CN101732711A - 一种喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗及其制备方法。该疫苗为全病毒、裂解病毒、病毒体或病毒样颗粒的灭活疫苗抗原，流感多价疫苗抗原为：流感五价，即H1N1、H3N2、B、H5N1和甲型H1N1，或在此基础上任意组合的多价疫苗抗原；或在此基础上包含了所述HA选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16，所述NA选自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9亚型的所有组合得到的流感多价疫苗抗原。本发明疫苗中流感多价灭活疫苗抗原HA含量为1.0-15.0μg/0.2ml/人份，可有效的预防人普通流感、高致病性H5N1人禽流感、甲型H1N1流感以及其它亚型流感病毒的感染。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及一种疫苗及其制备方法，特别涉及一种喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
流行性感冒是由流感病毒引起的一种损害呼吸系统为主的疾病，在世界范围内广泛流行，是严重危害人类健康的重要传染病之一。流感病毒感染通过病毒体表面HA蛋白附着于含唾液酸细胞受体(糖蛋白和糖脂)而被引发。NA蛋白介导唾液酸受体的加工，且病毒对细胞的侵入依赖于HA依赖性受体介导的胞吞作用。在内化的含流感病毒体的内体的酸性境界中，HA蛋白经历构象变化，导致病毒和宿主细胞膜融合，随后病毒脱壳，M1蛋白在M2的介导下从核壳相关核糖核蛋白(RNP)释放，进入细胞核以进行病毒RNA合成。针对HA分子的抗体可以通过中和病毒感染性来预防病毒感染，而针对NA蛋白的抗体介导它们对病毒复制早期步骤的作用。
疫苗是预防和控制流感最有效的手段。迄今为止，流感疫苗经历了60多年的发展历程，在人类与传染病的斗争中发挥了重要作用。目前得到许可的灭活甲型和乙型流感病毒疫苗是作为供非消化道施用的三价疫苗。这些三价疫苗是在含胚鸡卵尿囊腔中作为单价的总物料产生，通过速率区带离心或柱层析纯化，用福尔马林或β-丙内酯灭活，然后配制成特定年份人群中流行的两株甲型和乙型流感病毒株的混合物。现有的商品化流感疫苗是全病毒(WV)或亚病毒体(SV，裂解或纯化的表面抗原(split or purified surfaceantigen))病毒疫苗。WV疫苗含有完整的灭活病毒体。用诸如磷酸三正丁酯等溶剂处理过的SV疫苗(Flu-Shield，Wyeth-Lederle)含有几乎所有的病毒结构蛋白和一些病毒包膜。用TritonX-100溶解的SV疫苗(Fluzone，Sanofi-Aventis；Fluvirin，Novartis)主要含有HA单体、NA、M1和NP的聚集物，尽管存在残余量的其它病毒结构蛋白。2003年6月，FDA对一种活的减毒冷适应病毒疫苗(FluMist，MedImmune)授予了销售许可，批准其作为鼻内投药疫苗用于2-49岁的健康人群中针对甲型及乙型流感病毒所引起的疾病的自动免疫接种和预防的商业应用。此外，已经开发了数种重组产品作为候选的重组流感疫苗。这些手段均着眼于甲型流感病毒HA和NA蛋白的表达、生产和纯化，包括使用杆状病毒感染的昆虫细胞(Crawford et al，1999；Johansson，1999；Treanor et al.，1996)，病毒载体(Pushko et al.，1997；Berglund et al.，1999)，和DNA疫苗构建体(Olsen et al.，1997)表达这些蛋白。因此，随着现代免疫学方法的日新月异，一种具有更强交叉免疫保护的喷鼻流感五价或多价灭活疫苗应运而生。
回顾历史，上个世纪的3次流感大流行，给世界带来的灾难性后果至今令人触目惊心。据WHO报道，每年全球死于流感的有25万-50万人。在正常的流行季节，约10％的人口即5亿多人患流感，目前还未找到十分理想的防治药物，接种流感疫苗仍是当今预防流感的有效措施。近年来，高致病性H5N1亚型人禽流感病毒跨种感染人的事件，并显示了人传人的证据，给人类健康和生命安全带来严重威胁。特别是，2009年4月以来美国、墨西哥等多国出现的甲型H1N1流感疫情在全球肆虐，使人类陷入流感暴发的恐慌之中。6月11号WHO将甲型H1N1流感的警戒级别提升到最高级--6级。与此同时，WHO要求各国要严加对季节性流感病毒(H1N1、H3N2和B型)、高致病性H5N1亚型人禽流感以及甲型H1N1流感进行监控，并应对潜在发生的流感大流行做好充分准备。为此，有效预防这些流感亚型的随机重配和混合感染成为当今世界科学家们面临的重大科学难题。因此，喷鼻免疫的人用流感五价(H1N1、H3N2、H5N1、B型和甲型H1N1)及多价灭活疫苗的研制迫切又极为重要。
发明内容
本发明目的在于提供一种喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗，本发明的目的还在于公开该疫苗的制备方法和应用。
本发明目的是通过如下技术方案实现的。
本发明疫苗包括流感五价或多价灭活疫苗抗原和黏膜免疫佐剂。
其中，流感五价或多价灭活疫苗抗原为全病毒、裂解病毒、病毒体或病毒样颗粒的灭活疫苗抗原，流感多价疫苗抗原为：流感五价，即H1N1、H3N2、B、H5N1和甲型H1N1，或在此基础上任意组合的多价疫苗抗原；或在此基础上包含了所述HA选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16，所述NA选自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9亚型的所有组合得到的流感多价疫苗抗原。
本发明疫苗成品中含有季节性流感(H1N1、H3N2、B型)抗原、高致病性H5N1禽流感抗原和甲型H1N1流感抗原，制备流感五价灭活(全病毒、裂解病毒、病毒体、病毒样颗粒)疫苗，疫苗中抗原为通常所使用的量，HA抗原含量1.0-15.0μg/0.2ml/人份。
其中，本发明疫苗中流感五价或多价灭活疫苗抗原HA含量为1.0-15.0μg/0.2ml/人份。
其中，黏膜免疫佐剂为水包油型(MAF)佐剂、脑膜炎双球菌蛋白体佐剂、油/水乳剂型佐剂、水包油型佐剂、油包水型佐剂、颗粒型佐剂或微生物衍生物型佐剂。
流感五价或多价灭活疫苗抗原和黏膜免疫佐剂的混合比例为1∶1-10∶1(V/V)，优选1∶1。
本发明疫苗取流感五价或多价灭活疫苗抗原和黏膜免疫佐剂，制成滴鼻剂型的液体、喷雾式的气溶胶、粉末状、乳脂状或乳化的病毒颗粒等剂型。
本发明疫苗中流感五价或多价灭活疫苗的制备方法包括如下步骤：
A.采用鸡胚培养或培养哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、Per.C6细胞、2BS细胞等)获得流感五价或多价疫苗抗原；
B.经福尔马林或β-丙内酯灭活；
C.除菌、超滤浓缩；
D.采用柱层析或连续密度梯度超离心方法进行分离纯化，得流感五价或多价灭活疫苗原液；
E.流感五价或多价灭活疫苗半成品、成品配制：例如，将流感五价或多价灭活疫苗原液配制成包括药学可接受的载体，如标准的缓冲液，稳定剂，稀释剂，防腐剂，增溶剂，也可配制成便于缓释的剂型，或添加黏膜疫苗佐剂制成流感五价或多价灭活疫苗。
其中，上述本发明疫苗中流感五价或多价灭活疫苗的制备方法中A步骤包括以下步骤：
鸡胚培养获得流感五价或多价疫苗抗原：
将季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感和甲型H1N1流感病毒疫苗株，或将季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感、甲型H1N1流感及其他亚型流感病毒株接种9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，33-35℃培养48-72h，4℃冰箱过夜冻死鸡胚，收获鸡胚尿囊液获得大量病毒，病毒收获后通过滤器进行澄清过滤，优选用孔径0.45μm的滤器进行过滤，即得流感五价或多价疫苗抗原；
或哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、Per.C6细胞、2BS细胞等)培养获得流感五价或多价疫苗抗原：
培养细胞：将用于疫苗生产的哺乳动物细胞系(如Vero细胞、MDCK细胞、Per.C6细胞、2BS细胞等)在15L转瓶内1∶6分种，培养2-3天后接种流感病毒疫苗株，包括季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感和甲型H1N1流感病毒疫苗株，或季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感、甲型H1N1流感病毒疫苗株及其他亚型流感病毒疫苗株；或在发酵罐内使用微载体培养细胞，例如，Pharmacia公司的Cytodex1TM，使用浓度可以1-5g/L，优选3g/L，维持时间可达28天；或在WAVE生物反应器中进行细胞培养；其中所述细胞由工作代细胞库复苏，经传代扩增得到；
接种病毒：在细胞密度达到3×106/ml时以任何合适的感染复数接种病毒，优选感染复数(MOI)是0.001-0.01；
增殖病毒：接种病毒后，按照常规方式培养细胞，用于细胞生长的培养基为常规培养基，如：199，MEM，可以由合适的生产商购得，可以按照已公开的配方配制合适的培养基，如无血清培养基；优选在含5％CO2的培养箱中于34-35℃培养细胞48-72小时；
收获病毒：将细胞培养达到预定的时间后，通过常规方法收集，冻融3次，离心去除细胞沉渣，由此收获病毒；
过滤：病毒收获后通过滤器进行澄清过滤，优选用孔径0.45μm的滤器进行过滤，即得流感五价或多价疫苗抗原。
其中，上述本发明疫苗中流感五价或多价灭活疫苗的制备方法中B步骤包括以下步骤：
对流感五价或多价疫苗抗原进行灭活可使用WHO规定的灭活剂和灭活条件，例如，可以采用甲醛作为灭活剂，优选使用浓度1∶3000-4000，灭活温度37℃，灭活时间为3天；也可以采用β-丙内酯(BPL)作为灭活剂，按1∶4000在2～8℃灭活2天。
其中，上述本发明疫苗中流感五价或多价灭活疫苗的制备方法中C步骤包括以下步骤：
灭活后的流感五价或多价疫苗抗原通过超滤进行浓缩，超滤膜的截留分子量优选100-300KD，浓缩倍数可达50-100倍。
其中，上述本发明疫苗中流感五价或多价灭活疫苗的制备方法中D步骤为如下方法中的一种：
A.柱层析法：将浓缩后的流感五价或多价疫苗抗原进行凝胶过滤层析，介质可以采用合适的凝胶过滤介质进行，例如德国Merk公司生产的Fractolgel，平衡液优选pH6.5-7.5的PBS；再进行离子交换层析，优选使用弱阴离子交换介质，例如Merck公司生产的Fractogel EMD DEAE，离子交换所用的缓冲盐溶液优选磷酸盐缓冲系统，平衡缓冲液优选盐浓度范围0.05-0.1M，pH6.5-7.5，含0.06-0.12M的氯化钠，洗脱缓冲液优选盐浓度0.05-0.1M，pH6.5-7.5，含0.2-0.4M的氯化钠；
B.密度梯度超离心法：使用30000g不连续密度梯度(12-60％蔗糖密度梯度)的蔗糖超速离心流感五价或多价疫苗抗原3h后，收集15-35％蔗糖界面上的乳白色条带。
其中，上述本发明疫苗中流感五价或多价灭活疫苗的制备方法中D步骤后细胞残余DNA含量低于100pg/ml，残余牛血清含量低于50ng/ml，为流感五价或多价灭活疫苗原液，即流感五价或多价灭活疫苗抗原。
其中，本发明疫苗黏膜免疫佐剂--水包油型(MAF)佐剂的原料组成为：
角鲨烯1-10％；聚氧乙烯蓖麻油0.1-2％；聚醚0.1-2％；其余为水或PBS缓冲液。
本发明疫苗黏膜免疫佐剂--水包油型(MAF)佐剂的原料组成优选为：
角鲨烯5％；聚氧乙烯蓖麻油0.5％；聚醚0.5％；其余为水或PBS缓冲液。
其中聚氧乙烯蓖麻油和聚醚可以由如下非离子型表面活性剂中的一种或几种代替：Triton(TM)类(Triton X-45，Triton X-100，Triton X-102，Triton X-114，TritonX-165，Triton X-205，Triton X-205，Triton X-305，Triton N-57，Triton N-101，Triton N-128)，聚乙二醇类(TWEEN-80和聚乙二醇其他衍生物)和酯类(Breij35，聚氧乙烯-9-月桂酯和聚氧乙烯-9-硬脂酸)。
水包油型(MAF)佐剂的制备方法为：
取上述原料混合成水溶液，经微射流均质乳化机制成乳液，颗粒度为194±76nm，经0.22μm多聚硫化物过滤器过滤除菌，于4℃下保存。
其中，本发明疫苗黏膜免疫佐剂--脑膜炎双球菌蛋白体佐剂的制备方法为：
①用1％胎牛血清的胰蛋白大豆肉汤培养脑膜炎B群2b型奈瑟氏双球菌；
②苯酚灭活的细菌，然后用6％Empigen BB去垢剂的1M氯化钙抽提，再用终浓度为20％乙醇去除核酸；
③外膜蛋白复合小泡用终浓度为45％的乙醇沉淀，沉淀通过匀浆溶解和超声溶解在1％Empigen BB的Tris-EDTA-NaCl的盐缓冲液中(0.15M的NaCl，0.01M的EDTA，0.05M的Tris-HCl，pH 8.0)；
④蛋白体通过用50％的硫酸铵沉淀三次与脑膜炎奈瑟氏双球菌的脂多糖分离进行纯化，用1％Empigen BB的缓冲液溶解沉淀；
⑤蛋白体用0.1％Empigen BB的缓冲液彻底透析，取部分蛋白体，加上样品缓冲液，进行SDS-PAGE电泳，得三种孔道蛋白，形成囊状物，为蛋白体。
其中，本发明疫苗中流感五价或多价灭活疫苗的制备方法中E步骤中水包油型(MAF)佐剂与流感五价或多价疫苗抗原的混合方法为：
将水包油型(MAF)佐剂与流感五价或多价灭活疫苗抗原按照1∶1-1∶10(V/V)，优选1∶1的比例混合，2-8℃搅拌12-36h，优选4℃搅拌24h，即制备成疫苗。
其中，本发明疫苗中流感五价或多价灭活疫苗的制备方法中E步骤中脑膜炎双球菌蛋白体佐剂与流感五价或多价疫苗抗原的混合方法为：
将脑膜炎双球菌蛋白体佐剂用1％的EmpigenBB混合，作用2h后，用0.22μm的滤器过滤；流感五价或多价疫苗抗原与佐剂按照10∶1-1∶1(V/V)，优选4∶1的比例混合，用10000MW透析袋，PBS透析8-10天，即制备成疫苗，成品中脑膜炎双球菌蛋白体佐剂的最终浓度为0.05-0.5％。
其中，本发明疫苗黏膜免疫佐剂--脑膜炎双球菌蛋白体佐剂也可以是重组PorA或重组PorB形式。
附图说明
图1：A/B型流感病毒灭活疫苗两种途径免疫血清抗体滴度比较；
图2：水包油型佐剂MAF激光粒径检测结果；
图3：从脑膜炎双球菌提取佐剂蛋白体SDS电泳图；
图4：佐剂MAF与抗原混合吸附前后电镜负染结果
A：吸附前 B：吸附后。
本发明为一种可喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗，该疫苗的主要成分为纯化的五价季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感、及甲型H1N1灭活(全病毒、裂解)抗原或所述HA选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16，所述NA选自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9任意亚型抗原多价组合和一种黏膜疫苗佐剂(既可延长抗原停留时间对黏膜细胞的靶向性，又可增强抗原提呈细胞的抗原提呈)，可有效的预防人普通流感、高致病性H5N1人禽流感、甲型H1N1流感以及其它亚型流感病毒的感染。
喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗不仅可以诱导产生系统免疫，还可以产生局部黏膜免疫。同时还具有以-下特点：(1)使用简便，适宜人人可以自己喷鼻接种，适合于流感大流行或家庭化；(2)抗原用量小，免疫原性与肌肉注射相当，避免了注射的疼痛和交叉感染；(3)一苗多效，既可预防普通流感、高致病性H5N1人禽流感，又可预防甲型H1N1流感乃至其他H1-16、N1-9亚型流感；(4)双重的效果，既可产生系统免疫，又可产生黏膜免疫；(5)副反应低，既可用于成年，又可适用儿童与老年；(6)制备简单、成本低廉，工艺流程简单，可以大大降低成本。
本发明流感五价或多价灭活疫苗的优点还在于：带有水包油型MAF、蛋白体佐剂的经鼻途径免疫的流感五价或多价灭活疫苗，在哺乳动物中可同时诱导有效的黏膜免疫和系统免疫，并使机体产生高效价sIgA和IgG、IgA，其效果较目前所应用的疫苗组分——无论是单纯的灭活病毒颗粒、加有佐剂的灭活病毒及活病毒都理想。并且经试验证明，本疫苗无任何毒副作用。
本发明流感五价或多价灭活疫苗在制备过程中是抗原在纯化之前先灭活，从而保证获得高度纯化的抗原。使用无血清培养基培养细胞制备抗原可以避免鸡胚特异性蛋白所引起的过敏反应，因此本疫苗尤其适用于如患有哮喘、过敏、免疫缺陷及老年人等高危人群，可有效地预防流感病毒感染。经不同实验动物(小鼠、雪貂和猴)注射或滴鼻途径免疫。结果证明，按第0、14天两次滴鼻或注射免疫程序，可产生高效价的IgA和IgG抗体，即可同时诱导黏膜免疫和系统免疫。可以很好的保护小鼠免受流感病毒的攻击，且亚型间产生了一定的交叉保护性。
下述实验例和实施例进一步说明但不限于本发明。
实验例1流感五价灭活疫苗的动物实验
1、免疫计划：使用不同剂型的流感五价灭活疫苗免疫小鼠。
①按照实施例9或10方法制备佐剂和流感五价灭活疫苗抗原，同时将抗原用PBS缓冲液稀释到其HA浓度为≥15μg/ml。
②12组Balb/c小鼠分别接受不同剂型的流感五价灭活疫苗经鼻免疫，每只小鼠20μl含有佐剂的抗原溶液(如表1)。分别于第0、14天进行免疫，并于第28天测定血清，唾液及肺泡中的IgG、IgA及HAI效价。
表1流感五价灭活疫苗喷鼻免疫BALB/c小鼠组别设计
2、血清、肺匀浆中的IgG、IgA及HAI效价的测定
①初次免疫后28天，取动物的唾液、肺脏及血清标本，测定每份标本的抗体效价；
②用0.5mlPBS缓冲液注入小鼠口腔，收集唾液测定其IgA含量；
③肺组织裂解标本的制备：处死小鼠，打开喉部，取出肺脏并用PBS缓冲液清洗，研磨肺组织并离心匀浆去处细胞组织，收集上清液并储存于-20℃，用于IgA效价测定；
④IgG和IgA效价测定使用商品化甲型或乙型流感病毒ELISA检测试剂盒(GenzymeVirotech)；37℃孵育2小时后加入羊抗鼠IgG或IgA抗体(Pharmigen)及底物液和显色液检测特异性IgG和IgA抗体效价；
⑤HAI效价测定：取小鼠血液，按照Palmer et al指定方法测定甲型和乙型流感病毒HAI效价；
⑥结论数据显示在没有应用佐剂的情况下，灭活的全病毒颗粒不能激发机体的IgA和IgG免疫应答，相反，如果灭活的全病毒颗粒中加入水包油型MAF或蛋白体佐剂，可激发机体产生更高效价的IgA、IgG、和HAI(表2)。
表2不同种类流感疫苗株滴鼻免疫小鼠后鼻冲洗液、肺灌洗液中IgA效价以及血清IgG和HAI效价的测定结果
S7：shanghai/7/99；S361：shanghai/361/2004；J：jiangxi/424/2004；AH：A/Anhui/1/2005；CA：california/04/2009；PL：Pulmonary lysate；
3.以水包油型MAF为佐剂的流感五价灭活疫苗不同免疫途径的比较，将疫苗分别进行鼻黏膜，肌肉注射两种不同免疫途径进行免疫。结果表明，肌肉注射虽然产生了更高效价的IgG，但却没有检测到明显的IgA抗体。但黏膜免疫却产生了高效价的IgA。IgA抗体在对抗呼吸道的传染病中发挥重要作用，说明流感疫苗黏膜免疫的途径为最佳途径。(图1)
实验例2流感五价灭活疫苗的雪貂体内效果观察
1、免疫计划，使用不同剂型的流感五价灭活疫苗免疫雪貂
①按照实施例例9或10所制备佐剂和流感五价灭活疫苗抗原混合体的方法，制备适用于雪貂喷鼻免疫的剂型，可将溶液用PBS缓冲液作适当稀释CTB、MAF或蛋白体等佐剂。
②6-10周龄的雄性和雌性雪貂，选取体重为1-2kg的用于本实验，所有这些动物在实验之前均为流感病毒血清阴性。在采血和接种前，用氯胺酮(Katamine)(25mg/kg)、阿托品(Atropine)(0.05mg/kg)和赛拉嗪(Xylazine)(2.0mg/kg)的“KAK”溶液对动物大腿内侧肌肉注射将其麻醉。一旦雪貂处于麻醉状态下，即将其置于仰侧卧位，用连有1cc结核菌素注射器的23号1针头从前腔静脉取血(体积为0.5-1.0ml)。将血液转移到装有血清分离剂和凝血活化剂的试管中，使其在室温凝结。将试管离心，移出血清，冷冻在-80℃。在接种前(第0天)、和第14天采血，并用HAI测定HI效价。
③6组雪貂，分别接受不同剂型的流感五价灭活疫苗喷鼻免疫，每只1ml含有佐剂如CTB、CTB、MAF或蛋白体的抗原溶液，双鼻孔免疫，设置注射免疫对照，按照表3的组别分别进行免疫，并于第14天测定HI效价。
2、血清HI效价测定：雪貂前腔静脉取血，按照OIE标准指定的方法进行HI测定。
3、实验结果显示，流感五价灭活(全病毒、裂解)疫苗，无论是鸡胚培养得到的，还是Vero、MDCK、Per.C6、2BS等细胞培养得到的病毒抗原，加佐剂如CTB、MAF或蛋白体等经喷鼻途径免疫雪貂后，均可产生较高的HI效价。进一步说明喷鼻免疫途径是流感五价或多价灭活疫苗可供选择的理想途径之一(表3)。
表3流感五价灭活疫苗免疫雪貂后HI效价测定结果
GMT：Geometri mean titer几何平均效价
实验例3喷鼻流感五价灭活疫苗的猴子体内效果观察
1、免疫计划，使用不同剂型的流感病毒疫苗免疫猴子
①按照实施例例9或10所制备佐剂和流感五价灭活疫苗抗原混合体的方法，制备适用于猴子喷鼻或注射免疫的剂型，可将溶液用PBS缓冲液作适当稀释CTB、MAF或蛋白体等佐剂。
②选取健康猴子用于本实验，所有这些动物在实验之前均为血清阴性。免疫之后14天，猴子通过大腿静脉取血测定HI效价。
③6组猴子，分别接受不同剂型的流感五价灭活疫苗喷鼻免疫，每只1ml含有佐剂CTB、MAF、蛋白体的抗原溶液，双鼻孔免疫动物，设置注射免疫对照，按照表4的组别分别进行免疫，并于第14天测定HI效价。
2、血清HI效价测定：猴子大腿静脉取血，按照OIE标准指定的方法进行HI测定。
3、实验结果显示，流感五价灭活(全病毒、裂解)疫苗，无论是鸡胚培养得到的，还是Vero、MDCK、Per.C6、2BS等细胞培养的病毒抗原，加佐剂如CTB、MAF、蛋白体等经喷鼻途径免疫雪貂后，均可产生较高的HI效价。进一步说明喷鼻免疫途径是流感五价或多价疫苗可供选择的理想途径之一(表4)。
表4疫苗免疫猴子后HI效价测定结果
GMT：Geometri mean titer几何平均效价
实验例4疫苗各组分在不同温度下的稳定性分析
①实验表明，各单价(MBs)流感病毒疫苗株置于室温、2-8℃，-20℃，和-80℃下分别储存6个月和12个月。
②按照Wood et al.，1997，J.Biotech.standard 5：237-247的操作规程采用单向免疫扩散法(SRD)，同时测定shanghai7/99(MB/S0104P)、jiangxi424/2004(MB/J0204P)、B/shanghai361/2004(MB/S0304P)、A/Anhui/1/2005(MB/A0404P)、A/california/07/2009(MB/C0504P)(含有Pluronic)和shanghai7/99(MB/S0104)、jiangxi424/2004(MB/J0204)、B/shanghai361/2004(MB/S0304)、A/Anhui/1/2005(MB/A0404)、A/california/07/2009(MB/C0504)(不含Pluronic)中特异性HA含量，与最初的含量比较计算出偏差百分比。
③含有Pluronic与不含Pluronic的五价疫苗(FVBs)在+4℃可储存12个月，随后用单向免疫扩散实验(SRD)进行测定。室温储存的用于无菌试验的MBs和FVBs样品于12月后同样进行SRD测定。MBs的结果见(表5)，FVBs结果见(表6)。
④shanghai7/99和jiangxi424/2004株MBs于+4℃，-80℃下储存1年，其特异性HA含量较储存前无明显降低，B/shanghai361/2004株稳定性差。结果显示，-20℃的储存温度显著影响样品的稳定性，室温储藏疫苗的显示较好的稳定性。FVBs于+4℃储存一年其HA含量无明显改变，但其在室温条件下5株病毒表现出不同的稳定性：shanghai7/99株HA含量无明显改变，jiangxi424/2004、A/Anhui/1/2005、A/california/04/2009的HA轻微下降，B/shanghai361/2004株下降近1/4。
⑤总之，本发明流感五价或多价灭活疫苗组分即便在室温保存也具有良好的稳定性，并且含与不含Pluronic对疫苗的稳定性无明显影响。
表5流感五价灭活疫苗的稳定性观察结果
注：RT：室温 P：含Pluronic
表格中特异性HA含量为每ml中所含的量，括号中所示百分比为与贮藏前比较
表6流感五价灭活疫苗的稳定性观察结果
注：表格中特异性HA含量为每0.5ml中所含的量，括号中所示百分比为与储存前比较
RT：室温 P：含Pluronic
实验例5安全性分析
按照中国生物制品规程对制备的灭活疫苗进行异常毒性试验。使用清洁级标准的小鼠和豚鼠进行异常毒性试验(表7)。
取体重18-22g小鼠，注射前称取每只小鼠体重。每批样品用5只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL测试实施例9的流感五价灭活疫苗，观察14天。
取体重250-350g豚鼠，注射前称取每只豚鼠体重。每批样品用5只豚鼠，每只豚鼠腹腔注射5.0mL测试疫苗实施例9制备的流感五价灭活疫苗，观察14天。
进行过敏原性试验，以牛血清为过敏试验的阳性对照，生理盐水为阴性对照。每组5只豚鼠，分别于腹部皮下注射0.5mL。隔日一次，共3次，第3次注射后24天，耳静脉给予相同物质0.5mL，立即观察注射后反应(表8)。
表7疫苗成品异常毒性试验结果
表8疫苗成品过敏原性试验结果
下述实施例均能实现上述实验例所述的效果
具体实施方式
实施例1：鸡胚培养获得流感五价疫苗抗原
季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感、及甲型H1N1流感病毒疫苗株由美国CDC和英国NIBSC提供。
将季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感和甲型H1N1流感病毒疫苗株接种9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，33-35℃培养48-72h，4℃冰箱过夜冻死鸡胚，收获鸡胚尿囊液获得大量病毒，病毒收获后通过孔径0.45μm的滤器进行过滤，即得流感五价疫苗抗原。
实施例2：鸡胚培养获得流感多价疫苗抗原
季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感、甲型H1N1流感及其他亚型流感病毒株由美国CDC和英国NIBSC提供。
将季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感、甲型H1N1流感及其他亚型流感病毒株接种9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，33-35℃培养48-72h，4℃冰箱过夜冻死鸡胚，收获鸡胚尿囊液获得大量病毒，病毒收获后通过滤器进行澄清过滤，即得流感或多价疫苗抗原。
实施例3：哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、Per.C6细胞、2BS细胞等)培养获得流感五价疫苗抗原
季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感、及甲型H1N1流感病毒疫苗株由美国CDC和英国NIBSC提供。
培养细胞：将用于疫苗生产的哺乳动物细胞系(如Vero细胞、MDCK细胞、Per.C6细胞、2BS细胞等)在15L转瓶内1∶6分种，培养2-3天后接种流感病毒疫苗株，包括季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感和甲型H1N1流感病毒疫苗株；其中所述细胞由工作代细胞库复苏，经传代扩增得到；
接种病毒：在细胞密度达到3×106/ml时以0.001-0.01的感染复数接种病毒；
增殖病毒：接种病毒后，按照常规方式培养细胞，用于细胞生长的培养基为199，MEM，可以由合适的生产商购得，在含5％CO2的培养箱中于34-35℃培养细胞48-72小时；
收获病毒：将细胞培养达到预定的时间后，通过常规方法收集，冻融3次，离心去除细胞沉渣，由此收获病毒；
过滤：病毒收获后通过用孔径0.45μm的滤器进行过滤，即得流感五价疫苗抗原。实施例4：哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、Per.C6细胞、2BS细胞等)培养获得流感多价疫苗抗原
季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感、甲型H1N1流感及其他亚型流感病毒株由美国CDC和英国NIBSC提供。
培养细胞：将用于疫苗生产的Vero细胞系在Pharmacia公司的CytodexlTM发酵罐内使用微载体培养细胞，浓度为3g/L，维持时间可达28天；其中所述细胞从ATCC引进获得，1998年10月从美国ATCC获得120代Vero细胞，贮存和制备了原始种子库、主细胞库、工作细胞库，经检定，均符合《中国药典(第3版)》及《中国生物制品规程》关于动物细胞制备生物制品规程的要求；
接种病毒：在细胞密度达到3×106/ml时以0.001-0.01的感染复数接种病毒；
增殖病毒：接种病毒后，按照常规方式培养细胞，用于细胞生长的培养基为无血清培养基；在含5％CO2的培养箱中于34-35℃培养细胞48-72小时；
收获病毒：将细胞培养达到预定的时间后，通过常规方法收集，冻融3次，离心去除细胞沉渣，由此收获病毒；
过滤：病毒收获后通过孔径0.45μm的滤器进行过滤，即得流感五价或多价疫苗抗原。
实施例5：鸡胚来源的流感五价灭活疫苗抗原的制备
对实施例1制备的流感五价疫苗抗原进行灭活，采用β-丙内酯(BPL)作为灭活剂，按1∶4000在2～8℃灭活2天。
灭活后的流感五价疫苗抗原通过超滤进行浓缩，超滤膜的截留分子量为100-300KD，浓缩倍数为50-100倍。
使用30000g不连续密度梯度(12-60％蔗糖密度梯度)的蔗糖超速离心流感多价疫苗抗原3h后，收集15-35％蔗糖界面上的乳白色条带，进一步超滤去糖得流感五价灭活疫苗原液，即流感五价灭活疫苗抗原。
实施例6：细胞来源的流感五价灭活疫苗抗原的制备
对实施例3制备的流感五价疫苗抗原进行灭活，采用甲醛作为灭活剂，使用浓度1∶3000-4000，灭活温度37℃，灭活时间为3天。
灭活后的流感五价疫苗抗原通过超滤进行浓缩，超滤膜的截留分子量为100-300KD，浓缩倍数为50-100倍。
将浓缩后的流感五价疫苗抗原进行凝胶过滤层析，介质为德国Merck公司生产的Fractolgel，平衡液为pH6.5-7.5的PBS；再进行离子交换层析，使用弱阴离子交换介质：Merck公司生产的Fractogel EMD DEAE，离子交换所用的缓冲盐溶液为磷酸盐缓冲系统，平衡缓冲液为盐浓度范围0.05-0.1M，pH6.5-7.5，含0.06-0.12M的氯化钠，洗脱缓冲液为盐浓度0.05-0.1M，pH6.5-7.5，含0.2-0.4M的氯化钠。
得细胞残余DNA含量低于100pg/ml，残余牛血清含量低于50ng/ml，为流感五价灭活疫苗原液，即流感五价灭活疫苗抗原。
实施例7：鸡胚来源的流感多价灭活疫苗抗原的制备
对实施例2制备的流感多价疫苗抗原进行灭活，采用β-丙内酯(BPL)作为灭活剂，按1∶4000在2～8℃灭活2天。
灭活后的流感多价疫苗抗原通过超滤进行浓缩，超滤膜的截留分子量为100-300KD，浓缩倍数为50-100倍。
使用30000g不连续密度梯度(12-60％蔗糖密度梯度)的蔗糖超速离心流感多价疫苗抗原3h后，收集15-35％蔗糖界面上的乳白色条带，进一步超滤去糖得流感多价灭活疫苗原液，即流感多价灭活疫苗抗原。
实施例8：细胞来源的流感多价灭活疫苗抗原的制备
对实施例4制备的流感多价疫苗抗原进行灭活，采用甲醛作为灭活剂，使用浓度1∶3000-4000，灭活温度37℃，灭活时间为3天。
灭活后的流感多价疫苗抗原通过超滤进行浓缩，超滤膜的截留分子量为100-300KD，浓缩倍数为50-100倍。
将浓缩后的流感多价疫苗抗原进行凝胶过滤层析，介质为德国Merck公司生产的Fractolgel，平衡液为pH6.5-7.5的PBS；再进行离子交换层析，使用弱阴离子交换介质：Merck公司生产的Fractogel EMD DEAE，离子交换所用的缓冲盐溶液为磷酸盐缓冲系统，平衡缓冲液为盐浓度范围0.05-0.1M，pH6.5-7.5，含0.06-0.12M的氯化钠，洗脱缓冲液为盐浓度0.05-0.1M，pH6.5-7.5，含0.2-0.4M的氯化钠。
得细胞残余DNA含量低于100pg/ml，残余牛血清含量低于50ng/ml，为流感多价灭活疫苗原液，即流感多价灭活疫苗抗原。
实施例9：水包油型(MAF)佐剂的制备
角鲨烯 5％；聚氧乙烯蓖麻油 0.5％；聚醚 0.5％；其余为水或PBS缓冲液。
取上述原料混合成水溶液，经微射流均质乳化机制成乳液，颗粒度为194±76nm，见附图2，经0.22μm多聚硫化物过滤器过滤除菌，于4℃下保存。
实施例10：脑膜炎双球菌蛋白体佐剂的制备
①用1％胎牛血清的胰蛋白大豆肉汤培养脑膜炎B群2b型奈瑟氏双球菌；
②苯酚灭活的细菌，然后用6％Empigen BB去垢剂的1M氯化钙抽提，再用终浓度为20％乙醇去除核酸；
③外膜蛋白复合小泡用终浓度为45％的乙醇沉淀，沉淀通过匀浆溶解和超声溶解在1％Empigen BB的Tris-EDTA-NaCl的盐缓冲液中(0.15M的NaCl，0.01M的EDTA，0.05M的Tris-HCl，pH 8.0)；
④蛋白体通过用50％的硫酸铵沉淀三次与脑膜炎奈瑟氏双球菌的脂多糖分离进行纯化，用1％Empigen BB的缓冲液溶解沉淀；
⑤蛋白体用0.1％Empigen BB的缓冲液彻底透析，取部分蛋白体，加上样品缓冲液，进行SDS-PAGE电泳，见附图3，得三种孔道蛋白，形成囊状物，为蛋白体。
实施例11：流感五价灭活疫苗的制备
A.如实施例1所述，得流感五价疫苗抗原；
B.如实施例5所述，得流感五价灭活疫苗原液；
C.如实施例9所述，得水包油型(MAF)佐剂；
D.将水包油型(MAF)佐剂与流感五价灭活疫苗抗原按照1∶1(V/V)的比例混合，4℃搅拌24h，电镜观察吸附效果(见附图4)，即制备成流感五价灭活疫苗；本发明疫苗成品中含有季节性流感(H1N1、H3N2、B型)抗原、高致病性H5N1禽流感抗原和甲型H1N1流感抗原，制备流感五价灭活(全病毒、裂解病毒、病毒体、病毒样颗粒)疫苗，流感五价灭活疫苗抗原HA含量为1.0-15.0μg/0.2ml/人份。
实施例12：流感五价灭活疫苗的制备
A.如实施例3所述，得流感五价疫苗抗原；
B.如实施例6所述，得流感五价灭活疫苗原液；
C.如实施例10所述，得脑膜炎双球菌蛋白体佐剂；
D.将脑膜炎双球菌蛋白体佐剂用1％的EmpigenBB混合，作用2h后，用0.22μm的滤器过滤；流感五价疫苗抗原与佐剂按照4∶1(V/V)的比例混合，用10000MW透析袋，PBS透析8-10天，即制备成流感五价灭活疫苗；本发明疫苗成品中含有季节性流感(H1N1、H3N2、B型)抗原、高致病性H5N1禽流感抗原和甲型H1N1流感抗原，制备流感五价灭活(全病毒、裂解病毒、病毒体、病毒样颗粒)疫苗，流感五价灭活疫苗抗原HA含量为1.0-15.0μg/0.2ml/人份。
实施例13：流感多价灭活疫苗的制备
A.如实施例2所述，得流感多价疫苗抗原；
B.如实施例7所述，得流感多价灭活疫苗原液；
C.如实施例9所述，得水包油型(MAF)佐剂；
D.将水包油型(MAF)佐剂与流感多价灭活疫苗抗原按照1∶1(V/V)的比例混合，4℃搅拌24h，即制备成流感多价灭活疫苗；本发明疫苗成品中含有季节性流感(H1N1、H3N2、B型)抗原、高致病性H5N1禽流感抗原和甲型H1N1及其他亚型流感抗原，制备流感多价灭活(全病毒、裂解病毒、病毒体、病毒样颗粒)疫苗，流感多价灭活疫苗抗原HA含量为1.0-15.0μg/0.2ml/人份。
实施例14：流感多价灭活疫苗的制备
A.如实施例4所述，得流感多价疫苗抗原；
B.如实施例8所述，得流感多价灭活疫苗原液；
C.如实施例10所述，得脑膜炎双球菌蛋白体佐剂；
D.将脑膜炎双球菌蛋白体佐剂用1％的EmpigenBB混合，作用2h后，用0.22μm的滤器过滤；流感多价疫苗抗原与佐剂按照4∶1(V/V)的比例混合，用10000MW透析袋，PBS透析8-10天，即制备成流感多价灭活疫苗；本发明疫苗成品中含有季节性流感(H1N1、H3N2、B型)抗原、高致病性H5N1禽流感抗原和甲型H1N1及其他亚型流感抗原，制备流感多价灭活(全病毒、裂解病毒、病毒体、病毒样颗粒)疫苗，流感多价灭活疫苗抗原HA含量为1.0-15.0μg/0.2ml/人份。
实施例15：流感多价灭活疫苗的制备
A.如实施例4所述，得流感多价疫苗抗原；
B.如实施例8所述，得流感多价灭活疫苗原液；
C.将流感多价疫苗抗原与重组PorA佐剂按照4∶1(V/V)的比例混合，用10000MW透析袋，PBS透析8-10天，即制备成流感多价灭活疫苗；本发明疫苗成品中含有季节性流感(H1N1、H3N2、B型)抗原、高致病性H5N1禽流感抗原和甲型H1N1及其他亚型流感抗原，制备流感多价灭活(全病毒、裂解病毒、病毒体、病毒样颗粒)疫苗，流感多价灭活疫苗抗原HA含量为1.0-15.0μg/0.2ml/人份。
实施例16：流感五价灭活疫苗的制备
A.如实施例1所述，得流感五价疫苗抗原；
B.如实施例5所述，得流感五价灭活疫苗原液；
C.将流感五价疫苗抗原与重组PorB佐剂按照4∶1(V/V)的比例混合，用10000MW透析袋，PBS透析8-10天，即制备成流感五价灭活疫苗；本发明疫苗成品中含有季节性流感(H1N1、H3N2、B型)抗原、高致病性H5N1禽流感抗原和甲型H1N1抗原，制备流感五价灭活(全病毒、裂解病毒、病毒体、病毒样颗粒)疫苗，流感五价灭活疫苗抗原HA含量为1.0-15.0μg/0.2ml/人份。
Claims (16)
1.一种喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗，其特征在于该疫苗包括流感五价或多价灭活疫苗抗原和黏膜免疫佐剂，混合比例为1∶1-10∶1(V/V)；
其中，流感五价或多价灭活疫苗抗原为全病毒、裂解病毒、病毒体或病毒样颗粒的灭活疫苗抗原，流感多价疫苗抗原为：流感五价，即H1N1、H3N2、B、H5N1和甲型H1N1，或在此基础上任意组合的多价疫苗抗原；或在此基础上包含了所述HA选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16，所述NA选自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9亚型的所有组合得到的流感多价疫苗抗原；
其中，黏膜免疫佐剂为水包油型(MAF)佐剂、脑膜炎双球菌蛋白体佐剂、油/水乳剂型佐剂、水包油型佐剂、油包水型佐剂、颗粒型佐剂或微生物衍生物型佐剂。
2.如权利要求1所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗，其特征在于该疫苗成品中含有季节性流感(H1N1、H3N2、B型)抗原、高致病性H5N1禽流感抗原和甲型H1N1流感抗原，制备流感五价灭活(全病毒、裂解病毒、病毒体、病毒样颗粒)疫苗，疫苗中抗原为通常所使用的量，HA抗原含量1.0-15.0μg/0.2ml/人份。
3.如权利要求1或2所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗，其特征在于取流感五价或多价灭活疫苗抗原和黏膜免疫佐剂，制成滴鼻剂型的液体、喷雾式的气溶胶、粉末状、乳脂状或乳化的病毒颗粒。
4.如权利要求1或2所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗，其特征在于其中疫苗黏膜免疫佐剂--脑膜炎双球菌蛋白体佐剂是重组PorA或重组PorB形式。
5.如权利要求1-4任一所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
A.采用鸡胚培养或哺乳动物细胞培养获得流感五价或多价疫苗抗原；
B.经福尔马林或β-丙内酯灭活；
C.除菌、超滤浓缩；
D.采用柱层析或连续密度梯度超离心方法进行分离纯化，得流感五价或多价灭活疫苗原液；
E.流感五价或多价灭活疫苗半成品、成品配制：将流感五价或多价灭活疫苗原液配制成包括药学可接受的载体：标准的缓冲液，稳定剂，稀释剂，防腐剂，增溶剂；或配制成便于缓释的剂型；或添加黏膜疫苗佐剂制成流感五价或多价灭活疫苗。
6.如权利要求5所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗的制备方法，其特征在于其中A步骤包括以下步骤：
鸡胚培养获得流感五价或多价疫苗抗原：
将季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感和甲型H1N1流感病毒疫苗株，或将季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感、甲型H1N1流感及其他亚型流感病毒株接种9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，33-35℃培养48-72h，4℃冰箱过夜冻死鸡胚，收获鸡胚尿囊液获得大量病毒，病毒收获后通过滤器进行澄清过滤，即得流感五价或多价疫苗抗原；
或哺乳动物细胞培养获得流感五价或多价疫苗抗原：
培养细胞：将用于疫苗生产的哺乳动物细胞系在15L转瓶内1∶6分种，培养2-3天后接种流感病毒疫苗株，包括季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感和甲型H1N1流感病毒疫苗株，或季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感、甲型H1N1流感病毒疫苗株及其他亚型流感病毒疫苗株；或在发酵罐内使用微载体培养细胞；或在WAVE生物反应器中进行细胞培养；其中所述细胞由工作代细胞库复苏，经传代扩增得到；
接种病毒：在细胞密度达到3×106/ml时以任何合适的感染复数接种病毒；
增殖病毒：接种病毒后，按照常规方式培养细胞，用于细胞生长的培养基为常规培养基，由合适的生产商购得，或按照已公开的配方配制合适的培养基，在含5％CO2的培养箱中于34-35℃培养细胞48-72小时；
收获病毒：将细胞培养达到预定的时间后，通过常规方法收集，冻融3次，离心去除细胞沉渣，由此收获病毒；
过滤：病毒收获后通过滤器进行澄清过滤，即得流感五价或多价疫苗抗原。
7.如权利要求6所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗的制备方法，其特征在于其中A步骤包括以下步骤：
鸡胚培养获得流感五价或多价疫苗抗原：
将季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感和甲型H1N1流感病毒疫苗株，或将季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感、甲型H1N1流感及其他亚型流感病毒株接种9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，33-35℃培养48-72h，4℃冰箱过夜冻死鸡胚，收获鸡胚尿囊液获得大量病毒，病毒收获后用孔径0.45μm的滤器进行过滤，即得流感五价或多价疫苗抗原；
或Vero细胞系、MDCK细胞系、Per.C6细胞系或2BS细胞系培养获得流感五价或多价疫苗抗原：
培养细胞：将用于疫苗生产的Vero细胞系、MDCK细胞系、Per.C6细胞系或2BS细胞系在15L转瓶内1∶6分种，培养2-3天后接种流感病毒疫苗株，包括季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感和甲型H1N1流感病毒疫苗株，或季节性流感(H1N1、H3N2、B型)、高致病性H5N1人禽流感、甲型H1N1流感病毒疫苗株及其他亚型流感病毒疫苗株；或在Pharmacia公司的CytodexlTM发酵罐内使用微载体培养细胞，使用浓度为1-5g/L，维持时间达28天；或在WAVE生物反应器中进行细胞培养；其中所述细胞由工作代细胞库复苏，经传代扩增得到；
接种病毒：在细胞密度达到3×106/ml时以0.001-0.01的感染复数接种病毒；
增殖病毒：接种病毒后，按照常规方式培养细胞，用于细胞生长的培养基为199，MEM，或无血清培养基；在含5％CO2的培养箱中于34-35℃培养细胞48-72小时；
收获病毒：将细胞培养达到预定的时间后，通过常规方法收集，冻融3次，离心去除细胞沉渣，由此收获病毒；
过滤：病毒收获后用孔径0.45μm的滤器进行过滤，即得流感五价或多价疫苗抗原。
8.如权利要求5所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗的制备方法，其特征在于其中B步骤包括以下步骤：
对流感五价或多价疫苗抗原进行灭活使用WHO规定的灭活剂和灭活条件：采用甲醛作为灭活剂，使用浓度1∶3000-4000，灭活温度37℃，灭活时间为3天；或采用β-丙内酯(BPL)作为灭活剂，按1∶4000在2～8℃灭活2天。
9.如权利要求5所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗的制备方法，其特征在于其中C步骤包括以下步骤：
灭活后的流感五价或多价疫苗抗原通过超滤进行浓缩，超滤膜的截留分子量为100-300KD，浓缩倍数达50-100倍。
10.如权利要求5所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗的制备方法，其特征在于其中D步骤为如下方法中的一种：
A.柱层析法：将浓缩后的流感五价或多价疫苗抗原进行凝胶过滤层析，介质采用合适的凝胶过滤介质进行，平衡液为pH6.5-7.5的PBS；再进行离子交换层析，使用弱阴离子交换介质，离子交换所用的缓冲盐溶液为磷酸盐缓冲系统，平衡缓冲液为盐浓度范围0.05-0.1M，pH6.5-7.5，含0.06-0.12M的氯化钠，洗脱缓冲液为盐浓度0.05-0.1M，pH6.5-7.5，含0.2-0.4M的氯化钠；得细胞残余DNA含量低于100pg/ml，残余牛血清含量低于50ng/ml，为流感五价或多价灭活疫苗原液，即流感五价或多价灭活疫苗抗原；
B.密度梯度超离心法：使用30000g 12-60％蔗糖密度梯度的蔗糖超速离心流感五价或多价疫苗抗原3h后，收集15-35％蔗糖界面上的乳白色条带；得细胞残余DNA含量低于100pg/ml，残余牛血清含量低于50ng/ml，为流感五价或多价灭活疫苗原液，即流感五价或多价灭活疫苗抗原。
11.如权利要求5所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗的制备方法，其特征在于其中E步骤中疫苗黏膜免疫佐剂--水包油型(MAF)佐剂的制备方法为：
原料组成：角鲨烯1-10％；聚氧乙烯蓖麻油0.1-2％；聚醚0.1-2％；其余为水或PBS缓冲液；取原料混合成水溶液，经微射流均质乳化机制成乳液，颗粒度为194±76nm，经0.22μm多聚硫化物过滤器过滤除菌，于4℃下保存。
12.如权利要求11所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗的制备方法，其特征在于其中水包油型(MAF)佐剂的原料组成为：
角鲨烯5％；聚氧乙烯蓖麻油0.5％；聚醚0.5％；其余为水或PBS缓冲液。
13.如权利要求11所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗的制备方法，其特征在于其中聚氧乙烯蓖麻油和聚醚由如下非离子型表面活性剂中的一种或几种代替：TritonX-45，Triton X-100，Triton X-102，Triton X-114，Triton X-165，Triton X-205，Triton X-205，Triton X-305，Triton N-57，Triton N-101，Triton N-128，TWEEN-80，聚乙二醇其他衍生物，Breij35，聚氧乙烯-9-月桂酯和聚氧乙烯-9-硬脂酸。
14.如权利要求5所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗的制备方法，其特征在于其中E步骤中疫苗黏膜免疫佐剂--脑膜炎双球菌蛋白体佐剂的制备方法为：
①用1％胎牛血清的胰蛋白大豆肉汤培养脑膜炎B群2b型奈瑟氏双球菌；
②苯酚灭活的细菌，然后用6％Empigen BB去垢剂的1M氯化钙抽提，再用终浓度为20％乙醇去除核酸；
③外膜蛋白复合小泡用终浓度为45％的乙醇沉淀，沉淀通过匀浆溶解和超声溶解在1％Empigen BB的Tris-EDTA-NaCl的盐缓冲液中；
④蛋白体通过用50％的硫酸铵沉淀三次与脑膜炎奈瑟氏双球菌的脂多糖分离进行纯化，用1％Empigen BB的缓冲液溶解沉淀；
⑤蛋白体用0.1％Empigen BB的缓冲液彻底透析，取部分蛋白体，加上样品缓冲液，进行SDS-PAGE电泳，得三种孔道蛋白，形成囊状物，为蛋白体。
15.如权利要求5所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗的制备方法，其特征在于其中E步骤中疫苗黏膜免疫佐剂与流感五价或多价疫苗抗原的混合方法为：
水包油型(MAF)佐剂与流感五价或多价疫苗抗原的混合方法为：
将水包油型(MAF)佐剂与流感五价或多价灭活疫苗抗原按照1∶1-1∶10(V/V)的比例混合，2-8℃搅拌12-36h，即制备成疫苗；
脑膜炎双球菌蛋白体佐剂与流感五价或多价疫苗抗原的混合方法为：
将脑膜炎双球菌蛋白体佐剂用1％的EmpigenBB混合，作用2h后，用0.22μm的滤器过滤；流感五价或多价疫苗抗原与佐剂按照10∶1-1∶1(V/V)的比例混合，用10000MW透析袋，PBS透析8-10天，即制备成疫苗。
16.如权利要求15所述的喷鼻免疫流感五价或多价灭活疫苗的制备方法，其特征在于其中E步骤中疫苗黏膜免疫佐剂与流感五价或多价疫苗抗原的混合方法为：
水包油型(MAF)佐剂与流感五价或多价疫苗抗原的混合方法为：
将水包油型(MAF)佐剂与流感五价或多价灭活疫苗抗原按照1∶1的比例混合，4℃搅拌24h，即制备成疫苗；
其中，本发明疫苗中流感五价或多价灭活疫苗的制备方法中E步骤中脑膜炎双球菌蛋白体佐剂与流感五价或多价疫苗抗原的混合方法为：
将脑膜炎双球菌蛋白体佐剂用1％的EmpigenBB混合，作用2h后，用0.22μm的滤器过滤；流感五价或多价疫苗抗原与佐剂按照4∶1的比例混合，用10000MW透析袋，PBS透析8-10天，即制备成疫苗，成品中脑膜炎双球菌蛋白体佐剂的最终浓度为0.05-0.5％。
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