CN101735336A - 低聚岩藻糖化糖胺聚糖及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了制备低聚岩藻糖化糖胺聚糖的方法，其是通过在水相介质中用第四周期过渡金属离子催化的过氧化物解聚法解聚岩藻糖化糖胺聚糖制备得到，该制备方法反应条件温和、重现性和稳定性好、裂解选择性高，产物质量均一可控。获得的低聚岩藻糖化糖胺聚糖以GalNAc作为还原性末端的聚糖分子数不低于80％，重均分子量为约6,000Da～20,000Da，PDI为1.0～2.0。

Description

低聚岩藻糖化糖胺聚糖及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体地说，涉及一种低聚岩藻糖化糖胺聚糖(dFG)及其制备方法，以及含有该低聚岩藻糖化糖胺聚糖的药物组合物。

背景技术

岩藻糖化糖胺聚糖(Fucosylated Glycosaminoglycan，Fucose-branchedGlycosamino-glycan或fucose-containing glycosaminoglycan，简称FG)，或称之为岩藻糖化硫酸软骨素(Fucosylated chondroitin sulfate，FCS)，是指一类从棘皮动物体壁或内脏中提取获得的，具有类似于硫酸软骨素主链结构，但具有侧链硫酸岩藻糖取代的糖胺聚糖衍生物(J Biol Chem，1988，263(34)：18176-83和J Biol Chem，1991，266(21)：13530-6)。

天然FG具有抗凝血活性(樊绘曾等，药学学报，1980，15：267)，此活性使之对于某些血栓性疾病具有潜在治疗作用，然而FG同时具有诱导血小板聚集活性(Jia-zeng Li等，Thronbosis and Haemostasis，1988，54(3)：435-9)，而血小板诱导活性严重影响了FG潜在治疗作用向实际临床应用的转化。近年来的研究资料显示，低分子量FG可能在保留一定强度的抗凝血活性的同时消除或避免原型多糖的血小板诱导活性(樊绘曾等，生物化学杂志，1993，9(2)：146-151；Toshio Imanari等，Thrombosis Research，1997，129：27-31)。

低分子量FG可以来自FG的分级处理，也可以来自FG解聚。分级处理所得低分子FG方法简单(樊绘曾等，生物化学杂志，1993，9(2)：146-151)，但由于天然FG中所含低聚组分较少，分级处理法制备低聚FG的得率较低而且资源浪费严重。

常用于糖胺聚糖解聚的酶法解聚、亚硝酸解聚方法均不适合于解聚FG，其原因在于：岩藻糖侧链的存在使得已知的糖胺聚糖内切酶均不能水解FG；FG中的氨基己糖均为乙酰氨基糖，无游离氨基或硫酸化氨基存在，因而不能被亚硝酸解聚。

H₂O₂法解聚FG已见于报道(Fan Hui-Zeng等，WO 90/08784；Ken-ichiroYoshida等，Tetrahedron Letters，1992，33(34)4959-62)。由于FG中存在多种不同类型的糖苷键，例如存在于主链的葡萄糖醛酸(GlcUA)β(1→3)糖苷键、乙酰氨基半乳糖(GalNAc)β(1→4)糖苷键以及存在于侧链的α-岩藻糖(Fuc)糖苷键等，常规H₂O₂解聚方法对这些糖苷键的选择性有限。非选择性裂解主链糖苷键可以形成具有不同的还原性末端的低聚FG产物，即同时存在较高含量的GlcUA及GalNAc末端，因而影响产物的均一性；而侧链糖苷键的裂解可以导致岩藻糖取代侧链的脱落。

此外，常规H₂O₂法解聚FG所需反应条件相对剧烈，其反应温度要求较高、反应时间较长，而其关键性缺陷在于，该反应的可控性和重复性较差。

因此，开发一种反应条件温和、重现性高、产物均一性好的制备低聚FG的方法对低聚FC的工业化生产具有重大意义。

发明内容

本发明的一个目的在于克服现有技术的不足，提供一种制备质量均一可控，制备重复性高的低聚岩藻糖化糖胺聚糖(Depolymerized fucose-containingglycosaminoglycan，简称为dFG或低聚FG)的方法。

本发明所述制备dFG的方法是在水相介质中采用含有第四周期过渡金属离子的催化剂，催化过氧化物解聚法解聚岩藻糖化糖胺聚糖(FG)，具体包括以下步骤：

1)在第四周期过渡金属离子的催化剂存在下，在水相介质中，加入过氧化物以解聚海参来源的岩藻糖化糖胺聚糖；

2)中止反应，收集和纯化所需分子量范围的低聚岩藻糖化糖胺聚糖。

步骤1)中，所述海参来源的岩藻糖化糖胺聚糖(FG)是指从棘皮动物门海参纲所述动物中提取制备的含有岩藻糖组分的酸性粘多糖。其结构特征是：在其单糖组成中，GlcUA(葡萄糖醛酸)和GalNAc(2-脱氧-2-氨基-N-乙酰基-半乳糖或其硫酸酯)以近于等摩尔比(1∶1±0.3)存在，且GlcUA与GalNAc分别以β1→3和β1→4糖苷键相互连接构成多糖主链，岩藻糖(Fuc)或其硫酸酯以侧链形式连接于主链，以摩尔比计，Fuc∶GalNAc比值范围可以是约0.5～2.5。FG主链结构单元可表示为式(I)：

式(I)中：-OR为羟基(-OH)、硫酸酯基(-OSO₃ ^-)、或为如式(II)所示的硫酸酯化岩藻糖基：

式(II)中：-OR为羟基(-OH)、硫酸酯基(-OSO₃ ^-)定义同上式。

来自不同海参种属/品种的FG的侧链岩藻糖基组成比例及其连接于主链位置方式可以存在差异；海参品种相同但组织来源不同或者提取方法差异也可能导致FG的单糖组成比例、侧链存在形式以及多糖硫酸化程度等方面的不同，但是这些差异均不涉及FG结构特征和糖苷键类型的本质变化，不影响本发明所述方法的有效实施和应用。因此，在本发明中，所述FC可来源于世界各地不同品种的海参，包括但不限于刺参、绿刺参、玉足海参、黑海参、黑乳海参、糙海参等。

步骤1)中，解聚是在水相介质中进行，采用金属离子作为催化剂催化过氧化物的解聚反应，以生成低聚FG。

所述过氧化物可以在反应体系中产生自由基，并通过自由基链式反应裂解FG糖苷键，进而形成所述dFG产物。这些过氧化物包括但不限于过氧乙酸、过氧化氢、3-氯-过苯甲酸、氢过氧化枯烯、过硫酸钠、过氧化苯甲酰以及它们的盐或酯，优选为过氧化氢。

所述FG在反应体系中的质量分数约为0.05％-15％，过氧化物在反应体系中的质量分数约为0.5％至约30％。FG的解聚反应过程中，过氧化物反应物可以在反应前一次性全部加入到反应体系中，也可以采用持续或断续性方式将过氧化物反应物逐步加入到反应体系中。本发明优选将过氧化物反应物按照可控速率的方式持续加入到反应体系中。

所述作为催化剂的金属离子为第四周期过渡金属离子，包括Cu⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Cr³⁺、Cr₂O₇ ^2-、Mn²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺等，这些金属离子可以单独使用，也可以相互组合作为复合催化剂使用。其中，优选的催化剂为Cu⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺，最优选为Cu²⁺。由于金属离子并非独立存在的化学试剂，实际使用的是这些金属离子的无机或有机盐。在反应体系中，所述金属离子的浓度范围可以为约1nmol/L～0.1mol/L，优选的浓度范围为10μmol/L～10mmol/L。

所述解聚反应过程的常规工艺参数为：温度范围为10℃～75℃；反应时间为20分钟～8小时；反应可以在常压或加压条件下进行；反应可以选择氮气、惰性气体保护下进行，也可以在常压条件下与大气环境相通进行。

反应结束时，可以向反应体系中加入螯合剂使之与金属离子催化剂螯合而抑制催化反应速度，继而通过冷却、有机溶剂沉淀等技术手段终止反应。螯合剂是指能与金属离子形成螯合物的物质，其包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、3-丙二胺四乙酸(PDTA)、三乙酸基氨(NTA)或它们的盐。本发明方法优选乙二胺四乙酸二钠或其水合物。反应产物沉淀法是直接或在进一步加入无机盐(如乙酸钾)的条件下加入有机溶剂使聚糖类物质从反应体系中析出的方法，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮等低碳醇/酮，其中优选为乙醇和丙酮。

反应产物dFG可以通过本领域已知方法纯化，例如通过透析法或超滤法去除小分子盐，通过凝胶层析或DEAE离子交换层析进一步纯化等，所得dFG产物还可以通过阳离子交换以制备成单盐形式，如钠盐、钾盐或钙盐等。所述透析去杂处理过程中，可根据目地dFG分子量大小要求选择适宜截留分子量的透析膜，优选截留分子量为3000Da。透析时间需根据特定处理条件确定，通常不少于6小时。dFG产物的成盐过程优选动态离子交换成盐法，其中可选择采用强酸性阳离子交换树脂。树脂柱预处理、样品上样与洗脱均可按常规方法进行。本发明方法中优选的样品上样质量分数为约2％～5％。

本发明方法可以显著改善过氧化物解聚FG的反应条件，即，采用相同过氧化物反应物和原型FG起始物制备相同或近似相等分子量的dFG时，在温度等反应条件近似的情况下，相对于直接过氧化物解聚法(即没有金属离子催化剂存在下的过氧化物解聚方法)，本发明方法可以提高反应速度，缩短反应时程；类似地，在控制反应时间的条件下，本发明方法可以显著降低反应所需温度，以至可以在室温条件下完成所需反应。

在dFG的重复制备过程中，在保持反应条件相同或近似的条件下，与直接氧化物解聚法相比，本发明方法所得产物的批次间差异显著降低。对于不同目标分子量的dFG制备而言，本发明方法可以便捷地通过改变反应条件而实现，而对于直接过氧化物解聚法，则改变反应条件后反应产物偏离预计结果的不确定性较为严重(所得dFG分子量与目标分子量的差异可达5％以上)。

本发明方法显著改善dFG制备的重复性和可控性，可能与催化剂所致活化能降低进而形成相对稳定的反应速率有关，也可能与反应温度降低或反应时程缩短等温和反应条件及其反应条件的可控性和稳定性改善有关。

对于相对纯净、均一的精制FG原料而言，相同反应条件下，本发明方法所得产物具有高度的重复性；但对于含有较多杂质成分的含FG“粗多糖”而言，解聚反应的稳定性与可控性仍有可能存在较大差异。本发明人现已发现，反应体系中存在一定离子强度的无机或有机盐可以提高解聚反应的稳定性。

为此，本发明还进一步提供提高和改善FG解聚反应可控性的方法，即，向金属离子催化的过氧化物解聚岩藻糖化糖胺聚糖的反应体系中加入一定浓度的无机和/或有机盐。所述无机和/或有机盐包括金属元素(如碱金属、碱土金属元素等)与卤素、有机酸等形成的盐，有机酸或无机酸与有机碱形成的盐，以及它们相互组合的复合盐，其中优选氯化钠、氯化钾、乙酸钠、三水合乙酸钠、乙酸钾。本发明方法中，用于改善解聚反应速度和反应可控性的无机和/或有机盐的优选的盐离子浓度为约0.1mmol/L至约1.0mol/L。盐离子改善反应条件的机制不能完全阐明，对于本发明方法而言，可能与其稳定反应物FG的构象有关。

本发明所述FG是来源于棘皮动物海参纲的岩藻糖化糖胺聚糖，其结构特征是存在约1∶1±0.3摩尔比的GlcUA和GalNAc(硫酸酯)以及不同摩尔比的岩藻糖(硫酸酯)。海参品种及其组织来源不同或提取方法的差异可导致FG的单糖组成比例、侧链存在形式以及多糖硫酸化程度等方面的不同，但这些差异均不涉及FG结构特征和糖苷键类型的本质变化，因此不影响本发明所述解聚方法的实施和应用。本发明所述FG的来源动物可选自但不局限于刺参、绿刺参、玉足海参、黑海参、黑乳海参、糙海参等。显然，本领域技术人员可以理解，对于产于世界各地的其它品种海参，其来源的符合上述结构特征的岩藻糖化糖胺聚糖均可以采用本发明所述方法解聚以获得所需的低聚FG产物，因此，本发明方法不受特定海参品种的限制。

本发明所得dFG产物的还原性末端可通过NMR法检测。NMR检测还可以方便地用于确认产物中Fuc/GalNAc组成比例。

比较直接过氧化物解聚与催化过氧化物解聚产物，本发明发现，催化过氧化物解聚法具有出人意料的糖苷键裂解选择性，其突出表现在所得dFG基本上以GalNAc为还原性末端(以末端数量计一般在80％乃至95％以上)而较少为GlcUA，此与直接过氧化物解聚产物存在相对高含量的还原性GlcUA末端有显著差别，表明催化过氧化物解聚法所得dFG具有更好的末端均一性，因而具有更好的质量均一性和可控性。

此外，比较FG解聚前后Fuc/GalNAc组成比例的变化可以判断侧链岩藻糖的裂解程度。本发明所述催化解聚过程中FG侧链岩藻糖几无裂解，FG与dFG中Fuc/GalNAc组成比例没有明显变化；而直接过氧化物解聚过程中，该比例可存在约5％左右的降低，这进一步证明本发明方法具有优越的糖苷键裂解的选择性。

由此，本发明的又一目的是提供一种低聚FG(dFG)，所述dFG通过本发明方法制备，其特征在于，所述dFG的还原性末端主要为GalNAc，通过核磁共振(NMR)技术检测可确认其组成比例不低于80％，相应地，所述dFG中，以GlcUA作为还原性末端的聚糖分子数少于20％。优选的本发明dFG中，以GalNAc为还原性末端的多糖分子数不少于90％。

dFG产物的分子量可采用高效凝胶色谱法检测。从保留FG血液学活性以及避免诱导血小板聚集活性考虑，以重均分子量计，本发明选择的dFG的分子量范围为约6,000～20,000Da，优选分子量范围为约10,000～15,000Da。

本发明所述dFG的多分散指数(PDI，重均分子量与数均分子量之比，Mw/Mn)一般介于1.0至2.0之间；对于优选的低聚FG，其PDI介于1.2至1.6之间。

本发明所述dFG可以是其药学上可接受的碱金属、碱土金属等的盐，例如钠盐、钾盐和钙盐等；类似地，本发明所述低聚FG也可以是其药学上可接受的碱性有机基团的酯。

本发明所述dFG具有确切的抗凝血活性，因此具有明确的药用潜力。dFG具有良好的水溶性，因此易于制备成溶液型制剂或其冻干制品。作为多糖类成分，其口服生物利用有限，因此优选制备成胃肠外给药剂型，其制剂制备可以按照本领域内熟知的技术方法进行。

本发明的又一目的是提供一种药用组合物，所述药用组合物包括本发明所述dFG以及药学上可接受的辅料。本发明所述dFG具有一定强度的抗凝活性，因此可以用于不同程度的血栓性疾病的预防和治疗，例如血栓形成性心血管疾病、血栓性脑血管病，肺静脉血栓、周围静脉血栓、深静脉血栓、周围性动脉血栓等。据此，本发明可提供所述组合物在治疗和预防心血管疾病的药物制备中的应用。

附图说明

图1为刺参FG及其降解产物dFG的HPGPC图谱；

图2为显示FG、dFG中Fuc/GalNA摩尔比(甲基信号积分面积比)的¹H NMR谱图；

图3A为dFG-2的¹H-¹H COSY谱图；

图3B为图3A 5.22ppm处的COSY谱图截面，显示还原性末端GalNAc和GlcUA之α-H的NMR信号。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，并不构成对本发明范围的限制。

实施例1金属离子催化的FG的过氧化物解聚

1.1材料：

FG：刺参来源的岩藻糖化糖胺聚糖，按文献方法(J Biol Chem，1991，266(21)：13530-6)提取制备。纯度98％(HPGPC，面积归一化法)，分子量(Mw)，69800。

H₂O₂，CH₃COONa·3H₂O，NaCl，NaOH，CuCl₂，FeCl₂，ZnCl₂等所用试剂：均为市售分析纯试剂。

1.2方法：

将四份刺参FG各5.0g溶解于圆底烧瓶内的180ml水中，45℃水浴保温并持续均匀搅拌，分别加入10ml纯水或20mmol/L浓度的氯化铜(Cu²⁺)溶液、氯化亚铁(Fe²⁺)溶液或氯化锌(Zn²⁺)溶液后，在2小时内，以15ml/h速率滴加10％的H₂O₂，反应过程中用1N的NaOH溶液控制pH值范围为7.2～7.8，上述条件下连续搅拌反应2～8小时。分别于反应开始后30min、1h、2h、6h、8h从各反应瓶取样5ml，加入15mg EDTA二钠盐并混匀，冰水冷却，加3倍体积的95％乙醇沉淀多糖，5ml 60％乙醇洗涤两遍，热空气吹干乙醇，10ml纯水定容，高效凝胶色谱(HPGPC)法检测产物分子量。

1.3结果：

在有无第四周期过渡金属离子催化剂存在下，过氧化氢对刺参FG的解聚效果见表1和附图1。

表1：FG过氧化解聚产物分子量检测

表1的结果表明，金属离子Cu²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺对FG的过氧化物解聚反应都具有明显的催化作用，解聚反应速率显著提升。通过比较这三种催化剂的催化效率可以看出，金属离子Cu²⁺的催化作用效率较高，其能在较短的时间内实现dFG的制备。

实施例2直接过氧化物解聚法与金属离子催化过氧化物解聚法所得dFG产物 的NMR图谱检测

2.1材料：

FG：刺参来源的岩藻糖化糖胺聚糖，按文献方法(J Biol Chem，1991，266(21)：13530-6)提取制备。纯度98％(HPGPC，面积归一化法)，分子量(Mw)，69800。

H₂O₂，CH₃COONa·3H₂O，NaCl，NaOH，Cu(CH3COO)₂·H₂O等所用试剂：均为市售分析纯试剂。

2.2方法：

制备dFG：将两份刺参FG各5.0g溶解于圆底烧瓶内的180ml水溶液中，分别以70℃和35℃水浴保温并持续均匀搅拌，然后分别加入10ml纯水或60mmol/L浓度的乙酸铜(Cu²⁺)溶液，继而在2小时内以10ml/h速率滴加10％的H₂O₂，反应过程中用1N的NaOH溶液控制pH值范围为7.2～7.8。上述条件下连续搅拌反应4小时后，分别向反应液中加入500mg EDTA二钠盐并混匀，冰水冷却，加3倍体积的95％乙醇沉淀多糖，离心得沉淀，100ml 60％乙醇洗涤两遍，离心得沉淀。沉淀溶解于150ml水中，经001×7型阳离子树脂交换成钠盐，然后以截留分子量3500Da的透析膜透析6小时，截留产物浓缩，冷冻干燥，分别得到3.23g(dFG-1，直接H₂O₂解聚产物)和3.52g(dFG-2，Cu²⁺催化的H₂O₂解聚产物)解聚样品。

理化检测：HPGPC检测分子量及分布；电导法检测-OSO₃ ^-/-COO^-摩尔比。

NMR检测：

仪器，AVANCE AV 400超导核磁共振谱仪(瑞士Bruker公司400MHz)；

溶剂，D₂O 99.9Atom％D(Norell公司)；

内标，trimethylsilyl-propionic acid(TSP-D4)；温度，45℃。

2.3结果

检测结果见下表2。NMR谱图见附图2。

表2：FG、dFG-1及dFG-2的理化检测与NMR检测

Mw：重均分子量；Mn：数均分子量；PDI：分子量多分散指数(PDI＝Mw/Mn)

^*还原性末端糖基摩尔比

通过比较直接过氧化氢解聚、催化过氧化氢解聚的反应条件(70℃/4h，35℃/4h)以及两种反应产物的分子量(约1.9kDa和约1.5kDa)可以看出，在Cu²⁺离子存在下，H₂O₂解聚FG的反应温度降低，效率更高。

从两种产物的理化及波谱分析结果可见，dFG-1和dFG-2的PDI值均较FG有所升高，此与粘多糖的过氧化物自由基解聚特征相符，而dFG-2的分散性相对较低。

从-OSO₃ ^-/-COO^-比值看，dFG-1的值与FG相比降低约4％，而dFG-2基本无变化。

根据NMR甲基信号积分计算的GalNAc/Fuc摩尔比(岩藻糖甲基峰信号出现在约1.3ppm，而乙酰氨基半乳糖的甲基峰位于约2.1ppm)可见，dFG-1较FG降低约9％，而dFG-2基本无变化。该结果表明，在Cu²⁺离子存在下，H₂O₂解聚FG的过程对岩藻糖侧链几乎无影响。显然，根据直接过氧化物解聚所得dFG-1的Fuc比例变化可以判断，直接过氧化解聚可导致岩藻糖硫酸酯侧链裂解。

从附图3A可以判断解聚产物还原性末端的GalNAc及GlcUA的摩尔比，其中非还原性末端以及多糖主链中的GalNAc及GlcUA的桥头氢均为β-构型，其NMR信号出现约4.4～4.6ppm之间，而还原性末端GalNAc及GlcUA各存在约半数的α-构型桥头氢。¹H NMR谱图中GalNAc及GlcUA的α-构型桥头氢均出现在约5.2～5.3ppm，两者难以区分，但与它们相关的H2峰的化学位移分别出现约4.2～4.5ppm和3.6～3.9ppm，因此可以从相关峰谱图中予以区分(原型FG因分子量较大，末端糖基数较少而难以获得足够强的区分信号)。

从附图3B推算可知，在dGAG-1和dGAG-2的还原性末端上的GalNAc与GlcUA的摩尔比分别为约1∶0.45和约1∶0.08，由此可见，Cu²⁺催化的过氧化氢解聚法对FG中的GalNAcβ(1→4)糖苷键具有更为优越的选择性。

本发明的研究结果表明，金属离子催化可以显著提高过氧化物解聚法对糖苷键的选择性。尽管有报道Cu²⁺离子催化在肝素的过氧化物解聚过程中也显示出一定的选择性，但其确切机制不明。根据解聚反应机制判断，本发明之催化解聚反应的选择性应与催化剂对自由基裂解不同类型糖苷键的活化能的影响有所差异有关。

本发明的研究结果还发现，对于FG的金属离子催化的过氧化物解聚法，dFG产物中以GalNAc为还原性末端的聚糖分子数通常可达80％以上，而本实施例中，以GalNAc为还原性末端的比例已达约95％。

实施例3直接过氧化物解聚法与金属离子催化过氧化物解聚法制备的dFG的 重复性和可控性比较

3.1材料：

同2.1

3.2方法：

直接过氧化氢法解聚FG：五份刺参FG各300g溶解于9L水中，60℃水浴保温并持续均匀搅拌，继而在2小时内以0.6L/h速率滴加15％的H₂O₂，反应过程中用1N的NaOH溶液控制pH值范围为7.2～7.8。该条件下连续搅拌反应6.5小时后，分别向反应液中加入3.0g EDTA二钠盐并混匀，冰水冷却，加3倍体积的95％乙醇沉淀多糖，离心得沉淀，用0.6L 60％乙醇洗涤两遍，然后溶于10L水中以截留分子量3000Da的改良纤维素膜超滤6小时，截留产物浓缩，冷冻干燥，计算产物得率并检测产物分子量及其分布。

Cu²⁺催化的过氧化氢法解聚FG：五份刺参FG各300g溶解于9L水中，45℃水浴保温并持续均匀搅拌，然后分别加入0.6L纯水或20mmol/L浓度的乙酸铜(Cu²⁺)溶液，继而在2小时内以0.6L/h速率滴加15％的H₂O₂，反应过程中用1N的NaOH溶液控制pH值范围为7.2～7.8。该条件下连续搅拌反应4小时后，分别向反应液中加入3.0g EDTA二钠盐并混匀，冰水冷却，加3倍体积的95％乙醇沉淀多糖，离心得沉淀，用0.6L 60％乙醇洗涤两遍，然后溶于10L水中以截留分子量3000Da的改良纤维素膜超滤6小时，截留产物浓缩，冷冻干燥，计算产物得率并检测产物分子量及其分布。

3.3结果

结果见表3。

表3：直接过氧化氢解聚FG及Cu²⁺催化过氧化氢解聚FG的产物

Mw：重均分子量，Mn：数均分子量，PDI：分子量多分散指数(PDI＝Mw/Mn)

RSD：相对标准偏差

表3的结果显示，直接过氧化氢解聚所得dFG产物分子量批间差异较大，其重均分子量和数均分子量的RSD值均大于5％；而催化过氧化氢解聚所得产物分子量批间差异较小，其重均分子量和数均分子量的RSD值均小于5％。而且，直接过氧化氢解聚所得产物Mw、Mn、PDI三项检测值的RSD均明显大于根据本发明的方法所得的产物，表明本发明的催化过氧化氢解聚法有更好的稳定性和可控性。

实施例4过渡金属离子催化过氧化物法解聚玉足海参粗多糖

4.1材料：

玉足海参：市售品种

试剂：同2.1

4.2方法：

玉足海参岩藻糖化糖胺聚糖粗糖的制备(参考文献方法制备)：取干燥玉足海参1000g，粉碎，装入水浴反应器中，加入10L水搅拌浸泡。加入固体氢氧化钾至浓度为1N，60℃恒温碱解反应100min。冷却后，6N盐酸调pH值为8.5，加入50g胰蛋白酶，50℃下保温搅拌反应3小时。冷却后，离心去沉淀。取上清液，用盐酸调节pH值为2.5，离心去除酸性蛋白沉淀。取上清液，加2N NaOH溶液中和，离心除沉淀。取上清液，加95％乙醇使其浓度达60％，4℃放置过夜。离心得沉淀，加10倍重量的水溶解，离心去除不溶物。取上清液，加醋酸钾搅拌全溶使其最终浓度为2.0mol/L，加95％乙醇至其最终体积浓度为30％，静置沉淀。离心得到的沉淀，依次用95％乙醇、无水乙醇洗涤，减压真空干燥，即得粗海参多糖8.1g。

Cu²⁺催化的过氧化氢法解聚FG：五份玉足海参粗多糖各5.0g溶解于圆底烧瓶内的190ml水中，35℃水浴保温并持续均匀搅拌，然后分别加入50mmol/L浓度的乙酸铜(Cu²⁺)溶液10ml，继而以10ml/h速率滴加10％的H₂O₂，反应过程中用1N的NaOH溶液控制pH值范围为7.2～7.8。上述条件下连续搅拌反应3小时后，分别向反应液中加入500mg EDTA二钠盐并混匀，冰水冷却，加3倍体积的95％乙醇沉淀多糖，离心得沉淀，用100ml 60％乙醇洗涤两遍，100ml水溶后，加醋酸钾搅拌全溶使其最终浓度为2.0mol/L，静置过夜，离心收集沉淀，100ml水溶，然后以截留分子量3500Da的透析膜透析8小时，截留产物冷冻干燥，计算产物得率并检测产物分子量及分布。

一定离子强度下的Cu²⁺催化的过氧化氢法解聚FG：五份玉足海参粗多糖各5.0g溶解于圆底烧瓶内含有12.21g三水合乙酸钠和6.02g氯化钠的190ml水中，35℃水浴保温并持续均匀搅拌，然后分别加入50mmol/L浓度的乙酸铜(Cu²⁺)溶液10ml，继而以10ml/h速率滴加10％的H₂O₂，反应过程中用1N的NaOH溶液控制pH值范围为7.2～7.8。上述条件下连续搅拌反应4小时后，分别向反应液中加入500mg EDTA二钠盐并混匀，冰水冷却，加3倍体积的95％乙醇沉淀多糖，离心得沉淀，100ml 60％乙醇洗涤两遍，100ml水溶后，加醋酸钾搅拌全溶使其最终浓度为2.0mol/L，静置过夜，离心收集沉淀，100ml水溶，然后以截留分子量3500Da的透析膜透析8小时，截留产物冷冻干燥，计算产物得率并检测产物分子量及分布。

4.3结果

结果见表4。

表4：玉足海参粗多糖的过氧化氢法解聚

Mw：重均分子量，Mn：数均分子量，PDI：分子量多分散指数(PDI＝Mw/Mn)

RSD：相对标准偏差

表4的结果显示，对于粗多糖而言，由于其杂质含量相对较高，此时采用金属离子催化的过氧化氢解聚，其所得产物仍然可能存在较大的批间差异，其主要表现在平均分子量存在明显差异(RSD＞10％)，而分散系数无显著差异。

向反应介质中添加一定强度的无机和/或有机离子，可显著改善解聚反应的重复性，尽管添加这些离子可能使反应速率发生一定程度的降低。无机和/或有机离子改善反应重复性的机制尚未完全清楚，一般认为可能与维持多糖稳定的构象有关。

本发明的相关研究表明，不同种属海参来源的非纯净FG的过氧化解聚反应中，对于所述无机和/或有机离子，适宜的阳离子强度约为0.1mol/L至1.0mol/L。

实施例5低聚岩藻糖化糖胺聚糖(dFG)的抗凝血活性

5.1材料

系列玉足海参dFG：Mw分别为25,380、18,050、14,350、11,450、8,800。

按实施例4中Cu²⁺催化的解聚法制备(解聚时间不同)；

试剂：兔贫血小板血浆，广州蕊特生物科技有限公司；

活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒(鞣花酸)：上海太阳生物技术有限公司

仪器：BICO-双信道血凝仪，Minivolt公司(意大利)。

5.2方法

准确称取各样品13.0mg，溶解定溶至100ml，然后稀释十倍。按试剂盒说明书的方法测各样品的APTT时间，扣除空白血浆的凝血时间，即是样品延长凝血的时间ΔAPTT(Sec)。

5.3结果

实验结果如表5所示。

表5：玉足海参来源的不同分子量的dFG对家兔血浆APTT时间的影响

表5中的结果显示，玉足海参来源的dFG可以显著延长兔血浆APTT时间，表明其能够抑制内源性凝血。

实施例6低聚岩藻糖化糖胺聚糖(dFG)的冻干制品

6.1材料

刺参dFG：Mw 14,350。按实施例3中Cu²⁺催化的解聚法制备。

20mmol/L pH 7.0磷酸缓冲液(PBS)

6.2处方

原辅料名称	用量
		dFG	50g
甘露糖	50g
		20mmol/L pH 7.0磷酸缓冲液(PBS)	500ml
共制成	1000支

6.3制备工艺

称取处方量的刺参dFG和甘露糖加20mmol/L pH 7.0PBS至全量，搅拌使溶解完全。加入0.6％的药用活性炭，搅拌20min；使用布氏漏斗及3.0μm微孔滤膜脱炭过滤。测中间体含量。合格后用0.22μm的微孔滤膜过滤；灌装于管制西林瓶中，每瓶0.5ml，灌装过程监测装量，半压塞，置冷冻干燥箱内，按设定的冻干曲线进行冻干，压塞，出箱，轧盖，目检合格，得成品。

冻干过程：将样品进箱，降隔板温至-40℃，保持3h；冷阱降至-50℃，开始抽真空至300μbar。开始升华：1h匀速升温至-30℃，保持2h；2h匀速升温至-20℃，保持8h，真空保持200～300μbar；再进行干燥：2h升温至-5℃，保持2h，真空保持150～200μbar；0.5h升温至10℃，保持2h，真空保持80～100μbar；0.5h升温至40℃，保持4h，真空抽至最低。

Claims (14)

1.一种制备低聚岩藻糖化糖胺聚糖的方法，包括在水相介质中催化剂存在下，催化过氧化物解聚岩藻糖化糖胺聚糖获得低聚岩藻糖化糖胺聚糖，其中：

所述岩藻糖化糖胺聚糖是指一类来源于棘皮动物糖胺聚糖或其衍生物，其结构特征为，所述FG中含有摩尔比范围为0.7～1.3的葡萄糖醛酸基和乙酰氨基半乳糖基或其硫酸酯，并且含有岩藻糖或其硫酸酯基，岩藻糖硫酸酯基与乙酰氨基半乳糖硫酸酯的摩尔比范围为0.5～2.5；

所述催化剂为含选自元素周期表第四周期过渡金属离子形成的催化剂；

所述低聚岩藻糖化糖胺聚糖是指其重均分子量为6000～20000Da范围内的岩藻糖化糖胺聚糖。

2.权利要求1所述的方法，其中所述含选自元素周期表第四周期过渡金属离子的催化剂为Cu⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Cr³⁺、Cr₂O₇ ^2-、Mn²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺形成的无机盐或有机盐，或其组合。

3.权利要求2所述的方法，其中所述金属离子是Cu²⁺。

4.权利要求2所述的方法，其中在反应体系中，所述催化剂的浓度为0.001mmol/L～100mmol/L。

5.权利要求1所述的方法，其中所述过氧化物选自过氧乙酸、过氧化氢、3-氯-过苯甲酸、氢过氧化枯烯、过硫酸钠、过氧化苯甲酰及其盐或酯。

6.权利要求5所述的方法，其中所述过氧化物为过氧化氢。

7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中在反应体系中，所述FG的质量分数为0.05％～15％，过氧化物的质量分数为0.5％～30％，所述催化剂的浓度为0.001mmol/L～100mmol/L。反应的温度范围为10℃～75℃。

8.权利要求1-6任一项所述的方法，其中在反应体系中进一步包括1mmol/L～1.0mol/L的无机和/或有机盐，所述无机和/或有机盐选自氯化钠、氯化钾、乙酸钠、乙酸钾及它们的水合物、以及其组合。

9.一种根据权利要求1方法制备的低聚岩藻糖化糖胺聚糖或其药学上可接受的盐和/或酯，其中所述低聚岩藻糖化糖胺聚糖含有摩尔比为1∶1±0.3的葡萄糖醛酸基和乙酰基半乳糖或其硫酸酯，并且含有岩藻糖或其硫酸酯基；所述低聚岩藻糖化糖胺聚糖中，以GalNAc作为还原性末端的聚糖分子数不低于80％，多分散指数为1.0～2.0。

10.权利要求9所述的低聚岩藻糖化糖胺聚糖或其药学上可接受的盐和/或酯，其中所述低聚岩藻糖化糖胺聚糖的重均分子量为10,000Da～15,000Da，多分散指数为1.2～1.6，其以GalNAc作为还原性末端的聚糖分子数不低于90％。

11.权利要求9-10任一项所述的低聚岩藻糖化糖胺聚糖或其药学上可接受的盐和/或酯，其中所述药学上可接受的盐为其碱金属和/或碱土金属盐。

12.权利要求11所述的低聚岩藻糖化糖胺聚糖或其药学上可接受的盐和/或酯，其中所述药学上可接受的盐为钠盐、钾盐和钙盐。

13.一种药物组合物，其特征在于，包括有效剂量的权利要求9所述的低聚岩藻糖化糖胺聚糖或其药学上可接受的盐和/或酯，以及药学上可接受的辅料。

14.权利要求9所述的低聚岩藻糖化糖胺聚糖或其药学上可接受的盐和/或酯在制备血栓性疾病的治疗和/或预防药物中的用途。

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