CN101735319A - 一种抗gp73蛋白的单克隆抗体、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高活性的抗GP73单克隆抗体、其制备方法及应用。本发明还提供了一种用于检测人外周血样本中的高尔基蛋白GP73的免疫学定量检测试剂盒及其制备方法。本发明的试剂盒可用于监测慢性肝炎的发展水平和预后，还可用于肝癌的早期诊断。使用本发明的试剂盒对高尔基蛋白GP73表达水平进行监测，还能确定患者的预后水平及引发肝硬化和肝癌的几率，为肝癌和肝炎的预防、诊断、治疗提供最直接的支持。

Description

一种抗GP73蛋白的单克隆抗体、其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地说，本发明提供了一种针对高尔基蛋白GP73的单克隆抗体、其制备方法和应用。本发明还提供了一种用于检测人外周血样本中的高尔基蛋白GP73的免疫学定量检测试剂盒及其制备方法。利用该试剂盒可以快速、准确地计算人体外周血中的高尔基蛋白GP73的表达含量。

背景技术

肝细胞癌HCC(hepatocellular carcinoma)主要的病因学是HBV或HCV慢性肝病毒感染，在肝癌发生前一般有长时间的潜伏期——即感染肝病毒至肝癌发生时间。据2006年1月26日《中国医药报》报道以及《癌症》2005年第六期中文章的介绍，我国现有乙肝病毒携带者1.2亿左右，约占世界乙肝病毒携带者的1/3；有症状的慢性乙肝患者2000万人，另外我国还有肝硬化患者360万人。由于众多的肝病患者和肝癌高危人群，我国的肝细胞癌发病率最高。根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)估计，2000年全世界肝癌发病人数为56.4万，死亡54.9万人；我国肝癌发病人数30.6万，死亡30.0万人，约占全世界的50％。

在高危人群中建立早期诊断和监测机制是非常重要的。早期发现、早期治疗是提高患者生存率的关键，而大多数患者就诊时已届中晚期，失去了最佳治疗时机，高危险因素包括由乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒导致的慢性肝炎和肝硬化。另外要得到有效治疗，筛查和普查的临床效率依赖于早期诊断。

目前，HCC疾病传统上的监测是体检，肝超声影象分析和血清标志物系列检测。

其中最常使用的血清学标志物是甲胎蛋白AFP，由于甲胎蛋白AFP具有与HCC的相对特异性，因此目前得到广泛应用，但是部分良性肝病中AFP为阳性(特异性≤75％)和部分肝癌中AFP为阴性(灵敏度≤70％)，使得依靠AFP进行HCC预警和监测具有一定的局限性，而且AFP检测对于HCV相关的HCC灵敏度不高。因此在临床上希望获得比甲胎蛋白特异性和灵敏度更高的新血清学指标，或者能够与AFP进行互补的指标。

近年来，蛋白组学技术的发展使得高通量筛选新的肿瘤标志物成为可能，各种有前景的新肿瘤标志物被相继发现，其中高尔基体蛋白73(GolgiProtein73，GP73)最有可能成为更好的肝癌诊断尤其是早期肝癌诊断的血清标志物.

GP73(Golgi Protein73)是一种II型高尔基跨膜蛋白，也是一种新发现的与肝病病程相关的蛋白。GP73的分子量接近73KD(Kladney et al.，2000，Gene 249，53-65)。GP73在病毒性感染的肝细胞中高表达(Kladney，et al.，2000，Gene 249，53-65)，在胆汁上皮细胞中也有表达，而在正常肝细胞中表达量很少。相反的，肝病患者的肝细胞显示对GP73抗体的强免疫反应。GP73mRNA和蛋白在转染各种病毒(包括腺病毒)后的HepG2肝恶性肿瘤细胞中也有高表达。在患有病毒性肝病或非病毒性促成肝病如酒精性肝病，自身免疫性肝病等的患者中，GP73的表达量显著升高(Kladney，et al.，2002，Hepatology 35(6)：1431-40)。

2005年美国国家癌症研究所(Nat ional Cancer Institute，NCI)资助的一个课题组论证了GP73作为肝癌早期诊断指标的应用。对于早期肝癌的检测，GP73的灵敏度比AFP高出2-3倍，被认为是未来最有希望的一个肝癌预警新指标。对352例肝病患者的研究显示，GP73对HCC诊断的灵敏度为69％，特异性为75％。而其对早期肝癌诊断的灵敏度为62％，显著高于AFP(25％)。AFP低于20ng/ml的HCC患者中，有超过一半(57％)的患者GP73升高，提示GP73对HCC早期诊断，尤其是AFP阴性的早期HCC的诊断具有显著的优越性。

但是该研究采用的是蛋白印迹方法，免疫印迹方法为半定量分析，劳动量太大，不适于大样本量验证研究所需的高通量分析。此外，该方法采用的是多抗检测方法，而且该方法未建立定量标准。

本发明的目的正是为了解决目前临床上缺乏GP73定量检测试剂盒作为肝癌早期诊断检测手段的不足，提供了一种高活性的抗GP73单克隆抗体以及操作简便、准确灵敏的检测试剂盒和测定方法，以便从蛋白水平上观察GP73表达含量，能尽早采取有效的综合治疗方案，预防肝硬化和肝癌的发生。

发明内容

为了解决上述技术问题，在本发明的第一方面，提供了一种高活性的抗GP73单克隆抗体。

在本发明的另一方面，提供了本发明抗体的制备方法及其用于检测GP73蛋白的应用。

在本发明的另一方面，提供了一种酶联免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明的抗GP73单克隆抗体。

在本发明的另一方面，提供了一种化学发光定量检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明的抗GP73单克隆抗体。

在本发明的另一方面，还提供了一种快速诊断试剂盒，所述试剂盒中包括本发明的抗GP73单克隆抗体以及标定含量的GP73蛋白标准品，其中所述蛋白标准品有至少两种，其中一种标准品中的GP73含量值为正常人与肝病患者的GP73含量的临界值，另一种标准品中的GP73含量值为良性肝病患者与恶性肝病(肝癌)患者的GP73含量的临界值。

使用本发明的单克隆抗体和检测试剂盒，可以准确地计算出外周血中GP73的表达量，进而对肝癌早期诊断作出判断。而且，使用本发明的单克隆抗体和检测试剂盒，能真实地反应出血清中GP73的存在水平，没有交叉反应性，特异性良好，便于质量控制，并显示出极高的灵敏度。

附图说明

图1为GP73基因全序列图，其中序列前端框内的序列为Nde I位点，序列末端框内的序列为BamH I位点。

图2为所使用的质粒载体pET-15b-GP73的结构示意图。

图3为Pet-15b-GP73载体鉴定电泳图。

图4为GP73菌表达及GP73蛋白纯化的电泳图，1-6泳道：挑选GP73表达量高转化菌；7-10泳道：挑选的2号菌株进行表达、纯化的GP73蛋白，分子量40KD左右。

图5为3E12单抗对标准品检测的双对数图，图中的横坐标是吸光度的自然对数，纵坐标是浓度的自然对数。

图6为进口单抗YA-14对标准品检测的双对数图，图中的横坐标是吸光度的自然对数，纵坐标是浓度的自然对数。

图7为本发明的酶联免疫试剂盒测定的GP73蛋白含量与肝病或肝癌之间的关系图。

图8为GP73酶免定量测定肝病血清诊断肝癌的ROC曲线，横坐标为(1-特异性百分比)，纵坐标为灵敏度百分比，测得曲线下面积AUC＝0.88。

图9为本发明的化学发光试剂盒测定的GP73蛋白含量与肝病或肝癌之间的关系图。

图10为GP73化学发光定量测定肝病血清诊断肝癌的ROC曲线，横坐标为(1-特异性百分比)，纵坐标为灵敏度百分比，测得曲线下面积AUC＝0.9。

具体实施方式

本发明提供了一种针对高尔基蛋白GP73的酶联免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明的抗GP73单克隆抗体。

另一方面，本发明还提供了一种针对高尔基蛋白GP73的化学发光定量检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明的抗GP73单克隆抗体。

本发明的单克隆抗体是通过使用可溶性构象型高尔基蛋白GP73抗原对动物免疫、采用天然GP73抗原进行筛选杂交瘤克隆而获得的。具体而言，本发明的单克隆抗体由下述方法制备：用具有构象型表位的高尔基蛋白GP73重组抗原纯品对Balb/c小鼠进行免疫，取免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，再用从血清中提取的具有构象型表位的高尔基蛋白GP73抗原筛选GP73特异的杂交瘤克隆，注射至小鼠腹腔，收集腹水，纯化单克隆抗体。在本发明的某些具体实施方案中，所述单克隆抗体为筛选出的杂交瘤3E12株所分泌的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株于2008年11月11日以保藏号CGMCC No.2742保藏于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)。

在本发明的某些实施方案中，所述试剂盒中还包括高尔基蛋白GP73的标准品。在本发明的某些实施方案中，所述GP73蛋白的标准品为GP73全长蛋白，并处在蛋白保护稳定液中。所述GP73标准品可以通过基因工程、分子生物学和生物化学的手段进行重组表达而制备。一种制备方法包括：用大肠杆菌表达高尔基蛋白GP73，利用融合表达的蛋白标签做亲和纯化，获得GP73标准品。

在本发明的某些优选实施方案中，上述试剂盒还可以含有酶标板、辣根过氧化物酶(HRP)标记多克隆抗体和辅助试剂。其中对于酶联免疫检测试剂盒，所述辅助试剂中可含有显色底物四甲基联苯胺(TMB)，对于化学发光检测试剂盒，所述辅助试剂中可含有发光底物luminol(鲁米诺)。在本发明的另一些优选实施方案中，所述单克隆抗体是包被在酶标板上。

在本发明的具体实施方案中，还提供了上述试剂盒的制备方法，所述方法包括抗体包被板的制备、酶标抗体的制备以及辅助试剂的配制。

本发明试剂盒中的单克隆抗体包被板是用高尔基蛋白GP73蛋白纯品对小鼠免疫而获得的鼠抗GP73单克隆抗体对平板进行包被而制备的。所述平板可选用市售的酶标板或化学发光板；规格可以是96孔平板或12×8、12×4可拆条板。

一种可用于制备本发明的单克隆抗体包被的酶标板或化学发光板的步骤如下：

1)制备单克隆抗体：用高尔基蛋白GP73重组抗原按常规对Balb/c小鼠进行免疫后，取免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，用血清中提取的高尔基蛋白GP73抗原筛选GP73特异的杂交瘤克隆，注射小鼠腹腔，收集腹水经重组proteinG预装层析柱纯化后即获得抗GP73单克隆抗体。

2)包被：将单克隆抗体用0.05M，pH 9.5的碳酸缓冲液稀释后加入酶标板或化学发光板的各孔，每孔100μl，吸附过夜，用吐温-磷酸盐缓冲液洗板，再用吐温-磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被的酶标板或化学发光板。

本发明试剂盒中的酶标多克隆抗体可以用辣根过氧化物酶(HRP)标记GP73多克隆抗体而制备。GP73多抗通过常规免疫方法采用GP73纯品免疫新西兰大白兔而获得。

一种可用于制备本发明的酶标多克隆抗体的方法如下：

a)以NaIO₄-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度10mg/ml。

b)在碱性碳酸盐缓冲液(0.05M，pH9.5的碳酸盐缓冲液)中透析6小时，实现HRP对多克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH₄溶液终止反应，再对PBS透析过夜。

c)用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标抗GP73多克隆抗体。

在本发明的酶联免疫试剂盒中，辅助试剂可包括酶联反应底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液。一种可用于上述试剂盒的辅助试剂如下：

a)底物溶液A：50mmol/L磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的3％过氧化氢溶液；

b)显色液B：四甲基联苯胺(TMB)甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；

c)反应终止液：2mol/L硫酸；

d)清洗缓冲液(20倍浓缩液，20×)：20mmol/L PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。

e)样本稀释液：2％BSA(小牛血清白蛋白)

本发明还提供了使用上述酶联免疫试剂盒检测高尔基蛋白GP73蛋白含量的方法，所述方法包括下述步骤：

a)抗原-抗体反应：在试剂盒提供的抗体包被板的微孔中每孔加入100μl样本稀释液，再分别加入50μl待测血清样品或50μl含不同浓度(0，20ng/ml，40ng/ml，100ng/ml，250ng/ml)的GP73蛋白标准品，37℃水浴保温30分钟，洗板。将HRP-多克隆抗体溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保温30分钟。重复洗板操作4次。

b)显色反应：每孔依次加入底物溶液A，显色液B各50μl，37℃水浴保温10分钟，每孔再加入50μl反应终止液结束反应。

c)比色：以空白对照孔的吸光值调零，用酶标仪在450nm测定OD值并记录。

d)结果判断：

A.对于不能自动处理数据的酶标仪，可以用计算机软件计算处理处理的数据。

B.手工计算结果：减去空白孔背景的光吸收值以纠正吸收值，计算出每一标准液的平均吸收值(y轴)和其相对应的浓度值(x轴)，连接成一条标准曲线。根据此标准曲线计算出未知的病人标本的浓度值。

在本发明的化学发光试剂盒中，辅助试剂可包括化学发光反应底物溶液、显色液和样本稀释液，一种上述试剂盒的辅助试剂如下：

1)底物溶液A：EDTA(1.0×10^-2M)、H₂O₂(7.5×10^-3M)、HCl(1.0×10^-2M)和Tween20(1％)。

2)显色液B：50mM pH 9.6碳酸盐缓冲液，含luminol 5.0×10^-4Mol/L；

3)样本稀释液：含2％BSA的20mM pH 7.4PBS缓冲液

本发明还提供了使用上述化学发光试剂盒检测高尔基蛋白GP73的方法，所述方法包括下述步骤：

a)抗原-抗体反应：在试剂盒提供的抗体包被板的微孔中分别加入100μl样本稀释液，然后加入10μl待测血清样品或10μl含不同浓度(0，20ng/ml，40ng/ml，100ng/ml，250ng/ml)的GP73蛋白标准品，37℃水浴保温30分钟，洗板。将HRP-多克隆抗体溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保温30分钟。重复洗板操作4次。

b)显色反应：每孔依次加入底物溶液A，显色液B各50μl，读值。

c)结果计算：

A绘制标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定的化学发光值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R²，当R²＞0.98时本次测定有效；

B计算待测血清样品浓度：根据待测样品的化学发光值从标准曲线计算出待测血清样品的高尔基蛋白GP73浓度。

在本发明的另一方面，还提供了一种快速诊断试剂盒，所述试剂盒中含有抗GP73的单克隆抗体以及标定含量的GP73蛋白标准品，其中所述蛋白标准品有至少两种，其中一种标准品中的GP73含量为正常人与肝病患者的GP73含量的临界值，另一种标准品中的GP73含量为良性肝病患者与恶性肝病(肝癌)患者的GP73含量的临界值。在本发明的某些特别优选的实施方案中，所述正常人与肝病患者的GP73含量的临界值被设定为40ng/ml，所述良性肝病患者与恶性肝病(肝癌)患者的GP73含量的临界值被设定为100ng/ml。

本发明试剂盒具有以下优点：

a)本发明试剂盒以重组GP73抗原免疫并以天然GP73蛋白筛选而获得的单克隆抗体作为捕获单抗，拥有更高的灵敏度和特异度。

b)试剂盒配套用的标准品，能够精确定量计算出血样标本中所含的GP73蛋白的含量。

c)由于在本发明试剂盒的标准品中提供了正常人与肝病患者的GP73含量的临界值以及良性肝病患者与恶性肝病(肝癌)患者的临界值，因此在读出被测样本的测量值之后，只需直接将该测量值与临界值(例如40ng或100ng)进行比较，即可初步判断被测患者的肝病发展情况，检测操作快速简便，准确率高。

下面用实施例进一步说明本发明。应该理解的是，下述实施例仅是用于说明本发明而不是对本发明的限制。

实施例1：本发明的单克隆抗体的制备和表征

1)GP73单克隆抗体的制备：

a)高尔基蛋白GP73重组抗原(免疫原)的构建：

按基因序列号AF236056人工合成GP73基因全序列，根据pET-15b载体多克隆位点，两端分别引入Nde I和BamH I位点，得到的序列全长示于图1。将所得的序列插入原核表达载体pET-15b中，pET-15b-GP73质粒结构图谱示于图2。重组质粒以Nde I和BamH I双酶切鉴定，通过1.2％琼脂糖凝胶电泳检查插入片段是否正确，鉴定结果示于图3，其中第1泳道为M.Takara DL2,000Marker，第2泳道为双酶切产物。筛选正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21，铺在Amp+LB平板培养基上，37℃过夜培养，挑取单菌落置5ml Amp+LB培养基中培养2-4小时，待菌液略显浑浊且OD₆₀₀值达到0.6时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)至最浓度0.5mmol/L，37℃诱导培养4小时，取菌液裂解做聚丙烯酰胺凝胶电泳(12％SDS-PAGE)，在40KD处有明显表达者则进行大量表达(图4)。

取5μl已经鉴定的菌液，加入5ml Amp+LB培养基中，37℃培养过夜，再转移到200ml Amp+LB培养基中，37℃培养2小时，加入IPTG(0.5mmol/L)进行诱导，4小时后收集菌体，诱导表达的条件为37℃，0.5mmol/L IPTG，4h。离心收集菌体，超声(SONICS&MATERIALS公司，Uilbra-Cell VCX500型超声破碎仪)破碎，超声上清经30％的饱和硫酸铵沉淀后，用1×PBS(20mmol/L，pH7.4)溶解，对1×PB(pH7.45)透析过夜，离心后上清采用GE公司Histrap镍离子亲和层析纯化柱进行纯化，纯化后的蛋白纯度达到电泳纯(95％以上)。

重组抗原只有可溶性才有可能拥有构象型表位，克隆全长基因的GP73蛋白，在大肠杆菌中与亲和纯化标签hi s-tag融合表达，经镍柱亲和层析，获得的纯化的可溶性的GP73抗原。该抗原用于免疫小鼠以获得单克隆抗体。

b)天然GP73抗原制备：收集肝病人血清，储存备用。纯化的基因重组GP73蛋白免疫新西兰白兔，获得GP73抗原多克隆抗体。利用获得的GP73抗原多克隆抗体制备亲和层析柱，将肝病人血清过亲和层析柱，洗脱获得纯化后的GP73天然结构蛋白，该抗原用于筛选单克隆抗体使用。

c)免疫和细胞融合：如等量的a)步骤制备的重组免疫原与弗氏完全佐剂混合，得到油状乳液。将该乳液以0.2毫升的剂量皮下施给BALB/C小鼠(CLEAJapan的产品，6周龄雄性)的背部位点。第一次免疫7天或14天后增强免疫，然后在细胞融合前3天，腹膜内施用0.2毫升上述免疫原。最后一次增强免疫3天后，从各小鼠上切下脾脏细胞，与骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14株，RikenGeneBank)以10∶1混合，用50％聚乙二醇4000融合。在HAT培养基(Gibco的产品)上选择性培养杂交瘤。

d)杂交瘤筛选：为优选高活性细胞株，采用HAT选择培养，用ELISA方法进行筛选，具体为在包被板上包被提取的天然GP73蛋白，吸附GP73的鼠抗体，加入HRP标记的兔抗鼠二抗，阳性者为阳性克隆。具体为：在融合后第12天，用天然GP73抗原包被ELISA法测定各培养上清液中的抗体活性。各取200微升的融合细胞的培养上清液加到96孔ELISA板Coaster的产品)的孔中，其中每孔固定有2微克/毫升的抗原，反应在37℃进行1小时，然后用含0.05％Tween 20的PBS(洗液)洗涤，在各孔中加入200微升过氧化物酶标记的抗小鼠IgG(Cappel产品，1∶20,000)。反应在37℃进行1小时后，用上述洗液洗涤板。然后在各孔中加入200微升底物溶液(0.1M四硝基联苯胺TMB和0.012％过氧化氢水溶液)，使反应在室温下进行15分钟。然后，在各孔中加入50微升3.5mol硫酸终止酶反应，测量波长492纳米的吸光度，选择能与天然GP73抗原产生反应的抗体，并收获吸光度不低于0.15的杂交瘤克隆。用限制稀释法对各克隆进行两次克隆。克隆后的杂交瘤移植到BALB/C小鼠中，结果发现32个杂交瘤克隆产生各种可作为腹水回收的单克隆抗体。其中吸光度最高的为编号3E12的克隆，该阳性克隆经过3次克隆化获得单克隆抗体细胞株，继续使用其编号3E12。该杂交瘤细胞株于2008年11月11日以保藏号CGMCC No.2742保藏于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)。

杂交瘤细胞染色体检查：在细胞培养基中加入终浓度为0.3μg/ml的秋水仙素，于37℃继续培养2h，收集细胞，加0.075mol/L KCl，37℃保温30min。用甲醇与冰醋酸混合液(两者比例为3∶1)固定3次，制片，Giemsa染色。测得3E12克隆细胞株的染色体数为95，大部为端部着丝点染色体，并有中部着丝点和亚中部着丝点染色体。

抗体纯化方法：采用protein A Sepharose 4B亲和层析纯化。测得纯化后蛋白含量为7-11g/L。

单克隆抗体效价测定：采用间接ELISA法测定腹水McAb效价，具体步骤如下：(1)用10mg/L的GP73抗原包被酶标板，每孔100μl，4℃过夜；(2)用洗涤液(含质量浓度为0.5g/L的Tween-20的PBS，20mmol/L，pH7.4)洗板3次；(3)在37℃条件下以浓度为2mg/ml的BSA-PBS封闭2h；(4)用上述洗涤液洗板3次；(5)加入不同稀释倍数的待检样品(腹水)静置1.5h，同时以正常培养液作为阴性对照；(6)用上述洗涤液洗板3次；(6)在每孔中加入HRP-抗鼠IgG抗体，静置1h，然后用TMB显色系统测定。测得3E12杂交瘤腹水单克隆抗体的效价为6×10⁵。

抗体亚型鉴定：用ELISA双扩法测得3E12的IgG亚类为IgG1型。

特性测试：与国外单抗(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC.单抗细胞株YA-14)进行平行比较。具体方法为同时分别包被于聚苯乙烯板上，浓度均为200μg/ml，采用制备的酶标GP73多抗进行示踪，采用20个肝癌、20个肝炎、20个正常人标本以及不同浓度(0、20ng/ml、40ng/ml、100ng/ml和250ng/ml)的GP73重组蛋白进行检测，比较进口单抗与3E12对肝病鉴别诊断的效果(表1)、定量标准品的线性检测效果(表2，图5，图6)。该结果以光密度吸光值OD显示，表中所示的OD值为(实际测得的OD值-GP73蛋白浓度为0的对照样品的OD值)。

表1：两种单抗对肝病疾病的检测

检测结果(OD450值)	肝癌	肝炎	正常人
				3E12	2.02±0.75	0.43±0.37	0.13±0.07
单抗YA-14	0.74±0.66	0.51±0.35	0.23±0.17

结果显示：3E12对肝癌、肝炎、正常人的检测OD值具有显著性差异，P＜0.001；而YA-14对3种血清的检测OD值不具有显著性差异，P＝NS。

表2：两种单抗的活性对比

抗原浓度

3E12单抗

进口单抗YA-14

编号	浓度(ng/ml)	ln(浓度)	吸光度OD450	ln(吸光度)	吸光度OD450	ln(吸光度)
							1	20	2.99	0.331	-1.105636904	0.051	-2.975929646
2	40	3.68	0.573	-0.556869562	0.233	-1.456716825
							3	100	4.60	1.156	0.14496577	0.864	-0.14618251
4	250	5.52	2.034	0.710004298	0.912	-0.092115289

结果显示：YA-14的R²值明显小于3E12的R²值，说明YA-14的线性关系较差，无法达到定量检测试剂的要求。

实施例2：高尔基蛋白GP73酶联免疫定量检测试剂盒的制备

本实施例制备了一种本发明的高尔基蛋白GP73酶联免疫检测试剂盒(96人份)，其组成包括：

高尔基蛋白GP73标准品5瓶；

GP73单克隆抗体包被板(96孔)1块；

辣根过氧化物酶(HRP)标记的GP73多克隆抗体1瓶，10ml/瓶；

底物溶液A、显色液B各1瓶，各5ml/瓶；

反应终止液1瓶，5ml/瓶；

清洗缓冲液(20×浓缩)1瓶，50ml/瓶。

具体操作如下：

1.制备高尔基蛋白GP73标准品：

1)所使用的GP73蛋白为实施例1第1)部分中人工合成的带His标签的全长人GP73蛋白。

2)分装：将GP73蛋白按0，20ng/ml，40ng/ml，100ng/ml，250ng/ml的不同浓度稀释于2％的BSA溶液中，加入防腐剂procline 300(购自SUPELCO公司)至最终浓度0.1％。

过滤除菌，并在无菌的条件下分装入1.5ml小管中，每管0.5ml。贮存于4℃。

2.制作GP73单克隆抗体包被板：

1)所使用的抗GP73单克隆抗体为杂交瘤3E12株所分泌的单克隆抗体，抗体经过protein A琼脂糖介质纯化。

2)包被：

酶标板采用Costar公司生产的12×8可拆条板。将步骤1)所述单克隆抗体用0.05mol/L，pH9.5的碳酸盐缓冲液稀释为20μg/ml后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用清洗缓冲液(PBST溶液，包含20mmol/LPBS，0.5％Tween-20，pH7.4)洗板，再用该封闭液缓冲液封闭过夜(2％BSA，稀释于PBST溶液中)，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。按96孔/块用铝箔袋包装、真空封闭。

3.制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗GP73多克隆抗体

1)酶的氧化(全过程避光)

a)称取HRP5mg，加ddH₂O 250μl溶解。

b)称取NaIO₄5mg，加ddH₂O 250μl溶解，配制成20mg/mL的浓度。

c)往HRP溶液中逐滴加入NaIO₄溶液，边加边搅拌。

d)将混合好的溶液置于4℃，静置30分钟。

e)取5ml乙二醇溶于25μl ddH₂O中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌。

f)室温静置30分钟。

g)酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/ml。

2)多克隆抗体的准备及标记(避光)

a)调整抗体浓度到5mg/ml左右(如蛋白浓度过低则用PEG20000浓缩)，用pH9.5左右的50mmol/L碳酸盐缓冲液(1mol/L NaHCO₃与1mol/L Na₂CO₃按10∶1的比例混合，使用前以蒸馏水稀释20倍)透析去甘油或杂质(如Tris)，4℃下透析过夜，其中换液3次。

b)将多克隆抗体与HRP按1∶4混合，于50mmol/L pH9.5碳酸盐缓冲液中透析6小时以上，头两个小时换液一次。

c)用新鲜配置的1mg NaBH₄溶液终止反应。摇匀，4℃静置2小时，每半小时摇一次，NaBH₄溶液加入的量要合适。

d)用pH7.2的10mM PBS(预配置0.01mol/L的Na₂HPO₄和NaH₂PO₄储备液，根据需要的pH值混匀二者成PBS缓冲液)透析过夜。换液一次即可。

3)纯化HRP酶标抗GP73抗原多克隆抗体

a)完成标记的多克隆抗体溶液中逐滴加入饱和硫酸铵溶液，边加入边搅拌，直至饱和硫酸铵浓度降低至1/3。

b)4℃静置1小时。

c)8000rpm离心10分钟，将上清移至新管中，沉淀用等体积PBS重新悬浮。

d)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到40％，分别收集上清和沉淀。

e)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到50％，分别收集上清和沉淀。

f)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到60％，分别收集上清和沉淀。

g)收集分离的各个组分，SDS-PAGE鉴定纯度。

h)提纯的HRP-多克隆抗体对PBS透析过夜。

i)超滤管离心浓缩纯化的HRP-多克隆抗体，获得克分子比接近1∶8的酶标抗GP73抗原多克隆抗体。

4)分装：用含10％胎牛血清的缓冲液(20mmol/L PBS)稀释由步骤3)获得的酶标抗GP73抗原多克隆抗体至合适的工作浓度，按6ml/瓶分装，贮存于4℃。

4.配制底物溶液A：用磷酸-柠檬酸缓冲液(50mmol/L，PH5.0)配制的3％过氧化氢溶液，按5ml/瓶分装。

5.配制显色液B：TMB(0.1mg/ml)甲醇溶液，按5ml/瓶分装。

6.配制反应终止液：2mol/L H₂SO₄，按5ml/瓶分装。

7.配制清洗缓冲液(20倍浓缩液)：PBS(pH7.4)配制的1％吐温20溶液，按50ml/瓶分装。

实施例3：GP73定量酶联免疫检测试剂盒的使用方法

1.清洗缓冲液配制：将试剂盒提供的浓缩清洗缓冲液加蒸馏水20倍稀释。

2.准备标准品：试剂盒中的标准品包括5个不同浓度的GP73抗原标准品，各标准品浓度分别为0、20ng/ml、40ng/ml、100ng/ml、250ng/ml。

3.抗原-抗体反应：在试剂盒提供的抗体包被板的微孔中分别加入100μl样本稀释液，然后加入不同浓度的标准品或待测血清样品各10μl，37℃水浴保温30分钟。然后用清洗缓冲液重复洗板4次，每次3分钟。

4.酶联反应：将GP73多克隆抗体HRP溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保温30分钟。重复洗板操作4次，每次3分钟。

5.显色反应：每孔依次加入底物溶液A、TMB显色液B各50μl，37℃水浴保温10分钟，每孔再加入50μl反应终止液结束反应。

6.比色：以空白对照孔的吸光值调零，用酶标仪在450nm测定OD平均值；记录各孔吸光值；计算双孔标准品OD值的平均值。

7.结果计算

1)标准曲线的绘制：以标准品浓度为横坐标、标准品测定的平均OD值为纵坐标，绘制本次测定的标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.98时本次实验有效。

2)计算待测样品浓度：当标准曲线和质控品均被判定有效时，根据待测样本的OD值从标准曲线计算出待测血清样品中的GP73抗原浓度。

实施例4：本发明的GP73抗原定量酶联免疫检测试剂盒的质量检测

1)准确性：15份GP73抗原阴性质控血清(包括特异性对照血清)参考品的检测结果，无假阳性出现。10份GP73抗原阳性质控血清的参考品检测结果无假阴性出现。

2)精密度：随机抽取20盒不同批次试剂盒，用同一份GP73抗原阳性质控血清按说明书操作步骤进行重复测定。计算每次测定结果，求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV《15％。

3)检测灵敏度：根据GP73抗原重组表达抗原梯度稀释测定结果，本试剂盒的检测灵敏度为5ng/ml。

4)特异性：取四份待测样品混合后分为四份混合血清标本，每份1ml。分别加入50ng剂量的组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、血纤维蛋白溶酶(Plasmin)、或纤粘连蛋白(FN)后制成干扰试验血清标本#1、#2、#3，未加任何干扰物的#4混合血清标本作为基础样品。按实施例3中所述的方法进行测定并计算结果。然后按干扰试验计算公式计算干扰率。标本#1、#2、#3的干扰误差均小于1.5％。

5)回收率：用由浓度为20ng/ml，40ng/ml，100ng/ml，250ng/ml的标准品所检测得到的吸光度回归标准曲线得到的值进行回收率比较，回收率在89-132％之间。

实施例5：GP73抗原化学发光定量试剂盒的制备

本实施例制备了一种本发明的高尔基蛋白GP73化学发光检测试剂盒(96人份)，其组成包括：

高尔基蛋白GP73标准品5瓶；

GP73单克隆抗体包被板(96孔)1块；

辣根过氧化物酶(HRP)标记的GP73多克隆抗体1瓶，10ml/瓶；

底物溶液1瓶：EDTA(1.0×10^-2M)、H₂O₂(7.5×10^-3M)、HCl(1.0×10^-2M)和Tween20(1％)

显色液1瓶：luminol 5.0×10^-4Mol/L；

样本稀释液1瓶：含2％BSA的20mM pH 7.4PBS缓冲液

具体操作如下：

1.制备高尔基蛋白GP73标准品：

1)所使用的GP73蛋白为实施例1第1)部分中人工合成的带His标签的全长人GP73蛋白。

2)分装：将GP73蛋白按0，20ng/ml，40ng/ml，100ng/ml，250ng/ml不同浓度稀释于2％的BSA溶液中。向溶液中加入防腐剂procline300(购自SUPELCO公司)至最终浓度0.1％。

过滤除菌，并在无菌的条件下分装入1.5ml小管中，每管0.5ml。贮存于4℃。

2.制作GP73单克隆抗体包被板：

1)所使用的抗GP73单克隆抗体为杂交瘤细胞株3E12所分泌的单克隆抗体，抗体经过protein A琼脂糖介质纯化。

2)包被：

酶标板采用Costar公司生产的12×8可拆条板。将步骤1)所述单克隆抗体用0.05mol/L，pH 9.5的碳酸盐缓冲液稀释为20μg/ml后加入化学发光板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用清洗缓冲(PBST溶液，包含20mmol/LPBS，0.5％Tween-20，Ph7.4)洗板，再用该封闭液缓冲液(2％BSA，PBST溶液配制)封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被化学发光板。按96孔/块用铝箔袋包装、真空封闭。

3.制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗GP73多克隆抗体

辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗GP73多克隆抗体的制备、纯化和分装过程如实施例2第3部分所述。

4.配制底物溶液：EDTA(1.0×10^-2M)、H₂O₂(7.5×10^-3M)、HCl(1.0×10^-2M)和Tween20(1％)；按5ml/瓶分装。

5.配制显色液B：20mM pH 7.4PBS缓冲液，含luminol 5.0×10^-4Mol/L；按5ml/瓶分装。

6.配制清洗缓冲液(20×浓缩液)：PBS(pH7.4)配制的1％吐温20溶液，按15ml/瓶分装。

实施例6：GP73化学发光免疫检测试剂盒的使用方法

1.抗原-抗体反应：在试剂盒提供的抗体包被板的微孔中分别加入100μl样本稀释液，然后加入10μl待测血清样品或10μl含不同浓度(0，20ng/ml，40ng/ml，100ng/ml，250ng/ml)的GP73蛋白标准品，37℃水浴保温30分钟，洗板。将HRP-多克隆抗体溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保温30分钟。重复洗板操作4次。

2.显色反应：每孔依次加入底物溶液A，显色液B各50μl，读值。

3.结果计算：

1)绘制标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定的化学发光值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R²，当R²＞0.98时本次测定有效；

2)计算待测血清样品浓度：根据待测样品的化学发光值从标准曲线计算出待测血清样品的高尔基蛋白GP73浓度。

实施例7：本发明的GP73化学发光法定量检测试剂盒的质量检测

1)回收率：取三份待测样品混合后分为三份混合血清标本，每份1ml。分别加入0、20、100ng的GP73重组抗原纯品，制成回收试验血清标本#1、#2、#3。按说明书操作步骤进行测定并计算结果。然后按回收率计算公式计算回收率。标本#2、#3的回收率分别为96.4％和98.7％，平均回收率为97.5％，即试剂盒的比例偏差为2.5％，准确性为97.5％。

2)精密度：随机抽取20盒不同批次试剂盒，用同一份待测样本体按说明书操作步骤进行重复测定。计算每次测定结果，求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV《15％

3)线性范围：用GP73抗原纯品稀释成一系列不同浓度的纯品溶液：1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、5ng/ml、2ng/ml和0ng/ml。按照说明书操作步骤进行测定。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制曲线。线性范围内最高检测上限值为1500ng/ml，最低检测下限值为0.5ng/ml。试剂盒的线性范围为0.5-1000ng/ml。

4)检测灵敏度：根据上述线性范围测定结果，本试剂盒的检测灵敏度为0.5ng/ml。

5)特异性：取四份待测样品混合后分为四份混合血清标本，每份1ml。分别加入50ng剂量的组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、血纤维蛋白溶酶(Plasmin)、或纤粘连蛋白(FN)后制成干扰试验血清标本#1、#2、#3，未加任何干扰物的#4混合血清标本作为基础样品。按实施例6中所述的方法进行测定并计算结果。然后按干扰试验计算公式计算干扰率。标本#1、#2、#3的干扰误差均小于1.5％。

实施例8：本发明GP73定量酶联免疫检测试剂盒对临床血清样品的检测

为判断本发明GP73抗原酶联免疫检测试剂盒与肝癌检测结果的符合率，取地坛医院临床血清标本：120份已知肝癌阳性标本、120份体检健康血清、80份慢性肝炎。检测结果见图7和图8。

注：图8的ROC曲线指受试者工作特征曲线(receive operatingcharacteristic curve)，是反映灵敏度和特异性连续变量的综合指标，是用构图法揭示灵敏度和特异性的相互关系，它通过将连续变量设定出多个不同的临界值，从而计算出一系列灵敏度和特异性，再以灵敏度为纵坐标、(1-特异性)为横坐标绘制成曲线，曲线下面积(AUC，Area under curve)越大，诊断准确性越高。在ROC曲线上，最靠近坐标图左上方的点为灵敏度和特异性均较高的临界值.当AUC大于0.8时，表明该检测指标具有很好的诊断价值。

图8中的ROC曲线的曲线下面积AUC为0.88，表明检测GP73蛋白可以对肝癌诊断起到很好的效果，临界值取自ROC曲线上灵敏度及特异性最佳平衡点所对应的数值，分析得出以40ng为正常人与肝病患者为临界值，以100ng为肝癌患者与肝炎患者的临界值，本实验结果表明，本发明对于肝癌诊断的阳性率高达73％，在慢性肝炎中阳性率17％，在正常人中特异性达到96％，满足临床检验需要。

实施例6：本发明GP73化学发光定量检测试剂对肝癌、慢性肝炎、正常人标本的检测

以40ng为正常人与肝病患者为临界值，以100ng为肝癌患者与肝炎患者的临界值，检测中国人民解放军第302医院提供的90份肝癌(全部为AFP阴性肝癌标本)、75份肝炎、50份健康体检员的血清标本。结果见图9和图10。

结果显示，肝癌阳性率为80％，肝炎阳性率为21％，正常人特异性90％。

统计分析，图10中的ROC曲线的曲线下面积AUC为0.9。表明检测GP73在AFP阴性肝癌中可起到有效诊断作用。

序列表

<110>北京热景生物技术有限公司

<120>一种抗GP73蛋白的单克隆抗体、其制备方法和应用

<130>CP1080731P

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1212

<212>DNA

<213>人类(homo sapiens)

<400>1

catatgggct tgggaaacgg gcgtcgcagc atgaagtcgc cgcccctcgt gctggccgcc  60

ctggtggcct gcatcatcgt cttgggcttc aactactgga ttgcgagctc ccggagcgtg  120

gacctccaga cacggatcat ggagctggaa ggcagggtcc gcagggcggc tgcagagaga  180

ggcgccgtgg agctgaagaa gaacgagttc cagggagagc tggagaagca gcgggagcag  240

cttgacaaaa tccagtccag ccacaacttc cagctggaga gcgtcaacaa gctgtaccag  300

gacgaaaagg cggttttggt gaataacatc accacaggtg agaggctcat ccgagtgctg  360

caagaccagt taaagaccct gcagaggaat tacggcaggc tgcagcagga tgtcctccag  420

tttcagaaga accagaccaa cctggagagg aagttctcct acgacctgag ccagtgcatc  480

aatcagatga aggaggtgaa ggaacagtgt gaggagcgaa tagaagaggt caccaaaaag  540

gggaatgaag ctgtagcttc cagagacctg agtgaaaaca acgaccagag acagcagctc  600

caagccctca gtgagcctca gcccaggctg caggcagcag gcctgccaca cacagaggtg  660

ccacaaggga agggaaacgt gcttggtaac agcaagtccc agacaccagc ccccagttcc  720

gaagtggttt tggattcaaa gagacaagtt gagaaagagg aaaccaatga gatccaggtg  780

gtgaatgagg agcctcagag ggacaggctg ccgcaggagc caggccggga gcaggtggtg  840

gaagacagac ctgtaggtgg aagaggcttc gggggagccg gagaactggg ccagacccca  900

caggtgcagg ctgccctgtc agtgagccag gaaaatccag agatggaggg ccctgagcga  960

gaccagcttg tcatccccga cggacaggag gaggagcagg aagctgccgg ggaagggaga  1020

aaccagcaga aactgagagg agaagatgac tacaacatgg atgaaaatga agcagaatct  1080

gagacagaca agcaagcagc cctggcaggg aatgacagaa acatagatgt ttttaatgtt  1140

gaagatcaga aaagagacac cataaattta cttgatcagc gtgaaaagcg gaatcataca  1200

ctctgaggat cc                                                      1212

Claims (10)

1.一种抗高尔基蛋白GP73的单克隆抗体，所述单克隆抗体由3E12杂交瘤细胞分泌，所述杂交瘤细胞于2008年11月11日以保藏号CGMCCNo.2742保藏于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)。

2.一种酶联免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1的单克隆抗体。

3.根据权利要求2的试剂盒，所述试剂盒还包括酶标板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的多克隆抗体和辅助试剂。

4.根据权利要求3的试剂盒，其中所述辅助试剂中包括显色底物四甲基联苯胺(TMB)。

5.一种化学发光定量检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1的单克隆抗体。

6.根据权利要求5的试剂盒，所述试剂盒还包括酶标板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的多克隆抗体和辅助试剂。

7.根据权利要求6的试剂盒，其中所述辅助试剂中包括发光底物鲁米诺。

8.一种快速诊断试剂盒，所述试剂盒中包括权利要求1的单克隆抗体以及标定含量的GP73蛋白标准品。

9.根据权利要求8的快速诊断试剂盒，其中所述蛋白标准品有至少两种，其中一种标准品中的GP73含量为正常人与肝病患者的GP73含量的临界值，另一种标准品中的GP73含量为良性肝病患者与恶性肝病患者的GP73含量的临界值。

10.根据权利要求9的快速诊断试剂盒，其中所述正常人与肝病患者的GP73含量的临界值为40ng/ml，所述良性肝病患者与恶性肝病患者的GP73含量的临界值为100ng/ml。

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