CN101723951A - 冬凌草甲素衍生物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明在不破坏冬凌草甲素活性中心的前提下，通过改变1位、4位和17位的取代基团，提供了如下冬凌草甲素的衍生物：

这种冬凌草甲素衍生物具有更高的抗肿瘤细胞活性，同时，本发明还提供了上述化合物的制备方法。

Description

冬凌草甲素衍生物及其制备方法

技术领域

本发明涉及新的冬凌草甲素衍生物及其制备方法。

背景技术

从香茶菜属植物中已分离出的100多个二萜类成分中，有一定抗肿瘤活性的有30多个。其中冬凌草甲素(贝壳杉烯型)型的有17种左右，而它们在植物中的含量以冬凌草甲素为最高，其活性研究也以冬凌草甲素为最多。冬凌草甲素是具有α-亚甲基环戊酮的二萜类化合物，其抗癌活性确切，已被国内外学者广泛研究，实验证明冬凌草甲素具有确切的体外及体内的抗肿瘤活性，其抗瘤谱较广，如人鼻咽癌细胞、人肝癌细胞、人宫颈癌细胞、人食管癌细胞等均有明显的杀伤作用(a张俊峰，陈规划，陆敏强，等.中华肿瘤防治杂志，2006，13(15)：1131-1133.b李瑞芳，王庆端.药学学报，2004，39(11)：865-868.c王锦英，林晨，张潭木.中国药理学报，1985，6：195.d吴孔明，张潭木，王庆端.肿瘤防治研究，1994，21(4)：208)，但其活性均不高，其IC₅₀值都大于1μg/ml。Zhou等人最近阐明了冬凌草甲素的作用机理，证明冬凌草甲素可通过AML1-ETO蛋白通路发挥体内外抗肿瘤活性，并且毒副作用低(Zhou GB，Kang H，Wang L，et al.Blood，2007，109：3441-3450)。在进行体内抗小鼠艾氏腹水癌的活性研究过程中发现，凡结构上具有α-环外亚甲基环戊酮结构单元的化合物都具有抗肿瘤活性，而没有该结构单元的化合物都没有活性。日本学者Fujita等认为此类二萜类化合物的活性中心为α-环外亚甲基环戊酮，并且对14位羟基进行了酰化，酰化后的化合物中以C16时的酰基活性为最高，体内活性较冬凌草甲素高出30％～40％(Fujita E，Nagao Y，Kaneko K，et al.ChemPharm Bull，1981，29(11)：3208-3213)。我们在总结前人工作基础时发现，所有化合物的抗肿瘤活性都不够高，并且由于水溶性差，因而限制了它的使用。总之，欲将冬凌草甲素开发为新药，还需提高其抗肿瘤活性，并尽可能地降低毒性和改善其溶解性。

发明内容

本发明的目的是在不破坏冬凌草甲素活性中心的前提下，通过改变1位、4位和17位的羟基，提供具有更高抗肿瘤活性的冬凌草甲素衍生物，同时提供该化合物的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的。

冬凌草甲素衍生物，其特征以下面通式表示：

通式1                    通式2

在通式1中，R₁和R₂为H或3’，4’-二甲氧基苯亚甲叉，或为3’，4’-二甲氧基苯亚甲叉基；

在通式2中，R₁和R₂为H或对甲苯磺酰基，或为3’，4’-二甲氧基苯亚甲叉基。

制备上述通式1所示化合物的方法为：

a将冬凌草甲素在甲苯的存在下，与3，4-二甲氧基苯甲醛和对甲苯磺酸反应，得到通式1所示的化合物3’，4’-二甲氧基苯亚甲叉冬凌草甲素；

b将冬凌草甲素在二氯甲烷和三乙胺的存在下，与对甲苯磺酰氯反应，得到通式1所示的化合物对甲苯磺酰冬凌草甲素。

制备上述通式2所示化合物的方法为：

a首先将冬凌草甲素与丙酮和Jone’s试剂反应，得到1-氧化冬凌草甲素；

b将1-氧化冬凌草甲素在甲苯的存在下，与3，4-二甲氧基苯甲醛和对甲苯磺酸反应得到通式2所示的化合物3’，4’-二甲氧基苯亚甲叉1-氧化冬凌草甲素；

c将1-氧化冬凌草甲素在二氯甲烷和三乙胺的存在下，与对甲苯磺酰氯反应通式2所示的化合物对甲苯磺酰1-氧化冬凌草甲素。

本发明所提供的化合物是在不破坏原有的基本骨架的基础上，通过对冬凌草甲素的1位、7位和14位羟基进行氧化，对甲苯磺酰化或3’，4’-二甲氧基苯亚甲叉化修饰改造，从而发现以通式1或通式2所示的冬凌草甲素衍生物具有更高的抗肿瘤活性。因此，与现有技术相比，冬凌草甲素衍生物具有很高的抗肿瘤活性，其活性高出冬凌草甲素的2～5倍。发明人采用体外活性测定法对本发明提供的化合物的抗癌活性进行了测试，以冬凌草甲素为阳性对照，发现该化合物对人体乳腺癌、人体子宫颈癌、人体纤维肉瘤等癌细胞的直接杀伤作用较冬凌草甲素高出2～5倍。

附图说明

图1化合物II的核磁共振氢谱

图2化合物II的核磁共振碳谱

图3化合物III的核磁共振氢谱

图4化合物III的核磁共振碳谱

图5化合物IV的核磁共振氢谱

图6化合物IV的核磁共振碳谱

图7化合物V的核磁共振氢谱

图8化合物V的核磁共振碳谱

具体实施方式

实施例1当R₁＝R₂＝3’，4’-二甲氧基苯亚甲叉基时，通式1所示的冬凌草甲素衍生物(7，14-(3’，4’-二甲氧基)苯亚甲叉冬凌草甲素，化合物II)的制备：

在250ml圆底烧瓶中，加入5g冬凌草甲素和100ml甲苯，搅拌下加入8g 3，4-二甲氧基苯甲醛和0.2g对甲苯磺酸，80℃反应4小时。停止反应，用水和乙酸乙酯萃取，有机相用饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化铵溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥过夜，过滤，滤液减压浓缩后得白色固体，过硅胶柱层析，用石油醚-丙酮(6∶1)洗脱，得无色针状晶体6.5g，产率92％。M.p.252～254℃。

化合物分子式：C₂₉H₃₆O₈

谱图数据如下：

IR v_max ^KBr(cm^-1)：3383，2936，2863，1712，1646，1593，1518，1459，1164，1060，1032，910，730.

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：6.99(1H，dd，J＝8.2，1.8Hz，6’-H)，6.90(1H，d，J＝1.8Hz，2’-H)，6.78(1H，d，J＝8.2Hz，5’-H)，6.19(1H，s，17-H)，6.18(1H，s，苯亚甲叉上H)，6.06(1H，d，J＝11.7Hz，6-OH)，5.55(1H，s，17-H)，4.90(1H，s，14-H)，4.36，4.15(各1H，d，J＝11.2Hz，20-H)，3.98(1H，dd，J＝11.6，4.5Hz，6-H)，3.83(6H，s，3’，4’-甲氧基)，3.49～3.51(1H，m，1-H)，3.19(1H，d，J＝9.3Hz，13-H)，1.18，1.16(各3H，s，18，19-CH₃)

¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)：

MS(ESI)m/z(％)：535([M+Na]⁺)

实施例2当R₁＝对甲苯磺酰基，R₂＝H时，通式1所示的冬凌草甲素衍生物(14-对甲苯磺酰基冬凌草甲素，化合物III)的制备：

在250ml圆底烧瓶中，加入5g冬凌草甲素，150ml二氯甲烷和2ml三乙胺，搅拌下加入5g对甲苯磺酰氯，0℃反应4小时后，加入少量水淬灭反应，用水和乙酸乙酯萃取，有机相用饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化铵溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥过夜，过滤，滤液减压浓缩后得白色固体，用石油醚-丙酮重结晶得无色针状晶体6.8g，产率95％。M.p.260～262℃。

化合物分子式：C₂₇H₃₄O₈S

谱图数据如下：IR v_max ^KBr(cm^-1)：3557，3377，2951，2868，1713，1644，1598，1174，1090，1059，1034，967，908，754

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：7.8(2H，d，J＝8.3Hz，3’，5’-H)，7.34(2H，d，J＝8.3Hz，2’，6’-H)，6.14(1H，s，17-H)，5.95(1H，d，J＝10.4Hz，6-OH)，5.73(1H，s，7-OH)，5.48(1H，s，17-H)，4.17，4.02(各1H，d，J＝10.6Hz，20-H)，3.82(1H，s，14-H)，3.78(1H，dd，J＝10.4，3.8Hz，6-H)，3.21(1H，d，J＝9.9Hz，13-H)，2.44(3H，s，4’-CH₃)，1.09(6H，s，18，19-CH₃)，

¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)：

MS(ESI)m/z(％)：541([M+Na]⁺)

实施例3当R₁＝R₂＝3’，4’-二甲氧基苯亚甲叉基时，通式2所示的冬凌草甲素衍生物(1-羰基7，14-(3’，4’-二甲氧基)苯亚甲叉冬凌草甲素，化合物IV)的制备：

第一步(1-羰基冬凌草甲素的制备)：在100ml圆底烧瓶中，加入0.5g冬凌草甲素，40ml丙酮，0℃搅拌下缓慢滴加6ml Jone’s试剂，室温反应2小时后，加入0.4ml异丙醇，反应0.5小时，加入0.5g碳酸氢钠，反应0.5小时，加入50ml乙酸乙酯稀释，过滤，滤液减压浓缩后得白色固体，用石油醚-丙酮重结晶得无色针状晶体0.423g，产率85％。M.p.220～222℃。ESI-MS(m/z)：385.4([M+Na]⁺)；¹H-NMR(400MHz，Acetone)δ：6.53(1H，s，14-OH)，6.10(1H，s，17-H)，5.62(1H，s，17-H)，5.40(1H，d，J＝11.3Hz，6-OH)，5.24(1H，s，7-OH)，4.90(1H，s，14-H)，4.21，3.91(各1H，d，J＝10.6Hz，20-H)，3.70(1H，dd，J＝11.2，2.5Hz，6-H)，3.01(1H，d，J＝9.4Hz，13-H)，1.14，0.96(各3H，s，18，19-CH₃)；¹³C-NMR(100MHz，Acetone)：212.6(1-C)，207.4(15-C)，153.1(16-C)，120.8(17-C)，99.4(7-C)，73.9(6-C)，73.4(14-C)，65.3(20-C)，62.4(8-C)，61.2(5-C)，50.1(9-C)，49.3(13-C)，44.1(10-C)，39.3(3-C)，36.2(4-C)，33.5(19-C)，31.1(12-C)，30.7(2-C)，23.8(18-C)，19.6(11-C).

第二步(1-羰基7，14-(3’，4’-二甲氧基)苯亚甲叉冬凌草甲素的制备)：在250ml圆底烧瓶中，加入5g 1-羰基冬凌草甲素冬凌草甲素和100ml甲苯，搅拌下加入8g 3，4-二甲氧基苯甲醛和0.2g对甲苯磺酸，80℃反应4小时。停止反应，用水和乙酸乙酯萃取，有机相用饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化铵溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥过夜，过滤，滤液减压浓缩后得白色固体，过硅胶柱层析，用石油醚-丙酮(8∶1)洗脱，得无色针状晶体6.5g，产率93％。M.p.242～244℃。

化合物分子式：C₂₉H₃₄O₈

谱图数据如下：IR v_max ^KBr(cm^-1)：3392，3019，2958，2840，1702，1646，1590，1518，1461，1264，1163，1137，1079，1029，910，812，753

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：6.98(1H，dd，J＝8.2，1.8Hz，6’-H)，6.91(1H，d，J＝1.8Hz，2’-H)，6.80(1H，d，J＝8.2Hz，5’-H)，6.20(1H，s，苯亚甲叉上H)，6.16(1H，s，17-H)，5.61(1H，s，17-H)，5.50(1H，d，J＝9.7Hz，6-OH)，，4.93(1H，s，14-H)，4.34，4.11(各1H，d，J＝10.7Hz，20-H)，4.01(1H，dd，J＝11.8，3.4Hz，6-H)，3.83(6H，s，3’，4’-甲氧基)，3.20(1H，d，J＝9.2Hz，13-H)，1.25，1.06(各3H，s，18，19-CH₃)

¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)：

MS(ESI)m/z(％)：533([M+Na]⁺)

实施例4当R₁＝对甲苯磺酰基，R₂＝H时，通式2所示的冬凌草甲素衍生物(1-羰基-14-对甲苯磺酰基冬凌草甲素，化合物V)的制备：

第一步(1-羰基冬凌草甲素的制备)：同实施例3。

第二步(1-羰基-14-对甲苯磺酰基冬凌草甲素的制备)：在250ml圆底烧瓶中，加入5g 1-羰基冬凌草甲素，150ml二氯甲烷和2ml三乙胺，搅拌下加入5g对甲苯磺酰氯，0℃反应4小时后，加入少量水淬灭反应，用水和乙酸乙酯萃取，有机相用饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化铵溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥过夜，过滤，滤液减压浓缩后得白色固体，用石油醚-丙酮重结晶得无色针状晶体6.8g，产率96％。M.p.255～257℃。

化合物分子式：C₂₇H₃₂O₈S

谱图数据如下：IR v_max ^KBr(cm^-1)：3401，2924，1705，1645，1441，1381，1301，1055，1031，910，823，753

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：7.82(2H，d，J＝8.3Hz，3’，5’-H)，7.34(2H，d，J＝8.3Hz，2’，6’-H)，6.26(1H，s，17-H)，5.65(1H，s，17-H)，5.63(1H，s，7-OH)，5.24(1H，d，J＝11.5Hz，6-OH)，4.17，3.98(各1H，d，J＝10.8Hz，20-H)，3.91(1H，s，14-H)，3.74(1H，dd，J＝11.5，2.7Hz，6-H)，3.47(1H，d，J＝9.6Hz，13-H)，2.44(3H，s，4’-CH₃)，1.17，0.97(各3H，s，18，19-CH₃)

¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)：

MS(ESI)m/z(％)：539([M+Na]⁺)

冬凌草甲素衍生物(II-V)的体外抗肿瘤活性通过四氮唑盐还原法(MTT法)测定。RPMI 1640培养基、青霉素、链霉素、胎牛血清购自Gibco公司；胰酶购自Amresco公司；DMSO、MTT为Sigma公司产品。人体乳腺癌MCF-7、人纤维肉瘤HT1080、人宫颈癌Hela细胞株用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃ CO₂培养箱中常规培养，隔天传代。取对数生长期的各种肿瘤细胞，用胰酶消化，制成每毫升含1×10⁵个细胞的单细胞悬液，接种于96孔板内(每孔200μL)，每组设3个平行孔。贴壁24小时后加入不同浓度的受试物培养48小时，同时设空白对照组和阳性对照组(冬凌草甲素I)，进行MTT测定，计算IC₅₀值。(结果见表1)

表1冬凌草甲素衍生物的体外抗肿瘤活性(IC₅₀：μmol/L)

	人乳腺癌MCF-7	人子宫颈癌Hela	人纤维肉瘤HT1080
				I	22.34	20.23	9.62
II	6.19	20.31	9.56
				III	4.47	13.71	9.03
IV	2.46	12.27	14.26
				V	5.00	15.13	17.04

Claims (3)

1.冬凌草甲素衍生物，其特征以下面通式表示：

    通式1                    通式2

在通式1中，R₁和R₂为H或3’，4’-二甲氧基苯亚甲叉，或为3’，4’-二甲氧基苯亚甲叉基；

在通式2中，R₁和R₂为H或对甲苯磺酰基，或为3’，4’-二甲氧基苯亚甲叉基。

2.一种制备如权利要求1所属通式1所示化合物的方法，其特征在于：

a将冬凌草甲素在甲苯的存在下，与3，4-二甲氧基苯甲醛和对甲苯磺酸反应，得到通式1所示的化合物3’，4’-二甲氧基苯亚甲叉冬凌草甲素；

b将冬凌草甲素在二氯甲烷和三乙胺的存在下，与对甲苯磺酰氯反应，得到通式1所示的化合物对甲苯磺酰冬凌草甲素。

3.一种制备如权利要求1所属通式2所示化合物的方法，其特征在于：

a首先将冬凌草甲素与丙酮和Jone’s试剂反应，得到1-氧化冬凌草甲素；

b将1-氧化冬凌草甲素在甲苯的存在下，与3，4-二甲氧基苯甲醛和对甲苯磺酸反应得到通式2所示的化合物3’，4’-二甲氧基苯亚甲叉1-氧化冬凌草甲素；

c将1-氧化冬凌草甲素在二氯甲烷和三乙胺的存在下，与对甲苯磺酰氯反应通式2所示的化合物对甲苯磺酰1-氧化冬凌草甲素。

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