CN114249843A - 一种使用切向流超滤纯化低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种使用切向流超滤纯化低分子量岩藻糖化糖胺聚糖粗产物的方法，包括以下几个步骤：(1)粗产物用一定比例水溶解，过滤得到母液；(2)安装30kd膜包超滤系统并对母液进行超滤，收集超滤液；(3)使用3kd膜包超滤系统，超滤除掉小分子有机及无机物，取截留液；(4)使用10kd膜包超滤系统，超滤收集透过液；(5)最后3kd膜包超滤浓缩。本发明提供的超滤纯化低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的方法，具有高效快速、条件温和、可重复性高的优点，为工业化生产提供稳定、批间产品质量一致的超滤工艺。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域领域，更具体为低分子量岩藻糖化糖胺聚糖类化合物的纯化。
背景技术：
心脑血管疾病的发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高和并发症高，严重危害人类的健康和生活质量。血栓形成是心脑血管疾病的主要病因之一，包括抗凝药物在内的抗血栓药物是心脑血管疾病治疗的临床一线用药，在医药市场上占有重要地位。目前国内外对于抗凝药物的研究依旧如火如荼，开发出了一代又一代副作用低、抗凝效果好的药物，比如阿派沙班、利伐沙班、达比加群酯、肝素钠、依诺肝素钠等药物，但是此类药物的缺陷主要是与靶点相关的严重出血风险和血小板减少症等。因此，临床需要具有优势药理药效作用特点的新型抗凝药物。新型抗凝血药物研发的核心是有效避免出血倾向，而低出血倾向的创新药物研究尚未取得突破进展。
海参类动物来源的岩藻糖化糖胺聚糖(FG)是一类具有岩藻糖侧链取代的糖胺聚糖类衍生物，具有主侧链结构，同时主侧链均被硫酸基不同程度的酯化(J.Biol.Chem.,1996,271：23973-23984；Mar.Drugs,2013,11:399-417)。天然来源的FG具有很强的抗凝活性(Thromb.Haemost.,2008,100:420-428；J.Biol.Chem.,1996,271：23973-23984)。然而，天然FG仍存在广泛而矛盾的药理作用，包括诱导血小板聚集、产生出血倾向和激活XII等(Thromb.Haemost.,1988，59：432-434；Thromb.Haemost.,1997，65(4)：369-373)。通过化学手段适当解聚后，可以获得低分子量的岩藻糖化糖胺聚糖，但是如何将该低分子量的岩藻糖化糖胺聚糖与其它小分子盐类、未解聚及部分解聚的大分子岩藻糖化糖胺聚糖等物质分开，目前未见报道，因此本发明提供了一种纯化低分子量的岩藻糖化糖胺聚糖的方法。
切向流过滤是一种生物技术领域应用广泛的分离方法，通常用于生物制品的浓缩、脱盐或纯化。在切向流过滤过程中，液体流动方向与过滤方向呈垂直方向，小于模孔或名义分子量(NMWL)的物质可以透过膜，而大于模孔的物质一般被截留。超滤膜的截留性能是指对膜的截留和透过性能，受到滤液的成分，浓度，切向流速，压力等的影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种纯化低分子量的岩藻糖化糖胺聚糖的方法，采用超滤这种高效快速、条件温和、可重复性高的纯化手段，为工业化生产提供稳定、批间产品质量一致的超滤工艺。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
(1)将经过半合成得到的低分子量岩藻糖化糖胺聚糖粗产物使用一定比例的纯化水溶解，分别通过1μm、0.45μm滤芯过滤后，得到超滤母液；
(2)安装超滤系统：从保护液中取出30kd超滤膜包，安装于夹具中间夹紧，连接好管路，先使用少量纯化水清洗，再用0.1M NaOH循环30min，然后用纯化水洗至中性，气密性测试合格后，打开蠕动泵调至一定流速，调整进口及出口压力，使跨膜压符合要求，开始超滤，到一定体积后补水3～6次，合并所有透过液；
(2)更换3kd超滤膜包，从保护液中取出3kd超滤膜包，安装于夹具中间夹紧，连接好管路，先使用少量纯化水清洗，再用0.1M NaOH循环30min，然后用纯化水洗至中性，测试气密性，合格后调整蠕动泵转速至一定流速，调整进口及出口压力，使跨膜压符合要求，开始超滤，超滤至剩余一定体积后补水，直至检测盐含量合格后停止超滤，收集截留液；
(3)更换10kd超滤膜包，，从保护液中取出10kd超滤膜包，安装于夹具中间夹紧，连接好管路，先使用少量纯化水清洗，再用0.1M NaOH循环30min，然后用纯化水洗至中性，气密性测试合格后调整蠕动泵转速至一定流速，调整进口及出口压力，使跨膜压符合要求，开始超滤并收集透过液，超滤至一定体积后补水3～6次，合并所有透过液；
(4)3kd超滤浓缩，从保护液中取出10kd超滤膜包，安装于夹具中间夹紧，连接好管路，先使用少量纯化水清洗，再用0.1M NaOH循环30min，然后用纯化水洗至中性，气密性测试合格后，调整蠕动泵转速至一定流速，调整进口及出口压力，使跨膜压符合要求，开始超滤，超滤至剩余一定体积后停止，放出截留液，少量水冲洗膜包及管路，与截留液合并，进行冷冻干燥；
(5)检测其分子量及无机盐等小分子杂质。
本发明方法中，粗产物用纯化水溶解后的浓度范围为10～60mg/ml，优选20～40mg/ml；
所述的超滤膜包材质为再生纤维材质或聚醚砜材质，流道为C型或V型，其中优选再生纤维素材质，流道优选V型，根据产物量的要求，膜包可以单独或叠加使用；
30kd超滤时蠕动泵流速为1～5L/min，优选2～3.5L/min，10kd超滤时超滤时蠕动泵流速为1～5L/min，优选2～3.5L/min，，3kd超滤时蠕动泵流速为3～10L/min，优选4～7L/min；跨膜压为0.8～1.2bar，进口压为1.0～1.5bar，出口压为0.6～0.9bar；
3kd超滤去除小分子杂质过程中，截留液体积为总体积的1/5～1/10时开始补水，补水体积为总体积的1/5～1/10，补水次数为5～10次。
整个超滤过程须按照30kd→3kd→10kd→3kd的顺序进行，不能颠倒顺序。
糖类物质由于其本身的粘性，以及本发明中低分子量岩藻糖化糖胺聚糖粗产物的组成中除了目标产物低分子量的岩藻糖化糖胺聚糖，还含有小分子的无机盐类，和其他大分子的糖类，使用常规方法难以进行分离纯化，而切向流超滤由于其液体流动方向与过滤方向呈垂直，使得粘性较大的大分子的糖类不易聚集于膜包表面，随着超滤的进行也不会堵塞膜包而造成通量下降，因此可以一直保持高效运行。根据目标分子量的不同以及杂质的组成，可采用不同截留分子量的超滤膜包，30kd超滤膜包的截留范围为大于30000D分子量的物质，10kd超滤膜包的截留范围为大于10000D分子量的物质，而3kd超滤膜包的截留范围为大于3000D分子量的物质。
本发明采用三种不同截留分子量的超滤膜包进行超滤，并且通过控制不同的粗产物浓度、不同的跨膜压及泵流速等参数的纯化方法，使最终产物低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的分子量符合3000～10000Da要求，同时高效快速、条件温和、可重复性高，可以用于工业化生产。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明的具体实施方式，而不应当也不会对本发明的范围有所限制。
材料和试剂
低分子量岩藻糖化糖胺聚糖粗产物，是参考中国专利201410007855公开的方法制备方法，以海参中提取得到的岩藻糖化糖胺聚糖为起始原料，经过羧基酯化、β消除解聚、碱解脱酯、脱色、端基还原等一系列化学过程得到了低分子量岩藻糖化糖胺聚糖粗产物，该粗产物中主要包含目标产物、部分不发生解聚的大分子量杂多糖、无机盐等。
30kd、10kd、3kd超滤膜包及蠕动泵均购买自密理博，0.5㎡，氢氧化钠为市售分析纯，购自北京化工厂；纯化水为车间自制。
实施例1
采用以下步骤对低分子量岩藻糖化糖胺聚糖粗产物进行纯化：
(1)粗产物加入纯化水15L，浓度约为28mg/ml,分别过1μm、0.45μm滤膜，此处过滤的目的为除掉部分外来引入的不溶性微粒等，以防止损坏或堵塞膜包，故过滤前后的初始浓度无变化。冲洗过滤系统共得到滤液约23L，进行超滤。
(2)取30kd再生纤维素膜包，安装好超滤设备，10L纯化水冲洗10min后，0.1M氢氧化钠溶液回流冲洗膜包30min，然后水洗至中性，气密性良好，开始超滤样品。出口压0.8bar，进口压0.8、1.0bar，泵流速1.2L/min，超滤至约1L后补水，每次2.5L，共6次，合并透过液约38L。超滤结束后水清洗、0.1N氢氧化钠溶液膜包，结束超滤。
(3)取3kd再生纤维素膜包，安装好超滤设备，10L纯化水冲洗10min后，10L 0.1M氢氧化钠溶液回流冲洗膜包30min，然后水洗至中性，测试气密性良好，开始超滤样品，出口压1.0bar，进口压1.2bar，泵流速3.9L/min，超滤至5L时开始补水，每次5L，通过AgNO3检测透过端直至无Cl-残留，结束超滤，稀释截留液至18L。
(4)取10kd再生纤维素膜包，安装好超滤设备，10L纯化水冲洗10min后，10L 0.1M氢氧化钠溶液回流冲洗膜包30min，然后水洗至中性，测试气密性良好，开始超滤样品，出口压0.7bar，进口压1.1bar，泵流速1.2L/min，超滤至1.0L，然后补水2.5L，共补水6次，合并所有透过液。
(5)取3kd再生纤维素膜包，安装好超滤设备，10L纯化水冲洗10min后，10L0.1M氢氧化钠溶液回流冲洗膜包30min，然后水洗至中性，测试气密性良好，开始超滤样品，出口压1.1bar，进口压1.3bar，泵流速4.0L/min，超滤至1.5L时停止超滤，用500ml×3次纯化水冲洗膜包及管路，合并截留液，过0.22μm滤膜，然后冻干。
(6)HPLC检测冻干产物的重均分子量，结果如下：
本实施例1中得到的样品LGAG-3的Mw为13709，已经达到了分离纯化的目的，但是仍超出3000-10000的分子量要求范围，需要进一步优化超滤条件。通过前期研究发现，30kd及10kd超滤阶段的泵流速对分子量影响较大，泵流速偏小可能会造成部分大分子量的物质透过膜包，使得大分子量物质的比例偏高，以及Mw的增大。
实施例2
采用以下步骤对低分子量岩藻糖化糖胺聚糖粗产物进行纯化：
(1)粗产物加入纯化水22L，分别过1μm、0.45μm滤膜，冲洗过滤系统共得到滤液约33L，浓度为36mg/ml。
(2)取30kd再生纤维素膜包，安装好超滤设备，10L纯化水冲洗10min后，0.1M氢氧化钠溶液回流冲洗膜包30min，然后水洗至中性，气密性良好，开始超滤粗产物样品。出口压0.8bar，进口压1.2bar，泵流速2.3L/min，超滤至约1.5L后补水，每次3.6L，共6次，合并透过液约54L。超滤结束后水清洗、0.1M氢氧化钠溶液膜包，结束超滤。
(3)取3kd再生纤维素膜包两块，安装好超滤设备，10L纯化水冲洗10min后，10L0.1M氢氧化钠溶液回流冲洗膜包30min，然后水洗至中性，测试气密性良好，开始超滤样品，出口压1.0bar，进口压1.2bar，泵流速3.5L/min，超滤至5L时开始补水，每次5L，通过AgNO3检测透过端直至无Cl-残留，结束超滤，稀释截留液至22L。
(4)取10kd再生纤维素膜包，安装好超滤设备，10L纯化水冲洗10min后，10L 0.1M氢氧化钠溶液回流冲洗膜包30min，然后水洗至中性，测试气密性良好，开始超滤样品，出口压0.8bar，进口压1.1bar，泵流速2.3L/min，超滤至1.5L，然后补水3.6L，共补水6次，合并所有透过液。
(5)取3kd再生纤维素膜包，安装好超滤设备，10L纯化水冲洗10min后，10L0.1M氢氧化钠溶液回流冲洗膜包30min，然后水洗至中性，测试气密性良好，开始超滤样品，出口压1.0bar，进口压1.2bar，泵流速3.5L/min，超滤至1.5L时停止超滤，用500ml×3次纯化水冲洗膜包及管路，合并截留液，过0.22μm滤膜，然后冻干。
(6)HPLC检测经过纯化的低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的重均分子量，结果如下：
经过纯化的低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的重均分子量在3000～10000Da范围内，该方法的结果符合相关生产工艺要求。
实施例3
采用以下步骤对低分子量岩藻糖化糖胺聚糖粗产物进行纯化
(1)粗产物加入纯化水18L，过1μm、0.45μm滤膜，冲洗过滤系统共得到滤液约23L，浓度为25mg/ml。
(2)取30kd再生纤维素膜包，安装好超滤设备，10L纯化水冲洗10min后，0.1M氢氧化钠溶液回流冲洗膜包30min，然后水洗至中性，气密性良好，开始超滤样品。出口压0.7bar，进口压1.4bar，泵流速2.7L/min，超滤至约1.5L后补水，每次3.6L，共6次，合并透过液约45L。超滤结束后水清洗、0.1MN氢氧化钠溶液膜包，结束超滤。
(3)取3kd再生纤维素膜包两块，安装好超滤设备，10L纯化水冲洗10min后，10L0.1M氢氧化钠溶液回流冲洗膜包30min，然后水洗至中性，测试气密性良好，开始超滤样品，出口压1.1bar，进口压1.3bar，泵流速4.0L/min，超滤至5L时开始补水，每次5L，通过AgNO3检测透过端直至无Cl-残留，结束超滤，稀释截留液至18L。
(4)取10kd再生纤维素膜包，安装好超滤设备，10L纯化水冲洗10min后，10L 0.1M氢氧化钠溶液回流冲洗膜包30min，然后水洗至中性，测试气密性良好，开始超滤样品，出口压0.6bar，进口压1.3bar，泵流速2.9L，超滤至1.5L，然后补水3.6L，共补水6次，合并所有透过液。
(5)取3kd再生纤维素膜包，安装好超滤设备，10L纯化水冲洗10min后，10L0.1M氢氧化钠溶液回流冲洗膜包30min，然后水洗至中性，测试气密性良好，开始超滤样品，出口压1.1bar，进口压1.3bar，泵流速4.0L/min，超滤至1.5L时停止超滤，用500ml×3次纯化水冲洗膜包及管路，合并截留液，过0.22μm滤膜，然后冻干。
(6)HPLC检测其重均分子量，结果如下：
经过纯化的低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的重均分子量在3000～10000Da范围内，该方法的结果符合相关生产工艺要求。
Claims (10)
1.一种使用切向流超滤纯化低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的方法，包括以下步骤：
(1)低分子量岩藻糖化糖胺聚糖粗产物使用纯化水溶解，分别过1μm、0.45μm滤芯超滤得到母液；
(2)使用安装有30kd超滤膜包的超滤系统对步骤(1)得到的母液进行切向流超滤，收集透过液；
(3)使用安装有3kd超滤膜包的超滤系统对步骤(2)收集的透过液进行切向流超滤，收集截留液；
(4)使用安装有10kd超滤膜包的超滤系统对步骤(3)收集的截留液进行切向流超滤，收集透过液；
(5)使用安装有3kd超滤膜包的超滤系统对步骤(4)收集的透过液进行切向流超滤，收集截留液，即为纯化后的低分子量岩藻糖化糖胺聚糖。
2.根据权利要求1所述的使用切向流超滤纯化低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的方法，其特征在于，所述低分子量岩藻糖化糖胺聚糖粗产物纯化水溶解后的浓度范围为10～60mg/ml。
3.根据权利要求1所述的使用切向流超滤纯化低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的方法，其特征在于，所述的超滤膜包材质为再生纤维材质或聚醚砜材质，流道为C型或V型。
4.根据权利要求1所述的使用切向流超滤纯化低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的方法，其特征在于：
所述步骤(2)为将30kd超滤膜包置于夹具中间安装超滤系统，连接管路，气密性测试合格后，打开蠕动泵调至一定流速，调整进口及出口压力，使跨膜压符合要求，开始超滤，超滤至一定体积后补水3～6次，合并收集所有透过液；
所述步骤(3)为，将超滤系统更换为3kd超滤膜包，安装好后测试气密性，合格后调整蠕动泵转速至一定流速，调整进口及出口压力，使跨膜压符合要求，开始超滤，超滤至剩余一定体积后补水，检测透过端滤液直至无Cl-残留停止超滤，收集截留液；
所述步骤(4)为，将超滤系统更换为10kd超滤膜包，安装好后测试气密性，合格后调整蠕动泵转速至一定流速，调整进口及出口压力，使跨膜压符合要求，开始超滤并收集透过液，超滤至一定体积后补水3～6次，然后合并收集所有透过液；
所述步骤(5)为，将超滤系统更换为3kd超滤膜包，安装好后测试气密性，合格后调整蠕动泵转速至一定流速，调整进口及出口压力，使跨膜压符合要求，开始超滤，超滤至剩余一定体积后停止，放出截留液，少量水冲洗膜包及管路，与截留液合并收集进行冷冻干燥。
5.根据权利要求4所述的使用切向流超滤纯化低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的方法，其特征在于，使用30kd膜包超滤时蠕动泵流速为1～5L/min，10kd膜包超滤时蠕动泵流速为1～5L/min，3kd膜包超滤时蠕动泵流速为3～10L/min。
6.根据权利要求5所述的使用切向流超滤纯化低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的方法，其特征在于，使用30kd膜包超滤时蠕动泵流速为2～3.5L/min，10kd膜包超滤时蠕动泵流速为2～3.5L/min，3kd膜包超滤时蠕动泵流速为4～7L/min。
7.根据权利要求5所述的使用切向流超滤纯化低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的方法，其特征在于，超滤过程中跨膜压为0.8～1.2bar，进口压为1.0～1.5bar，出口压为0.6～0.9bar。
8.根据权利要求5所述的使用切向流超滤纯化低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的方法，其特征在于，3kd膜包超滤过程中，截留液体积为超滤前总体积的1/5～1/10时开始补水，补水体积为超滤前总体积的1/5～1/10，补水次数为5～10次。
9.根据权利要求5所述的使用切向流超滤纯化低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的方法，其特征在于，所述步骤(3)通过AgNO3检测透过端滤液直至无Cl-残留停止超滤。
10.根据权利要求5所述的使用切向流超滤纯化低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的方法，其特征在于，冷冻干燥后产品的重均分子量Mw为3000～10000Da。
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