -6,4 (c 1,0, DCM); 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,20-7,40 (m, 5 H), 5,65-5,49 (m, 1 H), 5,44 (dd, 1 H, J = 15,3, 6,6 Hz), 5,09 (s, 2 H), 4,67 (sa, 1 H), 4,16 (m, 1 H), 3,63 (sa, 2 H), 2,28 (q, 2 H, J = 6,0 Hz), 1,82 (sa, 1 H), 1,65 (m, 1 H), 1,40-1,25 (m, 2 H), 0,80-1,00 (m, 6 H); EMAR (ESI) m/z calculado para C17H25NO3Na 314,1732, hallado 314,1739.
Amida (S,E)-N-(8-hidroxi-2-metiloct-5-en-4-il)-P,P-difenilfosfínica (9c). A una disolución del alcohol protegido con TBDPS 8c (700 mg, 0,983 mmol, en bruto) en THF seco (8 ml) a 0ºC se le añadió TBAF (1,0 M / THF, 1,23 ml, 1,23 mmol), y se permitió que se calentase la mezcla de reacción hasta ta mientras se agitaba bajo argón. Como no se había completado tras 4 h, se le añadieron 0,75 eq. de TBAF (0,75 ml) a 0ºC. Se agitó la mezcla de reacción adicionalmente a ta durante 3 h, entonces se extinguió con NH4Cl ac. sat. y se diluyó con EtOAc. Se separó la fase acuosa y se extrajo con EtOAc. Se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron a vacío. La cromatografía ultrarrápida (SiO2, 95:5, EtOAc/MeOH) proporcionó 272 mg (77%, 2 etapas) del compuesto del título como un sólido blanco. p.f. 124,0-124,2ºC; [α]D23 -12,1 (c 1,0, DCM); 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,00-7,83 (m, 4 H), 7,58-7,35 (m, 6 H), 5,52 (dd, 1 H, J = 15,3, 9,0 Hz), 5,24 (m, 1 H), 4,58 (sa, 1 H), 3,78-3,47 (m, 3 H), 2,80 (dd ap., 1 H, J = 9,2, 3,8 Hz), 2,16 (m, 2 H), 1,68 (sa, 1 H), 1,55-1,43 (m, 1 H), 1,43-1,31 (m, 1 H), 0,87 (dd, 6 H, J = 8,6, 6,4 Hz); EMAR (ESI) m/z calculado para C21H28NO2PNa 380,1755, hallado 380,1725.
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TEMPO-4-il-(S,E)-5-(terc-butoxicarbonilamino)-7-metiloct-3-enamida (10a, JP4-039). La síntesis del compuesto del 55 título ya se ha descrito en el ejemplo 8 (compuesto 7).
TEMPO-4-il-(S,E)-5-(benciloxicarbonilamino)-7-metiloct-3-enamida (10b). A una disolución del alcohol 9b (158 mg,
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0,543 mmol) en acetona (5 ml) a 0ºC se le añadió lentamente una disolución recién preparada de reactivo de Jones (2,5 M, 0,54 ml, 1,358 mmol). Se agitó la suspensión negra resultante a 0ºC durante 1 h, entonces se diluyó con Et2O y agua. Se separó la fase acuosa y se extrajo con Et2O (2x). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con agua (2x) y salmuera (1x), se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a vacío para producir 166 mg (cuant.) del ácido en bruto como un aceite de color ligeramente amarillo, que se usó durante la siguiente etapa sin purificación adicional.
A una disolución de este ácido (160 mg, 0,524 mmol, en bruto) en DCM seco (7 ml) a 0ºC se le añadieron sucesivamente una disolución de 4-amino-TEMPO (139 mg, 0,786 mmol) en DCM seco (0,5 ml), DMAP (71 mg, 0,576 mmol), HOBt·H2O (78 mg, 0,576 mmol) y EDCI (123 mg, 0,629 mmol). Se agitó la disolución naranja resultante a ta bajo argón durante 15 h, y entonces se lavó con NH4Cl sat. Se separó la fase acuosa y se extrajo una vez con DCM, y se secaron (Na2SO4) las fases orgánicas combinadas, se filtraron y se concentraron a vacío. La cromatografía ultrarrápida (SiO2, de 5:5 a 3:7, hexanos/EtOAc) proporcionó 171 mg (71%) del compuesto del título como una espuma de color melocotón. p.f. 60,5ºC (punto de reblandecimiento: 44ºC); [α]D23 +26,5 (c 0,5, DCM); EM-EI m/z 458 ([M]+, 37), 281 (19), 154 (28), 124 (47), 91 (100), 84 (41); EMAR (EI) m/z calculado para C26H40N3O4 458,3019, hallado 458,3035.
TEMPO-4-il-(S,E)-5-(difenilfosforilamino)-7-metiloct-3-enamida (10c). A una disolución del alcohol 9c (166,5 mg, 0,466 mmol) en acetona (5 ml) a 0ºC se le añadió lentamente una disolución recién preparada de reactivo de Jones (2,5 M, 0,47 ml, 1,165 mmol). Se agitó la suspensión negra resultante a 0ºC durante 2 h, entonces se diluyó con Et2O y agua. Se separó la fase acuosa y se extrajo con Et2O (2x). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con agua (2x) y salmuera (1x), se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a vacío para producir 114 mg (66%) del ácido en bruto como una espuma blanca, que se usó durante la siguiente etapa sin purificación adicional.
A una disolución de este ácido (110 mg, 0,296 mmol, en bruto) en DCM seco (3,5 ml) a 0ºC se le añadieron sucesivamente una disolución de 4-amino-TEMPO (78,4 mg, 0,444 mmol) en DCM seco (0,5 ml), DMAP (40,2 mg, 0,326 mmol), HOBt·H2O (44,0 mg, 0,326 mmol) y EDCI (69,5 mg, 0,355 mmol). Se agitó la disolución naranja resultante a ta bajo argón durante 13 h, y entonces se lavó con NH4Cl sat. Se separó la fase acuosa y se extrajo una vez con DCM, y se secaron (Na2SO4) las fases orgánicas combinadas, se filtraron y se concentraron a vacío. La cromatografía ultrarrápida (SiO2, de EtOAc hasta 97:3, EtOAc/MeOH) proporcionó 91,2 mg (59%) del compuesto del título como un aceite naranja que solidificó muy lentamente a alto vacío. p.f. 168,0-168,8ºC (punto de
reblandecimiento: ∼75ºC); [α]D23 -14,1 (c 0,5, DCM); EM-EI m/z 525 ([M+H]+, 10), 371 (27), 218 (28), 201 (74), 124
(100), 91 (35), 84 (26); EMAR (EI) m/z calculado para C30H43N3O3P 524,3042, hallado 524,3040.
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(1S)-1-(2-(2-(terc-Butildifenilsililoxi)etil)ciclopropil)-3-metilbutilcarbamato de bencilo (11b). A una disolución de ZnEt2 (110 mg, 0,844 mmol) en DCM seco (2 ml) se le añadió DME (destilado, 0,088 ml, 844 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a ta durante 10 min bajo N2, entonces se enfrió hasta -20ºC y se le añadió CH2I2 (0,137 ml, 1,687 mmol) gota a gota a lo largo de 4 min. Tras agitar durante 10 min, se le añadió gota a gota una disolución del alqueno 8b (149 mg, 0,281 mmol) en DCM seco (1 ml) a lo largo de 5 min. Se permitió que se calentase la mezcla de reacción hasta ta mientras se agitaba. Tras 10 h, se extinguió la mezcla de reacción con NH4Cl ac. sat. y se diluyó con DCM y agua, se separó la fase acuosa y se extrajo con EtOAc. Se secaron (Na2SO4) las fases orgánicas combinadas, se filtraron y se concentraron a vacío. La cromatografía ultrarrápida (SiO2, 9:1, hexanos/Et2O) proporcionó 785 mg (68%) del compuesto del título como un aceite incoloro. El análisis de 1H-RMN mostró sólo 1 diastereómero (r.d. > 95:5). [α]D23 -26,8 (c 1,0, DCM); 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,73-7,66 (m, 4 H), 7,48-7,28 (m, 11 H), 5,13-4,96 (m, 2 H), 4,62 (da ap., 1 H, J = 8,4 Hz), 3,72 (ta ap., 2 H, J = 6,4 Hz), 3,21 (m, 1 H), 1,80-1,63 (m, 1 H), 1,60-1,25 (m, 4 H), 1,08 (s, 9 H), 0,92 (d ap., 6 H, J = 6,3 Hz), 0,79 (m, 1 H), 0,51 (m, 1 H), 0,40 (m, 1 H), 0,30 (m, 1 H); EMAR (ESI) m/z calculado para C34H45NO3SiNa 566,3066, hallado 566,3103.
(1S)-1-(2-(2-(Terc-butildifenilsililoxi)etil)ciclopropil)-3-metilbutan-1-amina (12). Se purgó un matraz que contenía una disolución de la amina protegida con Cbz 11b (460 mg, 0,846 mmol) en una mezcla de MeOH/EtOAc 5:1 (12 ml) y se llenó 3 veces con argón, entonces se le añadió Pd al 10%/C (50 mg). Se purgó el matraz y se llenó 3 veces con H2, y se agitó la suspensión negra resultante a ta bajo H2 (1 atm). Puesto que la reacción no se completó tras 3 h, se le añadió una cantidad adicional de Pd al 10%/C (30 mg) y se continuó con la agitación bajo H2 durante 5 h. Entonces se filtró la mezcla de reacción a través de un lecho de Celite, se lavó el Celite con MeOH y AcOEt, y se concentró la disolución a vacío para producir 317 mg (92%) del compuesto del título en bruto como un aceite de color amarillo pálido, que se usó durante la siguiente etapa sin purificación adicional.
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(1S)-1-(2-(2-(terc-Butildifenilsililoxi)etil)ciclopropil)-3-metilbutilcarbamato de terc-butilo (11a). A una disolución de la amina 12 (309 mg, 0,755 mmol) en DCM seco (12 ml) se le añadió Et3N (0,21 ml, 0,153 mmol) y entonces Boc2O (183 mg, 0,830 mmol) a 0ºC. Se agitó la mezcla de reacción a ta bajo N2 durante 28 h. Se extinguió la reacción con NH4Cl ac. sat. y se extrajo la fase acuosa con DCM. Se secaron (Na2SO4) las fases orgánicas combinadas, se filtraron y se concentraron a vacío para producir 471 mg del compuesto del título en bruto como un aceite incoloro, que se usó durante la siguiente etapa sin purificación adicional.
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(1S)-1-(2-(2-Hidroxietil)ciclopropil)-3-metilbutilcarbamato de terc-butilo (13a). A una disolución del alcohol protegido con TBDPS en bruto 11a (464 mg, 0,742 mmol) en THF seco (6 ml) a 0ºC se le añadió TBAF (1,0 M / THF, 0,93 ml, 0,927 mmol), y se permitió que se calentase la mezcla de reacción hasta ta mientras se agitaba bajo N2. Puesto que la CCF mostró reacción incompleta tras 5 h, se le añadieron 0,75 eq. de TBAF (0,56 ml). Tras 9 h, se extinguió la mezcla de reacción con NH4Cl ac. sat. y se diluyó con EtOAc. Se separó la fase acuosa y se extrajo con EtOAc. Se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a vacío. La cromatografía ultrarrápida (SiO2, 5:5, hexanos/EtOAc) proporcionó 177 mg (88%) del compuesto del título como un aceite incoloro que solidificó a alto vacío para dar un polvo blanco. p.f. 49,8-50,2ºC; [α]D22 -30,8 (c 1,0, DCM); 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 4,50 (da ap., 1 H, J = 4,5 Hz), 3,66 (sa, 2 H), 2,94 (m, 1 H), 2,36 (sa, 1 H), 1,82 (sa, 1 H), 1,71 (m, 1 H), 1,45 (s, 9 H), 1,39 (t, 2 H, J = 7,2 Hz), 1,01 (sa, 2 H), 0,90 (dd, 6 H, J = 10,2, 6,6 Hz), 0,50 (m, 1 H), 0,43-0,27 (m, 2 H); EMAR (ESI) m/z calculado para C15H29NO3Na 294,2045, hallado 294,2064.
(1S)-1-(2-(2-Hidroxietil)ciclopropil)-3-metilbutilcarbamato de bencilo (13b). A una disolución del alcohol protegido con TBDPS 11b (320 mg, 0,588 mmol) en THF seco (5 ml) a 0ºC se le añadió TBAF (1,0M / THF, 0,74 ml, 0,735 mmol), y se permitió que se calentase la mezcla de reacción hasta ta mientras se agitaba bajo argón durante 7 h, entonces se extinguió con NH4Cl ac. sat. y se diluyó con EtOAc. Se separó la fase acuosa y se extrajo con EtOAc. Se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a vacío. La cromatografía ultrarrápida (SiO2, 5:5, hexanos/EtOAc) proporcionó 166 mg (92%) del compuesto del título como un aceite incoloro. [α]D23 -21,6 (c 1,0, DCM); 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,42-7,28 (m, 5 H), 5,10 (m, 2 H), 4,76 (da ap., 1 H, J = 5,7 Hz), 3,63 (sa, 2 H), 3,04 (m, 1 H), 2,12-1,98 (sa, 1 H), 1,83-1,62 (m, 2 H), 1,42 (t, 2 H, J = 7,0 Hz), 1,16-0,95 (m, 2 H), 0,90 (t ap., 6 H, J = 7,0 Hz), 0,53 (sept, 1 H, J = 4,3 Hz), 0,42 (dt, 1 H, J = 8,4, 4,5 Hz), 0,34 (dt, 1 H, J = 8,4, 5,0 Hz); EMAR (ESI) m/z calculado para C18H27NO3Na 328,1889, hallado 328,1860.
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TEMPO-4-il-2-(2-((S)-1-(terc-butoxicarbonilamino)-3-metilbutil)ciclopropil)acetamida (14a). A una disolución del alcohol 13a (130 mg, 0,477 mmol) en acetona (5 ml) a 0ºC se le añadió lentamente una disolución de reactivo de Jones (2,5 M, 0,48 ml, 1,194 mmol). Se agitó la suspensión negra resultante a 0ºC durante 1 h, entonces se diluyó con Et2O y agua. Se separó la fase acuosa y se extrajo con Et2O (2x). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con agua (2x) y salmuera (1x), se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a vacío para producir 133 mg (97%) del compuesto del título en bruto como un aceite incoloro, que se usó durante la siguiente etapa sin purificación adicional.
A una disolución de este ácido (127,6 mg, 0,447 mmol, en bruto) en DCM seco (5,5 ml) a 0ºC se le añadieron sucesivamente una disolución de 4-amino-TEMPO (118,4 mg, 0,671 mmol) en DCM seco (0,5 ml), DMAP (60,7 mg, 0,492 mmol), HOBt·H2O (66,4 mg, 0,492 mmol) y EDCI (105,0 mg, 0,536 mmol). Se agitó la disolución naranja resultante a ta bajo argón durante 15 h, y entonces se lavó con NH4Cl sat. Se separó la fase acuosa y se extrajo una vez con DCM, y se secaron (Na2SO4) las fases orgánicas combinadas, se filtraron y se concentraron a vacío. La cromatografía ultrarrápida (SiO2, de 5:5 a 3:7, hexanos/EtOAc) proporcionó 150,0 mg (76%) del compuesto del título como una espuma de color melocotón. p.f. 139,5ºC; [α]D23 -15,7 (c 0,5, DCM); EM-EI m/z 438 ([M]+, 6), 252 (57), 140 (67), 124 (80), 91 (48), 84 (59), 57 (100); EMAR (EI) m/z calculado para C24H44N3O4 438,3332, hallado 438,3352.
TEMPO-4-il-2-(2-((S)-1-(benciloxicarbonilamino)-3-metilbutil)ciclopropil)acetamida (14b). A una disolución del alcohol 13b (110,5 mg, 0,362 mmol) en acetona (5 ml) a 0ºC se le añadió lentamente una disolución de reactivo de Jones (2,5 M, 0,36 ml, 0,904 mmol). Se agitó la suspensión negra resultante a 0ºC durante 1 h, entonces se diluyó con Et2O y agua. Se separó la fase acuosa y se extrajo con Et2O (2x). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con agua (2x) y salmuera (1x), se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a vacío para producir 113,5 mg (98%)
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del compuesto del título en bruto como un aceite incoloro, que se usó durante la siguiente etapa sin purificación adicional.
A una disolución de este ácido (110 mg, 0,344 mmol, en bruto) en DCM seco (4,5 ml) a 0ºC se le añadieron sucesivamente una disolución de 4-amino-TEMPO (91,2 mg, 0,517 mmol) en DCM seco (0,5 ml), DMAP (46,7 mg, 0,379 mmol), HOBt·H2O (51,2 mg, 0,379 mmol) y EDCI (80,8 mg, 0,413 mmol). Se agitó la disolución naranja resultante a ta bajo argón durante 18 h, y entonces se lavó con NH4Cl sat. Se separó la fase acuosa y se extrajo una vez con DCM, y se secaron (Na2SO4) las fases orgánicas combinadas, se filtraron y se concentraron a vacío. La cromatografía ultrarrápida (SiO2, 4:6, hexanos/EtOAc) proporcionó 123 mg (75%) del compuesto del título como una espuma de color melocotón. p.f. 51,8ºC (punto de reblandecimiento: 44ºC); [α]D23 -15,3 (c 0,5, DCM); EM-EI m/z 472 ([M]+, 42), 415 (58), 322 (43), 168 (47), 140 (46), 124 (75), 91 (100), 84 (53); EMAR (EI) m/z calculado para C27H42N3O4 472,3175, hallado 472,3165.
Ejemplo 20 – Síntesis de restos nitróxido alternativos
Se muestran esquemas para restos nitróxido alternativos, en los que la figura 42 muestra un protocolo de síntesis para 5-amino-1,1,3,3-tetrametilisoindolin-2-iloxilo (5-amino-TMIO) y la figura 43 muestra un protocolo de síntesis para 6-amino-1-metil-2-azaadamantano-N-oxilo (6-amino-1-Me-AZADO).
Se muestran los compuestos 5-amino-1,1,3,3-tetrametilisoindolin-2-iloxilo (5-amino-TMIO) y (20) en la figura 42 y se prepararon según lo siguiente.
Se describió previamente la síntesis de 5-amino-TMIO por Reid, D.A. et al. (The synthesis of water soluble isoindoline nitroxides and a pronitroxide hydroxylamine hydrochloride UV-VIS probe for free radicals. Chem Comm. 1998, 17,1907-8) y las referencias citadas en ese documento.
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2-Bencil-1,1,3,3-tetrametilisoindolina (16). (Primera etapa: Org. Synth. 1998, 9, 649; segunda etapa: Griffiths, P. G. et al. Synthesis of the radical scavenger 1,1,3,3-tetramethylsoindolin-2-yloxyl. Aust. J. Chem. 1983, 36, 397-401). Se purgó un matraz de fondo redondo, de tres bocas, de 250 ml, secado en horno, con nitrógeno, y se introdujeron virutas de magnesio (3,84 g, 156,5 mmol), que se cubrieron con Et2O seco (9 ml). Entonces se le añadió gota a gota una disolución de MeI (9,45 ml, 150,2 mmol) en Et2O seco (80 ml) a través de un embudo de goteo mientras se agitaba a lo largo de un periodo de 50 min. Entonces se agitó la mezcla de reacción resultante durante unos 30 min adicionales, y entonces se concentró mediante destilación lenta de disolvente hasta que la temperatura interna alcanzó los 80ºC. Se permitió que se enfriase el residuo hasta 60ºC, y se le añadió gota a gota una disolución de Nbencilftalimida (6,00 g, 25,04 mmol) en tolueno seco (76 ml) a través de un embudo de goteo con agitación a una velocidad suficiente como para mantener esta temperatura. Cuando se completó la adición, se destiló disolvente lentamente de la mezcla hasta que la temperatura alcanzó los 108-110ºC. Se puso a reflujo la mezcla de reacción a 110ºC durante 4 h, entonces se concentró de nuevo mediante destilación de disolvente adicional. Entonces se enfrió y se diluyó con hexanos (se volvió de color púrpura). Se filtró la suspensión espesa resultante a través de Celite y se lavó con hexanos. El filtrado amarillo combinado se volvió de color púrpura rojizo oscuro tras estar en reposo al aire durante la noche. Entonces se concentró a vacío. Se hizo pasar el residuo púrpura resultante a través de una columna corta de alúmina básica (grado I, 70-230 de malla), eluyendo con hexanos (∼1 l), para proporcionar 2,585 g (39%) del compuesto del título como un aceite incoloro que solidificó para dar un sólido blanco. p.f. 61,0-61,4ºC. 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,48 (d ap., 2 H, J = 7,2 Hz), 7,34-7,19 (m, 5 H), 7,18-7,11 (m, 2 H), 4,00 (s, 2 H), 1,31 (s, 12 H); EMAR (EI) m/z calculado para C19H23N 265,1830, hallado 265,1824.
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1,1,3,3-Tetrametilisoindolina (17). (Griffiths, P. G. et al. Synthesis of the radical scavenger 1,1,3,3tetramethylsoindolin-2-yloxyl. Aust. J. Chem. 1983, 36, 397-401; Chan, K. S. et al. Reactions of nitroxides with metalloporphyrin alkyls bearing beta hidrogens: aliphatic carbon-carbon bond activation by metal centered radicals. J. Organomet. Chem. 2008, 693, 399-407). Se disolvió la bencil-amina protegida 16 (1,864 g, 7,02 mmol) en AcOH (34 ml) en un matraz Parr, y se le añadió Pd al 10%/C (169,5 mg). (Se dividió la reacción en 3 lotes). Se colocó el matraz en un reactor de alta presión. Se cargó el reactor con H2 y se purgó durante 5 ciclos y se presurizó finalmente con H2 a 4 bares (60 psi). Tras agitar a ta durante 3 h, se filtró la mezcla de reacción a través de Celite, y se eliminó
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el disolvente a vacío. Se disolvió el residuo resultante en agua (5 ml) y se neutralizó la disolución con NaOH 2,5 N (pH 11,5), y se extrajo con Et2O (3 x 50 ml). Se secaron (Na2SO4) las fases orgánicas combinadas, se filtraron y se concentraron a vacío para producir 1,165 g (95%) del compuesto del título en bruto como cristales de color ligeramente amarillo. p.f. 36,0-36,5ºC. 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,30-7,23 (m, 2 H), 7,18-7,11 (m, 2 H), 1,86 (sa, 1 H), 1,48 (s, 12 H).
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1,1,3,3-Tetrametilisoindolin-2-iloxilo (18). (Griffiths, P. G. et al. Synthesis of the radical scavenger 1,1,3,3tetramethylsoindolin-2-yloxyl. Aust. J. Chem. 1983, 36, 397-401; Chan, K. S. et al. Reactions of nitroxides with metalloporphyrin alkyls bearing beta hidrogens: aliphatic carbon-carbon bond activation by metal centered radicals. J. Organomet. Chem. 2008, 693, 399-407). A una disolución de la amina 17 (1,46 g, 8,33 mmol) en una mezcla 14:1 de MeOH/MeCN (16,6 ml) se le añadieron sucesivamente NaHCO3 (560 mg, 6,67 mmol), Na2WO4·2H2O (83,3 mg, 0,25 mmol) y H2O2 ac. al 30% (3,12 ml, 27,50 mmol). Se agitó suspensión resultante a ta. Tras 18 h, se formó una suspensión de color amarillo brillante y se le añadió H2O2 ac. al 30% (3,00 ml, 26,44 mmol). Se agitó la mezcla de reacción durante 2 días, entonces se diluyó con agua y se extrajo con hexanos (2x). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con H2SO4 1 M y salmuera, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a vacío para producir 1,55 g (98% en bruto) del compuesto del título como un polvo cristalino amarillo, que se usó durante la siguiente etapa sin purificación adicional. p.f. 122-125ºC (punto de reblandecimiento: 108ºC); EMAR (EI) m/z calculado para C12H17NO 191,1310, hallado 191,1306.
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5-Nitro-1,1,3,3-tetrametilisoindolin-2-iloxilo (19). (Bolton, R. et al. An EPR and NMR study of some tetramethylisoindolin-2-yloxyl free radicals. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 1993, 2049-52). Se le añadió gota a gota H2SO4 conc. (13,5 ml) a 18 (1,345 g, 7,07 mmol) enfriado en un baño de hielo-agua, formándose una disolución de color rojo oscuro que se calentó entonces hasta 60ºC durante 15 min y entonces se enfrió hasta 0ºC. Se le añadió gota a gota HNO3 conc. (0,90 ml, 19,09 mmol). Cuando la reacción pareció ser completa, se calentó la disolución de color naranja amarillento a 100ºC durante 10 min, volviéndose de color naranja rojizo. Tras enfriar hasta ta, se neutralizó la mezcla de reacción mediante la adición cuidadosa a NaOH 2,5 N enfriado con hielo (30 ml). Se extrajo esta fase acuosa con Et2O hasta que se volvió incolora y se secaron (Na2SO4) las fases orgánicas combinadas, se filtraron y se concentraron a vacío para producir 1,64 g (98%) del compuesto del título en bruto como un polvo de color naranja amarillento, que se usó durante la siguiente etapa sin purificación adicional.
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5-Amino-1,1,3,3-tetrametilisoindolin-2-iloxilo (5-amino-TMIO). (Primera etapa: Reid, D.A. et al. The synthesis of water soluble isoindoline nitroxides and a pronitroxide hydroxylamine hydrochloride UV-VIS probe for free radicals. Chem Comm. 1998, 17,1907-8; Giroud, A. M. y Rassat, A. Nitroxides LXXX: syntheses de mono et biradicaux nitroxydes dérivés de l’isoindoline. Bull. Soc. Chim. Fr. 1979, II, 48-55; segunda etapa: Keana, J. F. W. y Lee, T. D. Versatile synthesis of doxyl spin labels bypassing the usual ketone precursors. J. Am. Chem. Soc. 1975, 97, 1273-4). Se purgó un matraz que contenía una disolución de 19 (1,50 g, 6,38 mmol, en bruto) en MeOH (75 ml) y se llenó con argón, entonces se le añadió Pd al 10%/C (150 mg). Se purgó el matraz y se llenó 3 veces con H2, y se agitó la suspensión negra resultante a ta bajo H2 (1 atm) durante 4 h. Entonces se filtró la mezcla de reacción a través de Celite, se lavó el Celite con MeOH, y se concentró la disolución a vacío para producir 1,38 g del compuesto del título en bruto como un sólido amarillo, que se usó durante la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H-RMN (300 MHz, CD3OD) δ 6,89 (d, 1 H, J = 8,1 Hz), 6,25 (dd, 1 H, J = 8,1, 2,1 Hz), 6,54 (d, 1 H, J = 2,1 Hz), 3,35 (s, 2 H), 1,34 (d ap., 12 H, J = 5,7 Hz).
A una disolución de hidroxilamina en bruto (1,38 g, 6,38 mmol) en MeOH (75 ml) se le añadió Cu(OAC)2.H2O (26 mg, 0,128 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a ta bajo aire durante 1,5 h, volviéndose de color marrón oscuro. Entonces se eliminó el disolvente a vacío, se llevó el residuo a CHCl3 y una pequeña cantidad de MeOH para
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disolver el material insoluble, y se lavó con agua. Se extrajo la fase acuosa dos veces con CHCl3, y se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a vacío. La cromatografía ultrarrápida (SiO2, de 6:4 a 5:5, hexanos/EtOAc) proporcionó 1,126 g (86%) del compuesto del título como un polvo amarillo. p.f. 192-194ºC (punto de reblandecimiento: 189ºC); EMAR (EI) m/z calculado para C12H17N2O 205,1341, hallado 205,1336.
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TMIO-5-il-(S,E)-5-(terc-butoxicarbonilamino)-7-metiloct-3-enamida (20). A una disolución del alcohol 9a (187 mg, 0,728 mmol, preparado según ejemplos anteriores) en acetona (7 ml) a 0ºC se le añadió lentamente una disolución de reactivo de Jones (2,5 M, 0,73 ml, 1,821 mmol). Se agitó la suspensión negra resultante a 0ºC durante 1 h, entonces se diluyó con Et2O y agua. Se separó la fase acuosa y se extrajo con Et2O (2x). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con agua (2x) y salmuera (1x), se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a vacío para producir 190 mg (96%) del compuesto del título en bruto como un aceite de color ligeramente amarillo, que se usó durante la siguiente etapa sin purificación adicional.
A una disolución de este ácido (187,4 mg, 0,691 mmol, en bruto) en DCM seco (8 ml) a 0ºC se le añadieron sucesivamente 5-amino-TMIO (212,6 mg, 1,036 mmol), DMAP (93,7 mg, 0,760 mmol), HOBt·H2O (102,6 mg, 0,760 mmol) y EDCI (162,1 mg, 0,829 mmol). Se agitó la disolución de color amarillento resultante a ta bajo argón durante 16 h, y entonces se lavó con NH4Cl sat. Se separó la fase acuosa y se extrajo una vez con DCM, y se lavaron las fases orgánicas combinadas dos veces con HCl 1 N y una vez con NaHCO3 sat., se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a vacío. La cromatografía ultrarrápida (SiO2, 6:4, hexanos/EtOAc) proporcionó 221,0 mg (70%) del compuesto del título como una espuma de color naranja pálido. p.f. 78-79ºC (punto de reblandecimiento: 70ºC); [α]D22 +72,2 (c 0,5, DCM); ESI-EM mlz 481 ([M+Na]+, 50), 939 ([2M+Na]+, 100).
El compuesto 6-amino-1-metil-2-azaadamantano-N-oxilo (6-amino-1-Me-AZADO) y (30) se muestran en la figura 43 y se prepararon según lo siguiente.
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2-Adamantanocarbonitrilo (triciclo[3.3.1.13,7]decano-2-carbonitrilo, 22). (Oldenziel, O. H. et al. 2-Adamantanocarbonitrile. Org. Synth. 1977, 57, 8; Rohde, J. J. et al. Discovery and Metabolic Stabilization of Potent and Selective 2-Amino-N-(adamant-2-yl) Acetamide 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 1 Inhibitors. J. Med. Chem. 2007, 50, 149-64). Se trató una disolución a 3-5ºC de 2-adamantanona (triciclo[3.3.1.13,7]decan-2-ona, 21) (21,0 g, 137 mmol), isocianuro de p-tolilsulfonilmetilo (TosMIC, 35,5 g, 178 mmol) y EtOH (14 ml, 233 mmol) en 1,2dimetoxietano (DME, 470 ml) con la adición el porciones de t-BuOK sólido (39,2 g, 342 mmol), manteniendo la temperatura interna por debajo de 10ºC. Tras la adición, se agitó la mezcla de reacción de suspensión espesa resultante a ta durante 30 min y entonces a 35-40ºC durante 30 min. Se filtró la mezcla de reacción heterogénea y se lavó el sólido con DME. Se concentró el filtrado a vacío, se cargó en una columna corta de Al2O3 (activada, neutra, Brockmann I, 150 de malla, 7 cm de grosor x 15 cm de altura), y se retiró por lavado con una mezcla 5:1 de hexanos/DCM (∼1,5 l). Se concentró la disolución a vacío para proporcionar 19,0 g (86%) del compuesto del título como un polvo blanco. 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 2,91 (s, 1 H), 2,23-2,08 (m, 4 H), 2,00-1,80 (m, 4 H), 1,80-1,66 (m, 6 H).
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Ácido 2-adamantanocarboxílico (23). (Rohde, J. J. et al. Discovery and Metabolic Stabilization of Potent and Selective 2-Amino-N-(adamant-2-yl) Acetamide 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 1 Inhibitors. J. Med. Chem. 2007, 50, 149-64). Se agitó una mezcla del nitrilo 22 (18,9 g, 117 mmol) en AcOH (56 ml) y HBr al 48% (224 ml) a 120ºC durante la noche. Se enfrió la mezcla de reacción a 4ºC, se dejó en reposo durante 4 h, entonces se filtró. Se lavó el sólido con agua y se secó a vacío sobre gel de sílice durante la noche, para producir 20,6 g (98%) del compuesto del título como cristales de color blanquecino. 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 12,09 (s, 1 H), 2,55-2,47
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(m, 1 H), 2,20 (sa, 2 H), 1,87-1,64 (m, 10 H), 1,60-1,50 (m, 2 H).
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5 Ácido 5,7-dibromo-2-adamantanocarboxílico (24). (Adaptado de Rohde, J. J. et al. Discovery and Metabolic Stabilization of Potent and Selective 2-Amino-N-(adamant-2-yl) Acetamide 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 1 Inhibitors. J. Med. Chem. 2007, 50, 149-64). Se trató en porciones una disolución a 0ºC con agitación vigorosa de AlBr3 (18,9 g, 69,6 mmol), BBr3 (2,40 g, 9,49 mmol) y Br2 (40 ml) con el ácido 23 (5,70 g, 31,6 mmol). Tras completarse la adición, se agitó la mezcla de reacción a 70ºC durante 48 h, entonces se enfrió en un baño de hielo,
10 y se extinguió cuidadosamente con bisulfito de sodio sat. Se continuó con la agitación a ta durante la noche. Se filtró la suspensión de color marrón pálido resultante, se lavó el sólido con agua y se secó durante la noche a vacío a 60ºC para producir 10,95 g (cuant.) del compuesto del título en bruto como un polvo beis. 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 12,56 (sa, 0,3 H), 2,85 (d ap., 2 H, J = 12,9 Hz), 2,75-2,55 (m, 2 H), 2,50-2,35 (m, 2 H), 2,35-2,10 (m, 7 H).
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Éster terc-butílico del ácido (5,7-dibromo-adamantan-2-il)-carbámico (25). Se trató una suspensión del ácido 24 (2,00 g, 5,92 mmol) en tolueno seco (30 ml) sucesivamente con Et3N (1,0 ml, 7,10 mmol) y difenilfosforilazida 20 (DPPA, 1,6 ml, 7,10 mmol). Se agitó la mezcla resultante a 85ºC durante 15 h. A un matraz separado que contenía una disolución de t-BuOK (1,35 g, 11,8 mmol) en THF seco (80 ml) a 0ºC se le añadió la disolución de isocianato gota a gota a través de un embudo de goteo. Se permitió que se calentase la mezcla de reacción resultante hasta ta a lo largo de 30 min, y entonces se extinguió con agua. Se eliminó el THF a vacío, y se diluyó el material resultante con EtOAc. Se lavó la fase orgánica con HCl 1 N, NaHCO3 sat. y salmuera, se secó (Na2SO4), se filtró y se
25 concentró a vacío. La cromatografía ultrarrápida (SiO2, de 95:5 a 8:2, hexanos/EtOAc) proporcionó 1,20 g (50%, 2 etapas) del compuesto del título como un polvo blanco. 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 4,68 (sa, 1 H), 3,76 (sa, 1 H), 2,87 (s, 2 H), 2,47-2,13 (m, 10 H), 1,46 (s, 9 H).
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Éster terc-butílico del ácido (7-metilen-biciclo[3.3.1]nonan-3-on-9-il)-carbámico (26). (Primera etapa: Rohde, J. J. et al. Discovery and Metabolic Stabilization of Potent and Selective 2-Amino-N-(adamant-2-yl) Acetamide 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 1 Inhibitors. J. Med. Chem. 2007, 50, 149-64). Se trató una disolución de 25 (125 mg, 0,305 mmol) en dioxano (0,80 ml) con NaOH 2 N (0,70 ml, 1,37 mmol) y se irradió con microondas (µw,
35 Biotage) durante 15 min a 180ºC. Se eliminó el dioxano a vacío. Se disolvió el residuo en DCM, se lavó con agua, se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró a vacío para proporcionar 82,5 mg de 9-amino-7-metilen-biciclo[3.3.1]nonan3-ona en bruto como un aceite amarillo, que se usó durante la siguiente etapa sin purificación adicional.
A una disolución de esta amina en bruto en DCM seco (5 ml) se le añadió Et3N (0,13 ml, 0,913 mmol) y entonces
40 Boc2O (73,8 mg, 0,335 mmol) a 0ºC. Se agitó la mezcla de reacción a ta bajo N2 durante 14 h. Se extinguió la reacción con NH4Cl ac. sat. y se extrajo la fase acuosa dos veces con DCM. Se secaron (Na2SO4) las fases orgánicas combinadas, se filtraron y se concentraron a vacío. La cromatografía ultrarrápida (SiO2, 7:3, hexanos/EtOAc) proporcionó 48,0 mg (59%, 2 etapas) del compuesto del título como un polvo blanco. 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 4,93 (sa, 0,25 H), 4,84 (s, 2 H), 4,81 (sa, 0,75 H), 4,12 (sa, 0,25 H), 3,91 (da ap., 0,75 H, J = 3,6
45 Hz), 2,64-2,37 (m, 6 H), 2,37-2,23 (m, 3,25 H), 2,17 (da ap., 0,75 H, J = 13,8 Hz), 1,48 y 1,46 (2 s, 9 H).
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Éster terc-butílico del ácido (7-metilen-biciclo[3.3.1]nonan-3-ona-oxima-9-il)-carbámico (27). A una disolución de la cetona 26 (137 mg, 0,515 mmol) en piridina seca (1 ml) se le añadió NH2OH·HCl (109 mg, 1,54 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a ta bajo argón durante 23 h. Entonces se eliminó el disolvente a vacío, y se diluyó el residuo con EtOAc y entonces se le añadió agua. Se separaron las fases y se extrajo la fase acuosa con EtOAc. Se lavaron 5 las fases orgánicas combinadas con CuSO4 ac. al 5% (3x), salmuera (1x), se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a vacío. La cromatografía ultrarrápida (SiO2, 4:6, hexanos/EtOAc) proporcionó 133 mg (92%) del compuesto del título como una goma incolora. 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,02 (sa, 0,6 H), 4,90 (sa, 0,25 H), 4,80 (d, 1 H, J= 2,1 Hz), 4,76 (sa, 0,75 H), 4,69 (d, 1 H, J = 2,1 Hz), 3,87 (sa, 1 H), 3,26 (d, 0,25 H, J = 16,8 Hz), 3,11 (d, 0,75 H, J = 16,8 Hz), 2,55-2,48 (m, 4 H), 2,48-2,20 (m, 4 H), 2,16 (d ap., 0,25 H, J = 17,1 Hz), 2,04 (dd, 0,75 H, J =
10 17,1, 5,4 Hz), 1,47 (s, 9 H).
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Éster terc-butílico del ácido (1-yodometil-2-azaadamantan-6-il)-carbámico (28). A una mezcla de la oxima 27
15 (130 mg, 0,464 mmol) y MoO3 (94 mg, 0,649 mmol) en MeOH seco (4,6 ml) a 0ºC bajo argón se le añadió NaBH4 (179 mg, 4,64 mmol) en porciones. Se agitó la mezcla de reacción a 0ºC, y se le añadieron en porciones 2 cantidades adicionales de NaBH4 (179 mg, 4,64 mmol) tras 2,5 h y tras 5,5 h. Tras 7 h, se extinguió la mezcla de reacción de color marrón oscuro con acetona y entonces se filtró a través de Celite, y se enjuagó el Celite con acetona. Se concentró el filtrado a vacío. Se diluyó el residuo resultante con agua y se extrajo dos veces con EtOAc.
20 Se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera, se secaron (K2CO3), se filtraron y se concentraron a vacío para proporcionar 136 mg de la amina en bruto como un aceite amarillo, que se usó durante la siguiente etapa sin purificación adicional.
A una suspensión de esta amina en bruto en acetonitrilo seco (MeCN, 2,3 ml) a 0ºC bajo argón se le añadió I2
25 (117 mg, 0,462 mmol). Se permitió que agitase la mezcla de reacción a ta durante 4 h y entonces se extinguió con NaHCO3 sat. y Na2S2O3 sat. Se extrajo la mezcla resultante dos veces con DCM/CHCl3, y se secó (K2CO3) la fase orgánica, se filtró y se concentró a vacío. La cromatografía ultrarrápida (SiO2, de 95:5 a 9:1, DCM/MeOH) proporcionó 76,5 mg (42%) del compuesto del título como un aceite marrón. 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 4,83 (sa, 1 H), 3,77 (sa, 1 H), 3,30 (sa, 1 H), 3,24 (s ap., 2 H), 2,14 (sa ap., 2 H), 1,94 (da ap., 2 H, J = 13,5 Hz), 1,75 (m, 6 H),
30 1,46 (s, 9 H).
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Éster terc-butílico del ácido (1-metil-2-azaadamantano-N-oxil-6-il)-carbámico (29). Puede lograrse la desyodación de 35 la amina 28 tratando 28 con un agente reductor, tal como LiAlH4 o NaBH4, posiblemente en presencia de un catalizador, tal como InCl3, y en un disolvente aprótico polar tal como THF o MeCN.
Puede lograrse la oxidación de la amina resultante para proporcionar el nitróxido 29 correspondiente tratando dicha amina con H2O2 en presencia de una cantidad catalítica de Na2WO4·2H2O, en una mezcla de disolventes de MeOH y 40 H2O.
imagen97
6-Amino-1-metil-2-azaadamantano-N-oxilo (6-amino-1-Me-AZADO). Puede lograrse la escisión grupo protector Boc 45 tratando la amina protegida 29 con ácido trifluoroacético (TFA) en DCM, para proporcionar la amina libre 6-amino-1-Me-AZADO.
imagen98
imagen99

Claims (8)

  1. E09798808
    14-01-2015
    REIVINDICACIONES
    1. Compuesto que tiene la estructura:
    en laqueXes unode
    imagen1
    y
    imagen2
    imagen3
    15
    R1 es hidrógeno, alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, o un alquilo C1-C6 de cadena lineal o
    ramificada que comprende además un grupo fenilo (C6H5), que está no sustituido o está sustituido con
    metilo, hidroxilo o fluoro; R2 es hidrógeno, alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, R4 es hidrógeno,
    alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, o un alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada que comprende
    además un grupo fenilo (C6H5), que está no sustituido o está sustituido con metilo, hidroxilo o fluoro; R3 es
    20
    -NH-R5, -O-R5 o -CH2-R5, y R5 es un grupo que contiene -N-O., -N-OH o N=O; R es -C(O)-R6, -C(O)O-R6,
    o -P(O)-(R6)2, en los que R6 es alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada o alquilo C1-C6 de cadena lineal
    o ramificada que comprende además uno o más grupos fenilo (-C6H5) que están independientemente no
    sustituidos, o sustituidos con metilo, etilo, hidroxilo o fluoro.
    25
    2. Compuesto que tiene la estructura
    imagen4
    en laqueXes unode
    imagen5
    y
    60
    E09798808
    14-01-2015
    imagen6
    y
    5 R1 es hidrógeno, alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, R4 es hidrógeno, alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada, o un alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada que comprende además un grupo fenilo (C6H5), que está no sustituido o está sustituido con metilo, hidroxilo o fluoro; R3 es -NH-R5, -O-R5 o -CH2-R5, y R5 es un grupo que contiene -N-O., -N-OH o N=O; y R es -C(O)-R6, -C(O)O-R6, o -P(O)-(R6)2, en los que R6 es alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada o alquilo C1-C6 de cadena lineal o ramificada que
    10 comprende además uno o más grupos fenilo (-C6H5) que están independientemente no sustituidos, o sustituidos con metilo, etilo, hidroxilo o fluoro.
  2. 3.
    Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que R1, R2, R4 y R6 se eligen independientemente de hidrógeno, metilo, etilo, propilo, 2-propilo, butilo, t-butilo, pentilo y hexilo.
  3. 4.
    Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que cuando X es -CH=CR4-, R4 es hidrógeno, metilo o etilo.
    15
  4. 5. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que R5 es 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidin20 1-oxilo, 1-metil-2-azaadamantano-N-oxilo, o 1,1,3,3-tetrametilisoindolin-2-iloxilo.
  5. 6.
    Compuesto según la reivindicación 1, que tiene la estructura
  6. 7.
    Compuesto según la reivindicación 1, en el que X es
    imagen7
    imagen8
    y R3 es NH-R5.
    30 8. Compuesto según la reivindicación 1, en el que X es
    imagen9
    y R3 es -NH-R5.
  7. 9. Compuesto según la reivindicación 1, que tiene la estructura
    61
    imagen10
  8. 10. Compuesto según la reivindicación 1, que tiene la estructura
    imagen11
    62
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