CN101726473B - 核酸适配体修饰纳米金催化共振散射光谱检测汞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸适配体修饰纳米金催化共振散射光谱检测汞的方法，它是利用Hg2+适配体ssDNA与纳米金结合形成DNA修饰的纳米金AussDNA，当Hg2+与AussDNA共存时，通过T-T错配，生成稳定的Hg2+适配体-Hg2+复合物，在高浓度NaCl作用下纳米金聚集，经膜过滤除后，用滤液中过量的AussDNA作为纳米催化晶种，催化Cu2+-糠醛的反应还原为Cu+，Cu+与溶液中的OH-生成CuOH，最终生成Cu2O微粒。以此制备已知汞浓度的被测体系和试剂空白体系，测两体系在605nm处的共振散射强度，绘制标准曲线，再制备样品检测体系，求其ΔI样，对标准曲线求得样品中汞含量。其优点在于灵敏度高，特异性强，测定范围宽，设备简单，操作简便，适合测定含汞的各种试样，为环境监测及食品、化妆品等提供可靠的分析数据。
Description
技术领域：
本发明涉及特殊化学分析技术，具体是核酸适配体修饰纳米金催化共振散射光谱检测汞的方法。
背景技术：
汞是一种具有严重生理毒性的化学物质，由于其具有持久性、易迁移性和高度的生物富集性，使其成为目前全球最引人关注的环境污染物之一。可溶性汞离子(Hg2+)是最稳定的无机汞，对细胞具有腐蚀性和致癌性；汞离子在环境中通过微生物的作用转化为甲基汞，可通过食物链富集在人体，可引起脑损伤或其他慢性疾病。因此建立一种高灵敏度、高选择性检测汞离子的方法在环境监控、食品安全及医学方面具有十分重要的意义。常见的汞元素检测方法主要是传统的元素分析技术，包括原子吸收光谱、原子发射光谱、电感耦合等离子体质谱、原子荧光光谱，但这些分析手段在实际应用中需要昂贵的仪器，繁琐。近年来，逐渐建立了汞离子的光学、分子探针和电化学等方法。核酸适配子(又称适配体)是通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)，从大容量的寡核苷酸库中筛选出对靶分子结合具有高特异性和高结合性的核酸片段。它具有很高的亲合力、高特异性、易标记等特点，已用于核酸、酶、金属离子，以及病毒颗粒和细菌孢子等检测。研究发现，Hg2+可以稳定DNA序列中的T-T结构，形成稳定的T-Hg2+-T结合物，这一原理已用于汞离子分析，建立了灵敏度较高、选择性好的目视比色、光度、荧光方法。
纳米金具有小尺寸效应、量子效应和较好的生物相容性等特点，在纳米生物分析领域得到广泛的应用。纳米金共振散射效应与免疫反应和酶催化反应等结合，发展了选择性好和灵敏度较高的共振散射光谱分析新方法。纳米金具有较强的催化活性，使其成为近期化学研究的一个热点。基于纳米金催化-金、银、铜微粒增强技术，已有酶催化、免疫反应的光度法、电化学、表面等离子体共振、共振散射光谱分析方法报道。但未见核酸适配体修饰纳米金催化菲林试剂-醛反应的氧化亚铜微粒增强共振散射光谱研究及其测定Hg2+的报道。
发明内容：
本发明的目的是提供一种核酸适配体修饰纳米金催化共振散射光谱检测汞的方法。这种方法设备简单，操作简便，灵敏度高，特异性强，测定范围宽。
本发明的原理是：Hg2+适配体ssDNA序列含有多个T碱基，其与10nm的纳米金结合时可形成DNA修饰的纳米金AussDNA，当Hg2+与AussDNA共存时，通过T-T错配，AussDNA与Hg2+反应生成稳定的Hg2+适配体-Hg2+复合物，与Hg2+反应的AussDNA释放出纳米金，在高浓度NaCl作用下纳米金聚集，溶液颜色由红变蓝，所生成的纳米金簇的粒径较大，可经膜过滤除去。用滤液中过量的AussDNA作为纳米催化晶种，催化Cu2+-糠醛的反应还原为Cu+，生成的Cu+与溶液中的OH-生成CuOH，最终生成Cu2O微粒，导致共振散射光强度增大，随着Hg2+浓度的增加，滤液中AussDNA微粒减少，增强作用减弱，共振散射强度降低。据此可建立一个适配体修饰纳米金催化-氧化亚铜微粒共振散射光谱检测Hg2+的方法。
应用核酸适配体修饰纳米金检测汞的共振散射光谱方法，包括以下步骤：
(1)制备已知浓度的检测体系：在5支5mL刻度试管中，每管依次移取18μL 0.17μmol/L单链寡糖核苷酸(ssDNA、其序列为5’-TTT CTT CTT TCT TCC CCC CTT GTT TGT TGTTT-3’)溶液，400μL pH 7.0浓度为0.02mol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液，375μL 58μg/mL纳米金溶液，摇匀，静置5min后；五支试管分别加入1.000×10-2mol/L HgCl2标准溶液5～400μL，再加入22.5μL 2.0mol/L的NaCl溶液，稀释至1.5mL，混匀，用孔径为150nm滤膜过滤，将滤液稀释10倍后，留做以下测定用，
另于5支5mL的具塞刻度试管中，分别移取69μL 0.20mol/L CuSO4溶液，75μL 1.23mol/LKNaC4H4O6，该KNaC4H4O6溶液含6.25mol/L NaOH，各试管分别加入按步骤(1)制备的滤液各80μL，再加入900μL 23.2mmol/L糠醛溶液，定容至3.0mL，混匀，70℃下水浴反应6min，流水快速冷却至室温
(2)用步骤(1)方法不加Hg2+做空白对照体系溶液
(3)分别取按步骤(1～2)制备的标准溶液及空白对照体系溶液适量，置于石英比色皿中，用荧光分光光度计在低灵敏度、狭缝3nm、激发波长等于发射波长的条件下同步扫描，获得同步发射光谱记录其共振散射光谱，测定605nm波长处的共振散射光强度I605nm，并测定其空白值(I605nm)b，计算ΔI605nm＝(I605nm)b-I605nm
(4)以不同浓度Hg2+(CHg)与对应的共振散射强度ΔI605nm作图，绘制标准曲线
(5)制备样品检测体系：取一定体积样品，必要时滤过，然后用硝酸-盐酸(体积比1∶3)微波消化10min，取消化后的样品一定量替换Hg2+标准溶液，按步骤(1)～(3)操作，求其ΔI样 
(6)根据样品测得的ΔI样，查标准曲线，可以求得样品的汞含量。
本发明的优点：灵敏度高，特异性强，测定范围宽，设备简单，操作简便，适合测定含汞的各种试样，为环境监测及食品、化妆品等提供可靠的分析数据。
附图说明：
图1为本发明实施例测定汞的共振散射光谱图。
图中：a.4.6mmol/L CuSO4+3.08×10-2mol/L KNaC4H4O6+6.96mmol/L糠醛+38.57ng/mLAussDNA(以Au浓度计)+0.0nmol/L Hg2+；b.a+0.133nmol/L Hg2+；c.a+667nmol/L Hg2+；d.a+1000nmol/L Hg2+；e.a+1333nmol/L Hg2+；f.4.6mmol/L CuSO4+3.08×10-2mol/LKNaC4H4O6，+6.96mmol/L糠醛
具体实施方式：
(1)制备已知浓度的测试体系：准备5支5mL刻度试管，每管依次移取18μL 0.17μmol/L单链寡糖核苷酸(ssDNA、其序列为5’-TTT CTT CTT TCT TCC CCC CTT GTT TGTTGT TT-3’)溶液，400μL pH 7.0浓度为0.02mol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液，375μL 58μg/mL纳米金溶液，摇匀，静置5min后；五支试管分别加入1.000×10-2mol/L HgCl2标准溶液50、100、200、300、400μL，再加入22.5μL 2.0mol/L的NaCl溶液，稀释至1.5mL，混匀，用孔径为150nm滤膜过滤，将滤液稀释10倍后，留做以下测定用，
另于五支5mL的具塞刻度试管中，分别移取69μL 0.20mol/L CuSO4溶液，75μL 1.23mol/L KNaC4H4O6，该KNaC4H4O6溶液含6.25mol/L NaOH，各试管分别加入按步骤(1)制备的滤液1～5各80μL，再加入900μL 23.2mmol/L糠醛溶液，定容至3.0mL，混匀，70℃下水浴反应6min，流水快速冷却至室温
(2)用步骤(1)方法不加Hg2+做空白对照溶液体系
(3)分别取按步骤(1～2)制备的标准溶液及空白对照体系溶液适量，置于石英比色皿中，用荧光分光光度计在低灵敏度、狭缝3nm、激发波长等于发射波长的条件下同步扫描，获得同步发射光谱记录其共振散射光谱，测定605nm波长处的共振散射光强度I608nm，并测定其空白值(I605nm)b，计算ΔI605nm＝(I605nm)b-I605nm 
(4)以不同浓度Hg2+(CHg)与对应的共振散射强度ΔI605nm作图，绘制标准曲线，其回归方程为ΔI605nm＝0.097CHg+8.12
(5)制备样品的测试体系：取一定体积废水过滤，然后用硝酸-盐酸(体积比1∶3)微波消化10min，取消化后的废水样1mL替换Hg2+标准溶液，按步骤(1)～(3)操作，制备样品测试体系，并求得其ΔI样 
(6)根据样品测得的ΔI样，查标准曲线，可以求得样品的汞含量。
验证：用本发明方法测定废水样品2份，用上述(1)～(6)的步骤进行检测，检测结果是汞含量分别为334.8nmol/L、94.6nmol/L，证明了本方法的可靠性。
本发明实施例测定汞的线性范围为0.133～1333nmol/L，检出限为0.07nmol/L。
Claims (1)
1.核酸适配体修饰纳米金催化共振散射光谱检测汞的方法，其特征是：检测方法包括以下步骤：
(1)制备已知浓度的检测体系：在5支5mL刻度试管中，每管依次移取0.17μmol/L 18μL单链寡糖核苷酸溶液，序列为5’-TTT CTT CTT TCT TCC CCC CTT GTT TGT TGT TT-3’，再加入pH 7.0浓度为0.02mol/L 400μL的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液、375μL 58μg/mL的纳米金溶液，摇匀，静置5min后；五支试管分别加入50μL、100μL、200μL、300μL、400μL的1.000×10-2mol/L HgCl2标准溶液，再加入2.0mol/L22.5μL的NaCl溶液，稀释至1.5mL，混匀，用孔径为150nm的滤膜过滤，将滤液稀释10倍后，留做以下测定用；另于5支5mL的具塞刻度试管中，分别移取69μL0.20mol/L的CuSO4溶液、75μL1.23mol/L的KNaC4H4O6，该KNaC4H4O6溶液含6.25mol/L NaOH，各试管分别加入按步骤(1)制备的滤液各80μL，再加入900μL23.2mmol/L的糠醛溶液，定容至3.0mL，混匀，70℃下水浴反应6min，流水快速冷却至室温；
(2)用步骤(1)方法不加Hg2+做空白对照体系溶液；
(3)分别取按步骤(1)、(2)制备的标准溶液及空白对照体系溶液适量，置于石英比色皿中，用荧光分光光度计在低灵敏度、狭缝3nm、激发波长等于发射波长的条件下同步扫描，获得同步发射光谱记录其共振散射光谱，测定605nm波长处的共振散射光强度I605nm，并测定其空白值(I605nm)b，计算ΔI605nm＝(I605nm)b-I605nm；
(4)以不同浓度Hg2+与对应的共振散射强度ΔI605nm作图，绘制标准曲线；
(5)制备样品检测体系：取一定体积样品，必要时滤过，然后用体积比为1∶3的硝酸-盐酸微波消化10min，取消化后的样品一定量替换Hg2+标准溶液，按步骤(1)～(3)操作，求其ΔI样；
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