CN101724622B - 一种干酪乳杆菌微胶囊的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种干酪乳杆菌微胶囊的制备方法，分别以2～6％微孔淀粉溶液和2％～6％海藻酸钠溶液为微胶囊内外壁材，利用微孔淀粉表面布满小孔的特点吸附菌液，再利用海藻酸钠与氯化钙发生离子交换形成海藻酸钙包被，对干酪乳杆菌进行双层包埋。本干酪乳杆菌微胶囊在2～6℃下干燥36～72h后，所得的微胶囊具有较强的耐酸性、耐胆盐能力与稳定的贮存性，在人工胃液中基本不溶解，不发生渗漏，而在人工肠液中，立即崩解；在0.3％胆盐溶液中处理1h后，菌体存活率为88％，4℃下贮存1个月活菌数从5.80×10⁹cfu/g到1.24×10⁹cfu/g。本发明大大提高了干酪乳杆菌在产品中的存活率与益生菌的利用率，同时也丰富了益生菌微胶囊的品种。

Description

一种干酪乳杆菌微胶囊的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种干酪乳杆菌微胶囊的制备方法。

背景技术

益生菌是活的微生物，通过摄入充足的数量，对宿主产生一种或多种特殊且经论证的功能性健康益处。如：改善肠道功能、营养功能、抗癌功能、免疫功能、抗过敏功能与抗高血压等。干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)属于乳杆菌类益生菌，是人体肠道的重要微生物，与人体的健康有密切的联系。干酪乳杆菌具有高效降胆固醇，并且能够诱导产生抗菌素、促进细胞分裂、产生抗体免疫及抗癌等作用；干酪乳杆菌还具有缓解乳糖不耐症、增强人体免疫、缓解过敏、预防癌症和抑制肿瘤生长等益生保健作用。因此，将干酪乳杆菌应用于乳制品等产品中可提高产品的保健功能。

益生菌制品从生产、运输、销售，到被口服经上消化道到达肠道的过程中，益生菌需经受一系列不良环境(如有氧状态、低pH值等)的影响，如经不住胃酸和胆汁的杀伤作用，导致到达肠道的活菌数大量减少，也不能在肠内定殖，其益生作用会受到极大的限制。因此，益生菌应用时面临的关键问题在于菌株产品制造、储存销售期间的稳定性。从理论上诠释各种加工条件对其生长和存活的影响，在技术上寻求新的突破口是十分重要的。

利用微胶囊包埋技术保护益生菌是目前国内外研究的热点，将益生菌活菌完全隔绝空气和降低其对温度的敏感性出发，运用制备微囊的方法，采用成膜材料，将包埋与低温干燥有机结合起来，在低温干燥的同时迅速在益生菌活菌体周围形成一层类似微囊的保护膜，从而达到减少甚至避免菌体冻干损伤、保护益生菌免受噬菌体的侵害、提高活菌存活率、延长活菌常温保存期、提高活菌常温贮存过程中稳定性的目的。但目前国内外对干酪乳杆菌进行包被的甚少，使其益生功能不能充分被利用；且现有的益生菌微胶囊制品颗粒较大，壁材不具有良好的肠溶性，在胃液中易破裂或不能在肠道内迅速崩解，致使益生菌不能顺利在肠道内定殖。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种干酪乳杆菌微胶囊的制备方法，此方法可延长干酪乳杆菌的存活期，可更好的发挥其益生作用。

本发明的目的是这样实现的：

一种干酪乳杆菌微胶囊的制备方法，步骤如下：

(1)离心制得干酪乳杆菌菌体，然后用生理盐水制成菌悬液，菌悬液中菌体浓度为10⁸～10⁹cfu/mL；

(2)菌悬液与第一层包埋材料2％～6％微孔淀粉溶液1∶1混合(V/V)，100～600r/min，10～60min搅拌均匀至吸附；

(3)再加入为上述混合溶液2倍体积的2～6％的海藻酸钠溶液，100～600r/min，10～60min室温搅拌均匀；

(4)将上述混合液滴到1～6％的CaCl₂溶液中，在10～30℃固化20～60min，无菌水洗涤，过滤；

(5)湿球温度在2～6℃下干燥36～72h，即制得干酪乳杆菌微胶囊。

而且，所述步骤(1)中的干酪乳杆菌菌体在离心力为4000～10000g、离心10～60min后，离心所得的干酪乳杆菌菌体用生理盐水稀释，得到浓度为0.5％的菌悬液的菌体浓度为10⁸～10⁹cfu/mL。

而且，固化条件为固化液CaCl₂溶液的浓度为1～6％。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明所制备的干酪乳杆菌微胶囊在2～6℃下干燥36～72h后，所得的微胶囊具有较强的耐酸性、耐胆盐能力与稳定的贮存性。在人工胃液中基本不溶解，不发生渗漏，而在人工肠液中，立即崩解。并且在0.3％胆盐溶液中处理1h后，菌体存活率为88％。4℃下贮存1个月活菌数从5.80×10⁹cfu/g到1.24×10⁹cfu/g。干酪乳杆菌微胶囊可作为乳饮料的营养添加剂和益生菌补充剂，对加入干酪乳杆菌微胶囊的乳饮料进行贮存稳定性测试，各项指标均达国家标准。因此，微胶囊化干酪乳杆菌大大提高了干酪乳杆菌在产品中的存活率，与益生菌的利用率，同时也丰富了益生菌微胶囊的品种。

2、本发明对干酪乳杆菌进行双层包埋，延长了菌体的存活期，使活性菌能顺利的通过人体的胃和小肠，克服胃酸和胆汁的作用，在大肠内释放并定殖，从而起到益生作用。

3、本发明是顺应了市场的需求，克服了现有微胶囊的缺点，操作简易，且能应用于工业化生产。

附图说明

图1为本发明最佳固化条件制的干酪乳杆菌微胶囊外形图；

图2为本发明在不同pH值下的L.c菌液的耐酸性图示；

图3为本发明在不同pH值下L.c微胶囊的耐酸性图示；

图4为本发明的L.c菌液与微胶囊对胆盐的耐受性曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1：

首先将菌种接种于液体MRS培养基中，按最适培养温度培养，培养基浑浊后进行传代。经过2～3次活化，菌种活力充分恢复后用于后续试验。菌体活力达到要求后，进行菌体的收集。将菌液在无菌操作条件下装入管中，用冷冻离心机进行离心。离心力为4000g，离心20min后，弃上清液，保留离心后的菌体。然后用生理盐水稀释，浓度为0.5％的菌悬液菌体浓度可达108～109cfu/mL。将干酪乳杆菌悬液与第一层包埋材料4％微孔淀粉溶液1∶1混合(V/V)，180r/min，15min搅拌均匀至吸附；再加入4％的海藻酸钠溶液，加入量为与上述混合溶液体积比为2∶1，180r/min，15min室温搅拌均匀；然后将混合液滴到2％的CaCl₂溶液中在室温下固化30min，无菌水洗涤，过滤；干酪乳杆菌微胶囊湿球在4℃下干燥48h，制得干酪乳杆菌微胶囊。

本发明的固化条件足以使壁材固化完全，微胶囊在固化后的洗涤液中不易破裂，因而具有较高的微胶囊化产率。固化液温度在10℃～30℃时微胶囊化产率高，这恰恰为工业化生产提供了方便，可在室温下直接生产。

本实施例中，干酪乳杆菌微胶囊干燥温度为2～6℃，此温度下干燥后的活菌存活率较高，因为温度低，菌种代谢不活泼，生长繁殖处于抑制的休眠状态。

实施例2：

首先将菌种接种于脱脂乳培养基中，在37℃下培养，待凝固后继续继代培养，经过2～3次活化，菌种活力充分恢复后用于后续试验。菌体活力达到要求后，加入4％的柠檬酸钠溶液，充分搅拌40min，然后进行菌体的收集。将菌液在无菌操作条件下装入管中，用冷冻离心机进行离心。离心力为10000g，离心50min后，弃上清液，保留离心后的菌体。然后用生理盐水稀释，浓度为0.5％的菌悬液菌体浓度可达10⁹cfu/mL。将干酪乳杆菌悬液与第一层包埋材料5％微孔淀粉溶液1∶1混合(V/V)，160r/min，20min搅拌均匀至吸附；再加入5％的海藻酸钠溶液，加入量与上述混合溶液体积比为2∶1，160r/min，20min室温搅拌均匀；然后将混合液滴到2％的CaCl₂溶液中在室温下固化40min，无菌水洗涤，过滤；干酪乳杆菌微胶囊湿球在4℃下干燥48h后，制得干酪乳杆菌微胶囊。

实施例3：

首先将菌种接种于脱脂乳培养基中，在37℃下培养，经过2～3次活化，菌种活力充分恢复后用于后续试验。将菌种接种于用乳清蛋白酶解液改良的MRS培养基中，加入灭菌的磷酸盐缓冲液，培养14小时后，进行菌体的收集。将菌液在无菌操作条件下装入管中，用冷冻离心机进行离心。离心力为6000g，离心20min后，弃上清液，保留离心后的菌体。然后用生理盐水稀释，浓度为0.5％的菌悬液菌体浓度可达10⁹cfu/mL。将干酪乳杆菌悬液与第一层包埋材料5％微孔淀粉溶液1∶1混合(V/V)，190r/min，20min搅拌均匀至吸附；再加入5％的海藻酸钠溶液，加入量与上述混合溶液体积比为2∶1，190r/min，20min室温搅拌均匀；然后将混合液滴到2％的CaCl₂溶液中在室温下固化40min，无菌水洗涤，过滤；干酪乳杆菌微胶囊湿球在4℃下干燥48h后，制得干酪乳杆菌微胶囊。

上述所有实施例的固化条件是应用SPSS软件得出的。最佳固化条件：固化液浓度1％～6％，固化液温度10～30℃，固化时间20～60min。

根据最佳固化条件制作干酪乳杆菌微胶囊，然后对其肠溶性能进行检测，证明工艺参数可靠。

1、肠溶性试验：参照中华人民共和国药典对肠溶胶囊剂崩解时限的规定，产品在模拟人工胃液中37℃下保温2小时，无破损，取出后在模拟人工肠液中37℃下保温1小时，完全崩解，说明产品具有肠溶性。

人工胃液：取稀盐酸16.4mL，加水约800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释成1000mL，即得(pH1.5)。

人工肠液：即磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH6.8)。

磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH6.8)：取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000mL，即得。

表1最佳固化条件的肠溶性试验

最佳固化条件下制得的微胶囊肠溶性符合中华人民共和国药典的要求标准。微胶囊化产率到达88％。图1中看到干酪乳杆菌微胶囊外观成规则的球状，且大小均匀。

2、干酪乳杆菌微胶囊产品性能测定：

①干酪乳杆菌微胶囊粒径的测定方法

随机取50颗微胶囊置于玻璃板上，用千分尺或者刻度尺随机测量数粒微胶囊粒径，取平均值。单位：mm。

d_平均＝(d₁+d₂+d₃+...+d_n)/n

测定结果：平均粒径为0.5mm～1mm。

②干酪乳杆菌微胶囊包埋效率，包埋产率的测定

a.包埋效率＝1-(湿球微胶囊表面活菌数)/(湿球微胶囊完全破壁后的活菌数)×100％

b.包埋产率＝(湿球微胶囊完全破壁后的活菌数)/(加入的活菌数)×100％

c.产品干燥存活率＝(干燥后的产品微胶囊完全破壁后的活菌数)/(加入的活菌数)×100％

微胶囊表面活菌数的测定：将干酪乳杆菌湿球微胶囊直接加入到生理盐水中，180r/min搅拌30min，使表层及可泄露的菌体溶出，进行活菌计数。

微胶囊完全破壁后活菌数的测定：将干酪乳杆菌湿球微胶囊或干燥后的产品微胶囊溶于人工肠液中180r/min处理60min，完全溶解后进行活菌计数。

测定结果：干酪乳杆菌微胶囊的包埋效率是89％，包埋产率92％，产品干燥存活率57％。

③微胶囊膨胀度的定义及测定方法

微胶囊在缓冲液中的膨胀行为，也可表征微胶囊膜机械强度，试验发现微胶囊的体积膨胀率(Sw)与膜厚度之间成反比关系，进而可以推出体积膨胀率与膜强度成反比关系，定义体积膨胀率为下式：

$S_w(\%)=100\left[\frac{(V_t-V_o)}{V_o}\right]$ (公式1)

式中V0和Vt分别代表胶珠和微胶囊的体积。当胶珠为球形时，上式可写为：

$S_w(\%)=100[{\left[\frac{D_t}{D_o}\right]}^3-1]$ (公式2)

式中D0和Dt分别代表胶珠和微胶囊的直径。

在显微镜下随机读取50个胶囊粒径取算术平均值为该批胶囊的粒径，定义为Do。然后将微胶囊置于柠檬酸钠溶液中，液化一定时间后微胶囊内部变为液态。微胶囊在液化后测其胶囊粒径，定义为Dt，由此计算微胶囊膨胀度Sw。膨胀度越高表征微胶囊膜强度越低，反之，膨胀度越低则表征微胶囊膜强度越高。

测定结果：试验通过对不同批次的微胶囊进行膨胀率的测定，求其平均值，得出Sw(％)为1355。

④未包埋与包埋的干酪乳杆菌耐酸性能的比较

a.准确吸取1mL干酪乳杆菌菌液，分别加入装有9mL的人工胃液(pH1.5)的试管中，于37℃下保温1-4小时。每小时测定一次活菌数。调节人工胃液的pH值到2.5，重复上述试验。

b.称取0.1g干酪乳杆菌微胶囊，分别放入装有pH值为1.5与2.5的人工胃液的试管中，于37℃下保温2小时。每小时测定一次微胶囊的活菌数。

测定结果：干酪乳杆菌菌液在pH1.5的人工胃液处理1小时，菌液活菌数为1.53×10²cfu/mL，降了7个数量级，2小时后检测已无活菌。pH2.5的人工胃液处理4小时后活菌数为8.8×10²cfu/mL，说明干酪乳杆菌菌液不耐胃酸。经包埋处理后的干酪乳杆菌的存活率大大提高，pH1.5与pH2.5的人工胃液处理4小时后，活菌数分别从1.76×10⁹cfu/g降到1.4×10⁷cfu/g和1.8×10⁷cfu/g，都只降了2个数量级。说明微胶囊耐酸效果明显，使活菌数大大提高，起到了胶囊的保护作用(图2-3)。

⑤未包埋与包埋的干酪乳杆菌耐胆盐性能的比较

a.准确吸取1mL干酪乳杆菌菌液，分别加入装有9mL，0.3％胆盐溶液(pH7.4)的试管中，于37℃下保温1～4小时。每小时测定一次活菌数。

b.称取0.1g干酪乳杆菌微胶囊，分别放入装有0.3％胆盐溶液(pH7.4)的试管中，于37℃下保温1～4小时。每小时测定一次微胶囊的活菌数。

测定结果：干酪乳杆菌液的活菌数骤降，从2.56×10⁹cfu/mL降到1.88×10²cfu/mL；而微胶囊在胆盐中变化较小，活菌数只是从1.80×10⁹cfu/g降到5.10×10⁸cfu/g，说明了微胶囊对菌体的保护作用(见图4)。

⑥未包埋与包埋的干酪乳杆菌贮存稳定性的比较

a.将干酪乳杆菌菌液在4℃下贮存3个月，每隔10天测定一次活菌数。

b.将干酪乳杆菌微胶囊于4℃贮存3个月，每隔10天取样0.1g利用人工肠液完全破壁后测其菌体存活率。

测定结果：干酪乳杆菌菌液在1个月后活菌数只有1.39×10⁴cfu/mL，2个月后无活菌。而干酪乳杆菌微胶囊的低温贮存稳定性较高。1个月活菌数从5.80×10⁹cfu/g到1.24×10⁹cfu/g。菌体在低温下处于休眠状态，且在干酪乳杆菌外包被了一层高分子囊膜，增强了抵抗力，故存活率较高。但微胶囊的存活率也有下降，这可能是贮存过程中壁材特性结构发生改变，使膜的通透性发生了变化，使其对菌体的保护作用减弱。总体上，微胶囊的存活率到达了食品级要求。

干酪乳杆菌微胶囊在乳饮料中的应用：

①混菌发酵益生菌乳饮料的最佳工艺为：干酪乳杆菌与瑞士乳杆菌的比例为2∶1、2％～6％的接种量、4％～10％的白砂糖与0.5％～3％的葡萄糖在20～60℃，发酵36～72h小时后，取32％-50％的发酵乳，添加4％～9％的白砂糖，0.15％～0.35％的果胶，经过混合、定容后均质而成。制好的益生菌饮料中每100mL添加1g干酪乳杆菌微胶囊。

②干酪乳杆菌微胶囊在乳饮料中贮存的稳定性

乳饮料中加入干酪乳杆菌微胶囊后，在贮存的一个月期间每隔10天对乳饮料进行pH值与蛋白质含量的测定、微胶囊颜色与外观的观察，从而检测微胶囊在乳饮料的贮存情况。

表2干酪乳杆菌微胶囊在乳饮料中贮存的稳定性

乳饮料的pH值与蛋白含量在贮存期内没有明显变化，说明微胶囊并没有渗漏，没有参与发酵；同时也说明微胶囊没有影响乳饮料的品质，蛋白含量稳定。而微胶囊本身颜色外观没有任何变化。因此，说明干酪乳杆菌微胶囊在乳饮料中贮存稳定。

③饮料中微胶囊的添加量：

0.1g干酪乳杆菌微胶囊从口腔到肠内定殖过程中活菌数的数量级的变化。

以上处理条件均为极端环境处理。(如：用4℃贮存30天后的微胶囊，在pH1.5的胃液中与0.3％胆汁液中先后各处理4小时)

研究发现，要获得所期望的治疗效果，益生菌必须达到足够的数量。一般来说，食品中活菌体的数量不应少于10⁶cfu/g，日本的发酵乳与乳酸菌饮料协会规定，乳中的益生菌菌数至少为10⁷cfu/mL，以确保进入人体后有足够的活菌发挥保健功能。

成品为100mL/瓶，每瓶中装入1g干酪乳杆菌微胶囊，出厂产品中活菌数最少达到1×10¹⁰cfu/g，到达人体定殖于小肠中的活菌数最少为1×10⁶cfu/g。

Claims (1)

1.一种干酪乳杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：步骤如下：

(1)离心制得干酪乳杆菌菌体，然后用生理盐水制成菌悬液，菌悬液中菌体浓度为10⁸-10⁹cfu/mL；

(2)菌悬液与第一层包埋材料2％～6％微孔淀粉溶液1∶1混合(V/V)，100～600r/min，10～60min搅拌均匀至吸附；

(3)再加入为上述混合溶液2倍体积的4％或5％的海藻酸钠溶液，100～600r/min，10～60min室温搅拌均匀；

(4)将上述混合液滴到2％的CaCl₂溶液中，在10～30℃固化20～60min，无菌水洗涤，过滤；

(5)湿球温度在2～6℃下干燥36～72h，即制得干酪乳杆菌微胶囊，

所述步骤(1)中的干酪乳杆菌菌体在离心力为4000～10000g、离10～60min后，离心所得的干酪乳杆菌菌体用生理盐水稀释，得到浓度为0.5％的菌悬液的菌体浓度为10⁸～10⁹cfu/mL。

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