CN101735309B - 虹彩病毒抗原活性多肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一新颖虹彩病毒抗原活性多肽与其抗体，以及利用该抗体进行虹彩病毒检测的方法。本发明另提供检测虹彩病毒的套组，与包含上述多肽与抗体的组合物。
Description
技术领域
本发明与免疫学与疾病检测有关。
背景技术
石斑鱼是现今养殖界公认为亚太地区最重要的经济鱼种，也为台湾水产养殖业带来莫大的经济效益，估计每年产值可高达20～50亿元新台币，全球市场占有率达42％，产量高达12.367公吨，产值及产量均位居世界第一。但是因为鱼苗与稚鱼的养成多为室内密集式的饲养，造成石斑鱼病害感染的情况严重。目前台湾石斑养殖的病毒害以神经坏死病毒(nervousnecrosis virus)和虹彩病毒(iridovirus)为最严重，感染往往造成石斑鱼苗大量死亡，严重威胁台湾养殖产业。
虹彩病毒为正二十面体，大小约120-300nm的双股DNA病毒，近些年来已被证实会对20种以上的鱼种造成感染，其中石斑种苗的感染率在60％以上。虹彩病毒科主要分成五个病毒属，分别为Iridovirus、Chlorirdovirus、Ranavirus及Lymphocystivirus，以及在2003年被发现一新的病毒属Megalocystivirus。在台湾目前发现有两种病毒属的存在，分别为Ranavirus及Megalocystivirus，两种病毒属皆会造成高的疾病发生率及死亡率。
目前检测虹彩病毒的方法多以聚合酶链反应为主，但此方法耗时及耗材，且需有实验室设备才能完成，对于目前渔民来说诸多不便且成本较高。因此，若能开发出可携带的快速诊断试片，仅需肉眼观察即可判断是否感染病症，除了可以早期诊断疾病的存在，减少养殖户在购买被感染的鱼苗时的经济损失，基于各国检疫及因应出口贸易竞争的需求，在市场上亦极具产业利用性。
发明内容
本发明的特征在于发现一段新颖的氨基酸序列，其为虹彩病毒的抗原决定区位之一，根据此抗原决定区位制造出来的单株或多株抗体，可进一步应用于各种检测套组及检测方法，包括快速诊断试片，克服传统的细胞培养与病毒分离等繁琐步骤的缺点，可以更快速、更经济的侦测水生动物虹彩病毒的感染。
因此，本发明的一个实施方案为一来自于虹彩病毒的核衣蛋白且具有抗原活性的多肽，其系由SEQ ID NO：13的氨基酸序列所组成。
本发明的另一实施方案为一组合物，其包含如上述的多肽。
本发明的另一实施方案为一种以上述组合物所制造的抗体，以及制造抗体的方法。
本发明的其它实施方案为一种检测虹彩病毒感染的方法，其系使用如上述的抗体。
本发明的又一实施方案为一种检测虹彩病毒的套组，其包含：
(1)一支持固相；
(2)如权利要求第5项所述的抗体，其系附着于前述支持固相上；
(3)讯号产生工具，其中该讯号产生工具能操作性地与虹彩病毒或其蛋白质片段结合，并与前述(2)的抗体结合而产生讯号；
(4)相关试剂及清洁剂。
本发明的其它实施方案为一种组合物，其包含如上述的抗体。
本发明的又另其它实施方案为一种治疗或预防虹彩病毒感染的医药组合物，其系包含如上述的抗体与医学上可接受的载体。
本发明的另一实施方案为一饲料添加剂，其系包含如上述的抗体。
附图简述
前文的所述以及实施方式可藉由附图达到更好的说明效果。为了加强本发明的说明，将适当的实施例的图式列举于此。要注意的是，本发明并不受限于列举于此的说明。
图1为使用本发明的单株抗体进行间接免疫荧光测试的结果，左上、 右上与左下分别为3株不同实验室编号的单株抗体，标号分别为M1、M2、M3，右下C-为阴性控制组。
图2为使用本发明的单株抗体进行西方墨点转渍法测试的结果，图2A、2B与2C分别为250倍、2000倍及5000倍稀释的抗体的结果。M表示为标准蛋白质分子量标志(KDa)，道1与道2的样本皆为虹彩病毒颗粒，道3的样本为老鼠组织，道4的样本为石斑鱼检体。
图3为使用本发明的单株抗体进行免疫墨点法的结果。实线黑框内的六十孔为60株基因型别属于Ranavirus病毒属，虚线黑框内的二十孔为20株基因型别属于Megalocytivirus病毒属。长短虚线框内，C+栏为基因型Ranavirus的病毒，第一格为力价为105.8TCID50/ml的病毒，往下进行5次10倍连续稀释，C-为阴性的石斑鱼检体当控制组。
图4为使用本发明的抗体，针对Ranavirus及Megalocytivirus的核衣蛋白中共同保留区域的氨基酸片断所合成11段多肽，进行免疫墨点法的结果。
图5A为本发明的快速诊断试片组件图。
图5B为本发明的快速诊断试片结果判读说明。
图6A为使用本发明的快速诊断试片，实际检测病毒力价为109TCID50/ml(标号1)、108TCID50/ml(标号2)、107TCID50/ml(标号3)、106TCID50/ml(编号4)、105TCID50/ml(编号5)、104TCID50/ml(标号6)的结果，标号7的试片为阴性检体。
图6B为使用机动型扫描式快速检验分析仪，分析图6A试片检测线数值与病毒力价的关系图。
图7为使用快速检验试剂检验四种不同样本的结果，编号1试片样本为病毒力价为108TCID50/ml的虹彩病毒，编号2试片样本为淋巴囊肿病毒(Lymphocystivirus)病毒属，编号3试片样本为阴性鱼体乳剂，以及编号4试片样本为神经坏死病毒(nervous necrosis virus)。
主要组件符号说明
1 样本吸收垫
2 连接垫
3 塑料支持底座
4 吸收垫
5 硝纤维膜
6 测试线
7 控制线
实施方式
本发明提供了一来自于虹彩病毒的核衣蛋白且具有抗原活性的多肽，其具有SEQ ID NO：13氨基酸序列，或是在结构及功能上的变体。术语“在结构及功能上的变体”意指一个和SEQ ID NO：13氨基酸序列具有至少80％以上相似度的多肽，且该多肽具有抗原的活性。此变体可由SEQ ID NO：13的突变而来，例如在一个不影响抗原活性的位置进行突变。因为SEQ IDNO：13只具有17个氨基酸，因此熟知技艺的人士可以轻易地推测出其有关或无关抗原活性的氨基酸序列位置，例如：利用点突变分析。进一步也可利用以相似化学性质的氨基酸加以取代，而不影响到多肽的活性。任何SEQID NO：13的结构上变体也被预期保留其抗原的活性。该结构上的变体可以藉由实施例4的方法来检测其活性。
本发明的多肽来源可由虹彩病毒核衣蛋白纯化，也可由核苷酸的重组方法或化学合成所取得。
因为本发明多肽具有抗原活性，因此可进一步包含于一组合物中，该组合物可与动物饲料一起给予动物口服使用，促进该动物体内产生对抗虹彩病毒的抗体，达到治疗或预防的效果。该组合物亦可与虹彩病毒疫苗一起使用，不论是口服或是注射给予，同样可以促进动物体内产生对抗虹彩病毒的抗体，加强疫苗的效果。熟知技艺的人士可根据本说明书揭露的内容，自行完成组合物的配方。
术语“抗体”指的是一种存在于血液或体液中的免疫球蛋白，其功能为辨识外来物质，如细菌、病毒或特殊结构的分子，引发后续免疫反应。此外，抗体亦具有中和抗原分子的能力，可促使吞噬细胞活化，将其所辨认的物质分解。抗体主要是由B细胞所产生，当B细胞辨识到某抗原序列， 即会分化为浆细胞，并产生可辨识该抗原序列的抗体。如上所述，本发明的包含本发明多肽的组合物具有活化B细胞的特性，因此亦可用于制备单株或多株抗体。例如：将本发明的组合物与佐剂注射入动物体内，于一段时间后采集血清，进一步纯化即可得到多株抗体；或分离上述已免疫动物的脾脏细胞，与骨髓瘤细胞共同制备为融合瘤细胞株，即可得到单株抗体。以包含有本发明多肽的组合物制备单株或多株抗体的方法，熟知技艺的人士可运用一般免疫学的知识与经验，在不进行过度实验的情况下自行完成。
根据本发明所揭露的多肽序列制备所得的单株或多株抗体，可同时侦测到虹彩病毒属Ranavirus与Megalocytivirus。国内的田野间流行的虹彩病毒依其基因型的不同，可区分为GIV本土株(Ranavirus)、RSIV-like近日本株型(Megalocytivirus)及ISKNV-like株(Megalocytivirus)三种病毒株。因此，本发明提供一种检测虹彩病毒感染的方法，其系为使用本发明的多肽序列制备所得的单株或多株抗体。根据本发明的实施例5，本侦测方法可广范围的辨识国内流行的虹彩病毒属，包括26株Ranavirus与8株Megalocytivirus病毒属。
本发明所指的检测方法，可应用于各种目前已知使用抗体的免疫辨识方法，例如：固相免疫色层分析法、间接免疫荧光染色法或酵素结合免疫吸附法。此外，为了免除传统检验须实验室设备的麻烦，本发明的抗体可与快速检验试片结合，仅需滴入检测液体，并由肉眼判断结果。
因此，本发明进一步提供一种检测虹彩病毒的套组，其包含：(1)一支持固相；(2)如权利要求5所述的抗体，其系附着于前述支持固相上；(3)讯号产生工具，其中该讯号产生工具能操作性地与虹彩病毒或其蛋白质片段结合，并与前述(2)的抗体结合而产生讯号；以及(4)相关试剂及清洁剂。
术语“支持固相”为一承载或装载反应材料的固体装置，该支持固相可为反应盘、微球体、杂交膜或试纸。本发明的套组，可利用直接或间接免疫方法进行。不论以直接或间接免疫方法进行，当抗体辨识到抗原时，可由讯号产生工具利用呈色或荧光的方式，表现出让检测者得以判断检体受到感染的阳性讯号，其中该讯号产生工具可为过氧化氢、碱性磷酸酶、β-半乳醣甘酶、生物素或荧光标志。
本发明的实施例7，为一快速诊断试片的范例。其中，该快速诊断试片的试纸匣，为台湾元生生物科技股份有限公司所开发与提供，该试片匣已有两个台湾专利，专利号分别为M303000与M315830。本发明的单株抗体以适当的浓度固定于一胶体金上，待干燥后再喷洒至玻璃纤维上，风干后按照M303000与M315830揭露的组装方法与其它组件进行组装，完成的快速诊断试片如图5A所示。本领域熟知技艺的人士可根据本身需求，自行设计套组结构，应用本发明的抗体进行虹彩病毒感染的检测。
因为此抗体在活体中抗病毒的能力具有高度敏感性与特异性，本发明的抗体可当作一种活性成分，使用于医药组合物中，并用来预防或治疗虹彩病毒感染。
因此，本发明包含一种治疗或预防虹彩病毒感染的医药组合物，其系包含如上述的抗体与医学上可接受的载体。
本发明的医药组合物可由传统上已知的方法，和一种或多种医药可接受的携带物制造而成。术语“医学上可接受的载体”意指包含任何标准医药上可接受的载体。这些载体可以是，但不受限于下列物质：食盐水、盐类缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇或是以上的组合物。
本发明的医药组合物可由投与的途径选择制造成任何适当的形式。举例来说，适合口服投与的固体形式，如：药丸、胶囊、颗粒、锭剂和粉末，或是液体形式，如：饮料、糖浆、溶液、以及悬浮液。其它非口服的投与形式可包括无菌液、乳剂和悬浮液。
除了标准的载体，本发明的口服医药组合物可添加一种或多种常用于口服配方的赋形剂，例如：表面活性剂、溶解剂、稳定剂、乳化剂、浓缩剂、色素、甜味剂、风味添加剂以及防腐剂。这些皆为熟悉技艺的人士所了解的赋形剂。
除了口服给予，该医药组合物亦可以固体或是液体的形式，加入水生动物所生存的水生环境中，中和存在于水中的虹彩病毒，减少水生动物遭受虹彩病毒感染的机率。
除了医药组合物，本发明的抗体亦可作为一饲料添加剂，添加于动物饲料中给予动物口服使用。
本发明中的方法，投与的多肽或抗体剂量，可根据动物体型、周龄和接受治疗的受体的情况，由饲养者或专家自行决定的。
本发明将由下列实施例做进一步的说明，但实际发明并不受限于该用于展示的实施例。
实施例1：病例收集及分析
本发明所使用的病例，为自2001年至2007年，于南部淡水及海水鱼养殖场收集重要养殖经济鱼种的发病病例，再经聚合酶链反应检测及病毒分离，确认其为虹彩病毒感染阳性病例。
病毒核酸萃取
萃取步骤应用
DNA Mini Kit(QIAGEN，Germany)进行。首先将检体与100μL乳剂加入1.5mL的微量离心管中，再加入100μL ATL试剂及20μL Proteinase k振荡，并置于56℃加热30分钟，再加入200μL的ATL试剂震荡15秒，置入70℃加热10分钟。接着，加入200μL 100％的酒精，震荡15秒后以8,000rpm，25℃离心1分钟。取一个spin column将样品加入其中，用8,000rpm，25℃离心2分钟，丢弃收集管及废液。加入500μL A W1，以8,000rpm，25℃离心2分钟，丢弃收集管及废液。再加入500μL AW2，以1,4000rpm，25℃离心5分钟，丢弃收集管及废液。最后加入200μL的AE buffer以8000rpm，25℃离心2分钟，收集滤过液，可得到病毒DNA进行聚合酶链反应。
聚合酶链反应
于0.2mL离心管中加入5μL的待测样品、0.5μL Taq DNA聚合酶(5units/μl；
Gauthershurg，MD)、5μL 10x PCR缓冲液(200mMTris-HCl pH 8.4、500mM KCl及1％Triton x-100)、1.5μL的25mM MgCl2、1μL的10mM dNTP混合液(Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ)及2.5μL的10M引物，各组反应的引物序列如表1。最后加入37.5μL的无菌去离子水，使总反应液达到50μL。将上述所列的参与反应物置于管中振荡使混合均匀，经短暂快速离心，使所有反应试剂均位于微量离心管底部后，放入聚合酶链反应器(MJ Research，INC，USA)中进行聚合酶链反应。每一循环的反应条件 为:先以94℃进行2分钟，再依次为94℃40秒，粘合温度(GIV:54℃；RSIV：58℃；ISKNV：47℃)50秒及72℃1分钟，共进行40个循环增幅反应，最后以72℃作用10分钟将未完成的反应完成，并将聚合酶链反应产物以2％洋菜胶(FMC，Rockland，M.E)进行电泳分析，确认增幅产物的长度，并评估是否为虹彩病毒感染阳性病例。经聚合酶链反应确认后，共有159株为虹彩病毒感染阳性病例，共计17种鱼类，整理如表2所示。
表1引物序列表
表2
实施例2：病毒分离及增值
将海水鱼病材以研钵及杵加以研磨，并加入10倍Leibovitz’s L-15培养液，取上清液以0.45μm过滤膜过滤，接种0.5ml过滤液于自行开发的石斑鱼肾脏及胚胎细胞株(7GK)及E11细胞株进行虹彩病毒、野田病毒的分离及增殖，于25℃感作1小时，加入含2％胎牛血清的L-15培养液，每日观察细胞病变的出现。病毒力价测试方法依据Reed and Muench Methods(1938)进行鉴定。
实施例3：病毒纯化
将增殖完的病毒液经冷冻解冻3次，以12000xg于4℃离心40分钟将细胞碎片进行初离心，细胞碎片以TN缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5)溶解再经超音波击碎，经4000xg离心20分钟，取上清液并与第1次初离心的上清液以10000xg于4℃离心8小时，取病毒的初沉渣后加入已先配置及灌注的15％至60％蔗糖梯度中，并以150000xg于4℃的高转速下离心1小时，即可分离出病毒沉积线，以24号针抽出病毒沉积线，并溶解于TN缓冲液中，以100000xg离心2小时，最后以TN缓冲液将病毒纯化的蛋白溶出，进行病毒浓度的测定。
实施例4：单株与多株抗体的产制与纯化
量产单株与多株抗体
将纯化的病毒以1mg/ml、0.5mg/ml混以弗氏完全佐剂(Freundcomplete adjuvant)免疫纽西兰白兔，经2周后再以相同浓度的病毒混以弗氏不全佐剂(Freund incomplete adjuvant)再补强免疫，每次补强间隔2周，经补强免疫4次时，采集兔子血清进行抗体力价分析。于兔子抗体力价大于104倍时，以26号针于兔子耳静脉进行采血，进行后续抗体的量产及纯化。单株抗体的量产为将单株化的融合细胞打入Balb/c老鼠以生产腹水，进行后续抗体的量产及纯化。
纯化单株与多株抗体
将取得的老鼠腹水及兔子血清以
protein A进行抗体的纯化。首先将管柱注入适量体积Affi-Gel Protein A胶体，以结合缓冲液A(Bindingbuffer A)(1.5M Glycine/NaOH buffer，3M NaCl，PH＝9.0)先平衡管柱，样品先以结合缓冲液A混合，再以0.5ml/min的流速将样品加入管柱中。接着以结合缓冲液A清洗管注后，加入析出缓冲液(Elution buffer)(0.1M Sodium citratebuffer PH＝2.5)，将样品中IgG冲洗出并加入中和缓冲液(Neutralizationbuffer)(1M Tris/HCl buffer，PH＝9.0)，最后再以回收缓冲液(Regenerationbuffer)冲洗管柱，回复管柱内的电性，并以含有0.05％NaN3的PBS溶液 冲洗管柱后加以保存。纯化出的蛋白质进行抗体浓度的定量。
实施例5：抗体活性测试与特性鉴定
间接免疫荧光测试(Indirect Immunofluorescence Assay，IFA)
将107TCID50/ml的虹彩病毒的病毒液接种于自行开发的石斑鱼肾脏细胞(7GK)，7GK细胞以1倍PBS溶液进行清洗3次后，于25℃感作1小时，加入含2％胎牛血清的L-15培养液进行病毒增殖。经接种48小时后，以80％丙酮固定细胞15分钟，以1倍PBS溶液进行细胞清洗3次，于37℃加入经1000倍稀释的实施4纯化所得的单株抗体。于适当时间后，以1倍PBS溶液进行细胞清洗3次，加入经1000倍稀释的山羊抗老鼠标示FITC(Flourescein Isothiocynate)免疫酵素荧光抗体进行结合，最后于倒立荧光显微镜(ZEISS，Axiovert135)观察荧光讯号(图1)。
如图1所示，3株单株抗体(实验室标号为M1、M2、M3)皆可于细胞核及细胞质内侦测到特异性荧光讯号，显示本发明的单株抗体可使用于间接免疫荧光测试的方法，且的确具有抗体的活性。C-为阴性控制组。
西方墨，点转渍法测试(Western Blotting)
以4-12％SDS胶体将经蔗糖纯化完整的病毒颗粒，区分成不同分子量大小病毒蛋白分子，并以不同浓度的本发明的抗体，如250倍、2000倍及5000倍稀释的抗体进行侦测，再以1000倍标示过氧化酶的山羊抗老鼠的IgG(goat-anti mouse IgG-HRP)进行结合，最后再以DAB(3，3’-diaminobenzidine)进行呈色。图2A、2B与2C分别为250倍、2000倍及5000倍稀释的抗体的结果。M表示为标准蛋白质分子量标志(KDa)，道1与道2的样本皆为虹彩病毒颗粒，道3的样本为老鼠组织，道4的样本为石斑鱼检体。
结果如图2A-C所示，可见于2000及5000倍的单株抗体稀释倍数下，于分子量位于58KDa的位置可见清楚的呈色，显示本发明的单株抗体所辨认的蛋白分子为58KDa。该蛋白分子经由质谱仪(MALDI-TOF MS)进行氨基酸定序后，将定序的结果于英国Matrix Science公司所研发的Mascot蛋白质数据库进行鉴定，结果为石斑虹彩病毒的核衣蛋白(major capsid protein)。
免疫墨点法(Dot blotting)测试
将0.2μm硝化纤维膜(nitrocellulose membrane，Bio-Rad Laboratories，USA)以二次蒸馏水先润湿2分钟，再将硝化纤维膜置入Bio-Dot片匣中，加入上述以聚合脢连锁反应筛选出的60株基因型别属于Ranavirus病毒属(实线方框)，20株基因型别属于Megalocytivirus病毒属(虚线方框)的野外病材样品，再加入阴性的石斑鱼细胞当控制组(C-)及阳性病毒分离液(C+)，每孔加入100μL溶液，经抽空气的马达将上述样品进行过滤使其抗原及多肽能沉积于硝化纤维膜上，接着以2％牛血清蛋白(Bovine serum albumin)于37℃阻断1小时，加入经5000倍稀释的本发明的单株抗体，于37℃作用1小时进行结合反应。以1倍PBST(PBS含0.05％(v/v)Tween 20)清洗硝化纤维膜3次，加入山羊抗老鼠标示过氧化脢于37℃作用1小时进行结合反应。最后以1倍PBST(PBS中含0.05％(v/v)Tween 20)清洗硝化纤维膜3次，加入0.1％DAB(Diaminobenzidine，Sigma D-5637，USA)及30％ H2O2(Merck Ltd，Germany)进行呈色反应，至背景呈阳性棕色讯号结束。(图3)
如图3所示，实线黑框内的六十孔为60株基因型别属于Ranavirus病毒属，虚线黑框内的二十孔为20株基因型别属于Megalocytivirus病毒属，经由免疫墨点法测试，利用本发明的单株抗体可成功侦测到26株Ranavirus与8株Megalocytivirus。长短虚线框内，C+栏为基因型Ranavirus的病毒，第一格为力价为105.8TCID50/ml的病毒，往下进行10倍连续稀释后，本发明的单株抗体经5000倍稀释后，可成功侦测至103.8TCID50/ml(第三格)的病毒，C-为阴性的石斑鱼检体当控制组。
实施例6：鉴定抗原决定区位序列
将Ranavirus及Megalocytivirus的核衣蛋白中共同保留区域的氨基酸片断合成11段多肽，其序列组合如表3所示。其详细实验步骤：将0.2μm硝化纤维膜(nitrocellulose membrane，Bio-Rad Laboratories，USA)以二次蒸馏水先润湿2分钟，再将硝化纤维膜置入Bio-Dot片匣中，加入上述11段合成 多肽，分别稀释成1mg/ml(道1)、0.1mg/ml(道2)与0.01mg/ml(道3)，再加入阴性的石斑鱼细胞当控制组(C-)及阳性病毒分离液(基因型别属于Ranavirus病毒属)(v1)与阳性病毒分离液(基因型别属于Megalocytivirus病毒属)(v2)，每孔加入100μL溶液，经抽空气的马达将上述样品进行过滤使其抗原及多肽能沉积于硝化纤维膜上，接着以2％牛血清蛋白(Bovineserum albumin)于37℃阻断1小时，加入经5000倍稀释的本发明的单株抗体，于37℃作用1小时进行结合反应。以1倍PBST(PBS含0.05％(v/v)Tween20)清洗硝化纤维膜3次，加入山羊抗老鼠标示过氧化脢于37℃作用1小时进行结合反应。最后以1倍PBST(PBS中含0.05％(v/v)Tween20)清洗硝化纤维膜3次，加入0.1％DAB(Diaminobenzidine，Sigma D-5637，USA)及30％H2O2(Merck Ltd，Germany)进行呈色反应，至背景呈阳性棕色讯号结束。
如图4所示，编号为P7的多肽于道1与道2呈现阳性棕色讯号，显示本发明的抗体所辨认的抗原序列为PIKSASLTYENTTRLAN(SEQ ID NO：13)，另一方面显示本发明发现了一段新颖的多肽序列，其为虹彩病毒一抗原决定区位，且同时存在于Ranavirus及Megalocytivirus的中，因此本发明的抗体可同时检测到Ranavirus及Megalocytivirus两种虹彩病毒属的存在。
表3 共同保留区域的氨基酸片断
| 多肽编号 | 氨基酸序列 | 长度 |
| P1 | GAGVTSGFIDLATYD(SEQ IDNO：7) | 15 |
| P2 | GNPAFGQEFSVGV(SEQ ID NO：8) | 13 |
| P3 | AFGQEFSVGVPRSGDYV(SEQ IDNO：9) | 17 |
| P4 | CGLALPTVSLPYNEIRI(SEQ IDNO：10) | 17 |
| P5 | MRFSHAVKALFF(SEQ ID NO：11) | 12 |
| P6 | MVQNVTHKSVGSNYTC(SEQ ID | 16 |
| NO：12) | ||
| P7 | PIKSASLTYENTTRLAN(SEQ IDNO：13) | 17 |
| P8 | LNVGSVHPSGSTNYGRLTNA(SEQ ID NO：14) | 20 |
| P9 | MSPEAVTAAAGGGGNNS GYT(SEQ ID NO：15) | 20 |
| P10 | NGTIRWTKNLMHNLVEEV(SEQ ID NO：16) | 18 |
| P11 | MSPEALPYNNEIRILA(SEQ IDNO：17) | 16 |
实施例7：快速诊断试片特异性与敏感性测试
有鉴于本发明的抗体可辨认大范围的Ranavirus及Megalocytivirus两种基因型的病毒属，加上其高敏感性的特性，因此本发明将该抗体进一步应用于虹彩病毒的快速诊断试片。
有关快速诊断试片的试纸匣，为台湾元生生物科技股份有限公司所开发与提供，该试片匣已有两个台湾专利，专利号分别为M303000与M315830。本发明的单株抗体以30μg/ml的浓度固定于60-100nm的胶体金上，待干燥后再喷洒至1.2厘米宽、30厘米长的玻璃纤维上，每厘米喷洒300-400μL，风干后即可按M303000与M315830揭露的组装方法与其它组件进行组装，完成的快速诊断试片如图5A所示。
本发明的快速诊断试片最大的优点在于仅需由肉眼判断，即可判断欲检测的样本是否已被虹彩病毒感染。如图5B所示，此快速诊断试片可显示出三种检测结果，根据样本流动方向来看，若仅在后方出现一条线，表示为阴性检体；若前后各出现一条线，则为阳性检体；若仅在前方出现一条线，则表示本次测试失败。
样本检测敏感性测试
利用已知的病毒力价为109TCID50/ml的虹彩病毒，经10倍连续稀释至 103TCID50/ml，取100μL含有上述病毒的液体，加入快速诊断试片中，经15至30分后以目视测试线判定结果，诊断试片的实际结果如图6A所示，其中标号1-6的试片依序为检测病毒力价为109TCID50/ml、108TCID50/ml、107TCID50/ml、106TCID50/ml、105TCID50/ml、104TCID50/ml的结果，标号7的试片为阴性检体。由图6A可知，在检测稀释为病毒力价为105TCID50/ml的虹彩病毒检体的试片上，开始出现代表阳性反应的测试线，表示本发明的快速诊断试片可检测的最低病毒力价为105TCID50/ml。
此外，使用一机动型扫描式快速检验分析仪(
元生生物科技股份有限公司提供，台湾专利号为I245899)可利用扫描装置对试纸进行扫描，并得到对应于该检体的检验信号，经由模拟讯号转号即可得到一客观数值，数值越大则表示检验信号越深(棕色越深)。
利用该机动型扫描式快速检验分析仪，针对上述标号1-7的快速检验试片的测试线进行扫瞄，即可得到病毒力价与读值的关系，结果如图6B所示。根据图6B，其读值分别为271、143、60、16、4及0，可知病毒力价与读值呈现高正相关性，显示本发明的快速检验试片能以测试线颜色深浅作为病毒力价的参考，同时亦证实本发明的快速诊断试片可检测的最低病毒力价为105TCID50/ml。
此外，如表1所列，自2001年至2007年，于南部淡水及海水鱼养殖场收集重要养殖经济鱼种的发病病例，并经聚合酶链反应确诊的159株检体，使用本发明的快速诊断试片可检测出138株为阳性反应，显示其敏感性高达86.8％。
特异性分析
为检测本发明的抗体与快速检验试剂是否对于具有特异性，使用四个样本分别使用快速检验试剂进行检测。第1个样本为病毒力价为108TCID50/ml的虹彩病毒(标号1)，第2个样本为淋巴囊肿病毒(Lymphocystivirus)属(编号2)，第3个样为阴性鱼体乳剂(标号3)，第4个样本为Nodavirus病毒属(标号4)，又名病毒神经坏死病毒(nervous necrosisvirus)，与虹彩病毒并列造成水产养殖上重大损失的二种最重要的病毒。诊 断试片的实际结果如图7所示，
由图7可知，仅有编号1，即使用虹彩病毒的检体，才会出现表示阳性反应的检测线，显示本发明的抗体与快速检验试剂具有高度特异性，可专一辨认到虹彩病毒属病毒。
本领域技术人员将可在不背离本发明精神的下，根据实施例进行改变和修改。要注意的是，本发明并不受限于说明书中实施例所揭露的范围，而涵盖于其它根据申请范围内揭露的所有变化的形式。
序列表
<110>黄金城
<120>虹彩病毒毒抗原活性多肽及其用途
<130>NVR0002TW
<160>17
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>引物
<400>1
ctgctcgana caaatagg 16
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>引物
<400>2
agtgtccttg cgccgtcy 18
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>引物
<400>3
acccgtgaca caggccttgc a 21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>引物
<400>4
ccgtagttgg tcgagcccat a 21
<210>5
<211>15
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>引物
<400>5
<210>6
<211>15
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>引物
<400>6
<210>7
<211>15
<212>PRT
<213>人工合成
<220>
<223>根据虹彩病毒所设计之合成氨基酸序列
<400>7
<210>8
<211>13
<212>PRT
<213>人工合成
<220>
<223>根据虹彩病毒所设计之合成氨基酸序列
<400>8
<210>9
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<220>
<223>根据虹彩病毒所设计之合成氨基酸序列
<400>9
<210>10
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<220>
<223>根据虹彩病毒所设计之合成氨基酸序列
<400>10
<210>11
<211>12
<212>PRT
<213>人工合成
<220>
<223>根据虹彩病毒所设计之合成氨基酸序列
<400>11
<210>12
<211>16
<212>PRT
<213>人工合成
<220>
<223>根据虹彩病毒所设计之合成氨基酸序列
<400>12
<210>13
<211>17
<212>PRT
<213>人工合成
<220>
<223>根据虹彩病毒所设计之合成氨基酸序列
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<210>14
<211>20
<212>PRT
<213>人工合成
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<223>根据虹彩病毒所设计之合成氨基酸序列
<400>14
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<211>20
<212>PRT
<213>人工合成
<220>
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<212>PRT
<213>人工合成
<220>
<223>根据虹彩病毒所设计之合成氨基酸序列
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<210>17
<211>16
<212>PRT
<213>人工合成
<220>
<223>根据虹彩病毒所设计之合成氨基酸序列
<400>17
Claims (22)
1.一来自于虹彩病毒的核衣蛋白且具有抗原活性的多肽，其是由SEQ ID NO：13的氨基酸序列所组成。
2.一组合物，其包含权利要求1所述的多肽。
3.如权利要求2所述的组合物，其中该组合物可与动物饲料或虹彩病毒疫苗共同使用。
4.一种利用权利要求2所述的组合物制造抗虹彩病毒抗体的方法。
5.一种分离的抗虹彩病毒抗体，其是由权利要求4所述的方法制造。
6.如权利要求5所述的抗体，其中该抗体为单克隆抗体。
7.如权利要求5所述的抗体，其中该抗体为多克隆抗体。
8.如权利要求5所述的抗体，其中该抗体能够与虹彩病毒Ranavirus属结合。
9.如权利要求5所述的抗体，其中该抗体能够与虹彩病毒Megalocytivirus属结合。
10.如权利要求5所述的抗体，其中该抗体能够同时侦测到虹彩病毒Ranavirus属与Megalocytivirus属。
11.如权利要求5所述的抗体在制备用于检测虹彩病毒的组合物中的用途。
12.如权利要求11的用途，其中对虹彩病毒感染的检测是通过固相免疫色层分析法、间接免疫荧光染色法或酵素结合免疫吸附法。
13.一种检测虹彩病毒感染的试剂组，其包含：
(1)一支持固相；
(2)如权利要求5所述的抗体，其附着于前述支持固相上；
(3)讯号产生工具，其中该讯号产生工具能操作性地与虹彩病毒或其蛋白质片段结合，并与前述(2)的抗体结合而产生讯号；
(4)相关试剂及清洁剂。
14.如权利要求13所述的试剂组，其中能够利用直接或间接免疫方法进行。
15.如权利要求13所述的试剂组，其中该支持固相为反应盘、微球 体、杂交膜或试纸。
16.如权利要求13所述的试剂组，其中该讯号产生工具为过氧化氢、碱性磷酸酶、β-半乳醣甘酶、生物素或荧光标志。
17.一组合物，其包含权利要求5所述的抗体。
18.如权利要求17所述的组合物，其中该组合物能够与动物饲料添加剂、虹彩病毒治疗剂或虹彩病毒疫苗共同使用。
19.一种治疗或预防虹彩病毒感染的医药组合物，其包含如权利要求第5项所述的抗体与医学上可接受的载体。
20.如权利要求19所述的医药组合物，其为以口服的方式给予动物使用。
21.如权利要求19所述的医药组合物，该医药组合物能够加入水生动物所处的水生环境中，使其中和虹彩病毒。
22.一饲料添加剂，其包含如权利要求5所述的抗体。
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