CN101721534B - 鱼腥草总多糖及其制备方法和在制药中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属中药领域,涉及中药鱼腥草总多糖新的药用用途。具体涉及鱼腥草总多糖在制备防治急性肺损伤药物和解热药物中的用途。本发明从中药鱼腥草(Houttuynia cordataThunb.)中分离提取得到总多糖提取物,产物收率3%以上,多糖含量超过70%,糖醛酸含量超过30%,蛋白质含量不超过9%。所述总多糖提取物经体外实验证实,对补体经典和旁路途径激活所引发的细胞溶血均有抑制作用,显示抗补体活性;整体动物模型试验显示,对内毒素诱导的大鼠急性肺损伤有明显的保护作用,证实对急性肺损伤有防治作用;对内毒素诱发的大鼠发热有明显的缓解作用和解热作用。可用于制备防治急性肺损伤、防治急性呼吸窘迫综合征、解热和防治流感等药物。
Description
技术领域
本发明属中药领域,涉及中药鱼腥草总多糖新的药用用途。具体涉及鱼腥草总多糖在制备防治急性肺损伤药物和解热药物中的用途。
背景技术:
急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是指机体遭受严重感染、创伤、辐射、休克等打击后,出现的以弥漫性肺泡毛细血管膜损伤导致的肺水肿为病理特征的一种肺部炎症和肺通透性增加综合征,是急性呼吸窘迫症(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的早期阶段,其病理生理改变以肺顺应性降低、肺内分流增加及通气/血流比例失调为主,是临床上较为常见的危急重症之一。该疾患主要表现为顽固性低氧血症和呼吸窘迫,病人常由于急性低氧性呼吸功能不全或衰竭而导致死亡。国内外学者研究认为,ALI可能是一种以急性免疫损害和免疫清除为主要机制的免疫性疾病,主要表现为单核巨噬细胞等炎性细胞的浸润、多种细胞因子及黏附分子的过度表达及补体过度活化。研究显示,补体激活产生的过敏毒素(C3a、C4a、C5a)促进肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放组胺并使中性粒细胞在肺内聚集,导致肺泡内皮和上皮的完整性被破坏、氧自由基过度释放,从而引发肺水肿、肺顺应性下降、血氧含量下降、加重内皮细胞的损伤,形成急性肺损伤(张中吉,卢青,等.中国危重病急救医学,2003,15(3):186-189.马俊清,白倩蕾,等.中国全科医学,2008,22:2061-2063.Robbins R.A.,Russ W.D.,et al..The American Review of Respiratory Disease 1987,135(3):651-658.)。因此,寻找高效低毒的补体抑制剂是研制防治ALI药物的有效途径之一。
发热是急性感染性疾病的主要病症之一,除体温增高外,常伴有神经内分泌、免疫等多种生理功能改变的一系列全身性反应,持续的高热将对机体造成严重损伤。据调查,若干清热解毒中药具有解热抗炎作用,其中的中药亦曾对SARS的防治起到重要作用,对于减轻SARS病毒反应症状、缩短发热天数等疗效显著。据报道,补体系统激活的超敏反应参与了SARS的发病机制,并起到重要作用(廖伟娇,黎毅敏,等.广东医学,2003,24(z1):59-60;Zhong X.F.,Guo Z.F.,et al..Journal of General Virology,2006(87):369-373.)。鱼腥草等清热解毒药很可能就是通过抑制补体的过度激活来解除SARS等急性感染性疾病的发热症状。
目前,临床上常用糖皮质激素、抗生素等药物治疗ALI和发热,但治疗效果不甚理想,尤其是激素应用副作用较多。已有研究(Ward P.A.,Mulligan M.S..Journal ofMolecular Medicine,1991,69(21):1432-1440.Harkin D.W.,Marron C.D.,et al..TheBritish Journal of Surgery,2005,92(10):1227-1234.)表明,用可溶性补体受体(sCR1)、C5单克隆抗体治疗ALI,取得一定效果,但价格昂贵。一些传统的解热镇痛药物,如阿司匹林、扑热息痛等,在临床治疗的过程中也表现出较为严重的副作用。目前迫切需要解决的问题是:持久、有效、稳定地降低患者的过高体温、提高治疗ALI的临床疗效,减少或者拮抗大量抗生素和激素应用所带来的免疫功能低下、骨质疏松等副作用等。综上所述,临床实践急需高效低毒的药物来进行急性肺损伤和高热的治疗。
鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的带根全草,是一种常用的清热解毒中药,临床上用于肺炎、上呼吸道感染、流感、肝炎等病的治疗。现代药理研究表明,鱼腥草具有抗菌、抗病毒、抗炎、镇痛、抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗过敏、利尿、心肌保护等药理作用。鱼腥草主要含挥发油、黄酮、生物碱、氨基酸、甾醇及有机酸等化学成分(国家中医药管理局.中华本草(上册).上海:上海科学技术出版社,1996.605),其中挥发油中的癸酰乙醛以及洋芹素、槲皮素等黄酮类成分为抗菌、抗病毒有效成分(史惠,任利斌.贵阳中医学院学报,1998,3:61-64;Choi H.J.,Kim J.H.,Lee C.H.,et al..Antiviral Research,2009,81:77-81.)。鱼腥草注射液具有明显的解热作用(王慧玲,崔伟,秦鑫,等.中国临床药理学与治疗学,2007,12(1):78-81),同时对于油酸性急性肺损伤具有保护作用,且能改善肺组织中TNF-α的表达(李风雷,刘晓晴,柳青,等.中国病理生理杂志,2003,19(4):547-548)。复方鱼腥草滴丸对啤酒酵母致热模型也有一定的解热作用,并有较强的抗炎作用(冯平安,叶寿山,韩传环,等.安徽教育学院学报,2002,20(6):66-68)。但鱼腥草多糖的药理作用尚未见报道。
纵观国内外研究,均未见关于鱼腥草抑制补体激活的报道,以及鱼腥草总多糖有关防治急性肺损伤和解热的药效及其药物的报道。
发明内容
本发明的目的是提供鱼腥草总多糖及其制备方法和在制药中的新用途。具体涉及鱼腥草总多糖在制备防治急性肺损伤药物和解热药物中的用途。
本发明从中药鱼腥草中分离提取得到总多糖提取物。所述总多糖提取物经体外实验证实有较强抗补体活性,整体动物模型试验证实其具有很强的防治急性肺损伤和解热的作用。
本发明中,所述的中药鱼腥草即指三白草科(Saururaceae)蕺菜(Houttuynia cordataThunb.)的全草。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
1、制备鱼腥草总多糖:
鱼腥草药材粉碎后,以95%乙醇冷浸提取三次,过滤,药渣于室温下置通风处晾干,然后用热水提取3次,过滤,合并提取液,浓缩,离心,上清液以三氯醋酸去游离蛋白,离心,上清液用水透析3天,透析液浓缩至小体积后加乙醇至含醇量80%,离心,沉淀冷冻干燥即得总多糖提取物,收率达3%以上,多糖含量超过70%,蛋白质含量不超过9%,糖醛酸含量超过30%。
2、鱼腥草总多糖用于抗补体试验:
1)抗补体激活经典途径细胞溶血试验豚鼠血清1∶40稀释液作为补体,抗原激活补体经典途径导致羊红细胞溶血,结果显示,鱼腥草总多糖可抑制细胞溶血,CH50(半数抑制浓度)=0.092±0.020mg/ml(n=3)。
2)抗补体激活旁路途径细胞溶血试验:
采用健康人血清1∶8稀释液作为补体,激活补体旁路途径导致兔红细胞溶血,结果显示,鱼腥草总多糖可抑制溶血,AP50(半数抑制浓度)=0.209±0.036mg/ml(n=3)。
3、鱼腥草总多糖用于防治急性肺损伤体内试验:
选用SD大鼠,以缺血再灌注+内毒素(LPS)二次打击,建立与补体过度激活相关的急性肺损伤模型。鱼腥草总多糖灌胃给药,分别在0、2、4h从颈动脉抽血观察动物血清中总补体含量、4h外周血白细胞计数和4h血清中C3、C4含量。将试验大鼠在实验结束后放血处死,结扎右肺,收集支气管肺泡灌洗液,观察SOD、MDA、蛋白质含量、白细胞总数及白细胞分类计数。取右肺上叶,石蜡固定,切片,显微镜下观察病理改变。取右肺下叶,测定肺湿/干重比。结果显示,给予鱼腥草总多糖后,抑制了各时间点血清总补体含量及4h血清中C3、C4含量的下降,抑制了ALI引起的4h外周血和肺泡灌洗液中的白细胞数量的增加,改善了肺部过氧化状态,减轻了肺部水肿程度、炎性病变状况。证实鱼腥草总多糖对于大鼠急性肺损伤具有防治作用。
4、鱼腥草总多糖用于解热作用体内试验:
选用Wistar大鼠,以腹腔注射LPS制备大鼠发热模型。所述的鱼腥草总多糖灌胃给药,连续6h监测大鼠体温变化。将试验大鼠在实验结束后放血处死,进行动物外周血白细胞计数,并检测动物的血清中总补体活性。结果证实口服鱼腥草总多糖后,对LPS诱导的大鼠发热均有较好的解热作用,明显抑制了补体的活化,且显著地抑制了外周血中白细胞增多。说明鱼腥草总多糖能缓解由LPS注射所引起的体内炎症程度和发热程度。
根据急性肺损伤(acute lung injury,ALI)其弥漫性肺泡毛细血管膜损伤导致的肺水肿的病理特征,临床诊断为肺部炎症和肺通透性增加综合征,是急性呼吸窘迫症(acuterespiratory distress syndrome,ARDS)的早期阶段,其主要的病理生理改变以肺顺应性降低、肺内分流增加及通气/血流比例失调为主,本发明的鱼腥草总多糖经试验证实,在体外对经典和旁路途径激活所引发的细胞溶血均有抑制,在体内对内毒素诱导的大鼠急性肺损伤和发热均具有防治作用。所述的鱼腥草总多糖可制备防治急性肺损伤药物和解热药物,用于治疗急性肺损伤与急性呼吸窘迫综合征。鉴于与所述的急性肺损伤具有相似病理特征及病理生理改变,本发明的鱼腥草总多糖还可用于制备防治重症非典型肺炎、人禽流感、甲型H1N1型流、季节性流感及抗补体药物。
附图说明
图1是ALI模型大鼠血清补体活性水平的变化率。
图2是ALI模型大鼠4h血清补体成分C3、C4水平。
图3是ALI模型大鼠支气管肺灌洗液中SOD水平。
图4是ALI模型大鼠支气管肺灌洗液中MDA水平。
图5是ALI大鼠肺切片图。
图6是伪手术组大鼠肺切片图。
图7是阳性对照(氢化泼尼松)大鼠肺切片图。
图8是鱼腥草总多糖大剂量给药组(100mg/kg)大鼠肺切片图。
图9是鱼腥草总多糖中剂量给药组(50mg/kg)大鼠肺切片图。
图10是鱼腥草总多糖小剂量给药组(25mg/kg)大鼠肺切片图。
图11是内毒素诱导发热的大鼠模型不同时间的平均体温变化值。
图12是内毒素诱导发热的大鼠模型体温反应指数(TRI)。
图13是内毒素诱导发热的大鼠外周血白细胞数量。
图14是内毒素诱导发热的大鼠血清总补体水平。
具体实施方式
实施例1
取鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb.)药材100g,粉碎,以95%乙醇冷浸提取3次,药渣于室温下置通风处晾干,然后用热水提取3次,过滤,合并提取液,浓缩,离心,上清液以三氯醋酸去游离蛋白,离心,上清液用水透析3天,透析液浓缩至小体积加乙醇至含醇量80%,离心,沉淀冷冻干燥即得总多糖,产物收率为3.52%-3.78%。采用硫酸-苯酚法测得鱼腥草总多糖的糖含量为74.3%-80.2%;采用间羟联苯法测得鱼腥草总多糖的糖醛酸含量为30.68%-41.43%;采用考马斯亮蓝法测得鱼腥草总多糖的蛋白质含量为4.81%-8.38%。
表1是本发明中三批鱼腥草多糖的收率及含量。
表1
实施例2
将鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb.)总多糖(约3.0mg/ml)用巴比妥缓冲液(barbitol buffer solution,BBS)对倍稀释得8个浓度的溶液,取0.2ml各浓度样品加入0.2ml补体(豚鼠血清1∶40稀释液),0.1ml 2%绵羊红细胞(sheep redbloodcell,SRBC)和0.1ml 1∶1000溶血素(抗SRBC抗血清),将每管37℃水浴30min后放入低温高速离心机4000rpm、4℃离心5min,分别取每管上清0.2ml于酶标仪405nm下测定吸光度,作为样品效价测定吸光度值。再将0.2ml各浓度样品溶液与0.4ml BBS混合,将每管37℃水浴30min后放入低温高速离心机以4000rpm、4℃离心5min,取每管上清0.2ml于酶标仪405nm下测定吸光度,作为样品吸光度本底值。再将每种不同浓度的样品效价测定吸光度减去相应浓度下样品吸光本底值即为加入药物后的溶血吸光度,并附加补体正常溶血管作为体系全溶血对照,计算得鱼腥草总多糖的CH50值为0.092±0.020mg/ml(n=3)。
实施例3
将鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb.)总多糖(约3.0mg/ml)用含Mg2+的明胶-巴比妥缓冲液[GVB/Mg(10mM)EGTA]对倍稀释得8个浓度的溶液,取0.15ml各浓度样品加入0.15ml补体(人血清1∶8稀释液),0.2ml 2%兔红细胞,将每管37℃水浴30min后放置入低温高速离心机以4000rpm、4℃离心5min,取每管上清0.2ml于酶标仪405nm下测定样品效价测定吸光度。再将0.15ml各浓度样品溶液与0.35mlGVB/Mg(10mM)EGTA混合,将每管37℃水浴30min后放置入低温高速离心机以4000rpm、4℃离心5min,取每管上清0.2ml于酶标仪405nm下测定样品吸光本底值。再将每种不同浓度的样品效价测定吸光度减去相应浓度下样品吸光本底值为加入药物后的溶血吸光度,并附加补体正常溶血管作为体系全溶血对照,计算得鱼腥草总多糖的AP50为0.209±0.036mg/ml(n=3)。
实施例4
SD雄性大鼠49只,随机分为6组(A、B、C、D、E、F组)。A组为伪手术组,B组为造模组,C、D、E组为鱼腥草多糖低剂量组(25mg/kg,i.g.)、中剂量组(50mg/kg,i.g.)、高剂量组(100mg/kg,i.g.),F组为阳性对照组(氢化泼尼松,prednisolone acetate,70mg/kg,ip)。造模组9只,其余每组8只。
除伪手术组外,其余各组动物腹腔注射1g/kg乌拉坦麻醉后仰位固定,分离右侧颈总动脉并插管,进行血压监测、抽血和再灌注。将动物放置20min稳定后,在随后的20min内自颈总动脉抽血至平均动脉压为40±5mmHg并维持,1h后再将全部采集血液在1h内缓慢回输。在回输血液至30min时给药。回输完毕后,在10min内经气管滴注LPS 1000μg/kg。气管内注入内毒素完毕时作为T0。伪手术组仅实施麻醉和颈动脉插管手术操作,在稳定20min后作为T0。各组所有动物在T0、T2h、T4h采血1.0ml,每次采血后回输等量生理盐水。将采集的血液4℃、4000rpm离心10min,取血清-70℃保存待测。各组动物在T4h时放血处死,开胸观察肺部损伤情况,在肺门部位进行结扎。取4℃生理盐水4ml/只灌洗左肺并收集灌洗液,灌洗液1000rpm离心10min,取上清2ml于-70℃保存待测。
结果显示,随时间延长,伪手术组补体活性水平略有下降,而造模组和鱼腥草多糖(25mg/kg)组的补体水平急剧下降,鱼腥草多糖(100mg/kg)、鱼腥草多糖(50mg/kg)两组的补体水平虽有下降,但跟造模组相比有明显抑制补体水平下降的趋势。以各动物在0h的补体溶血率作为100%,进行自身比较。
表2是ALI模型大鼠各时间点血清中补体水平的变化率(%,X±SD)。
表2 ALI模型大鼠各时间点血清中补体水平的变化率(%,X±SD)
*与ALl造模组比较P<0.05,**与ALI造模组比较P<0.01,***与ALI造模组比较P<0.001
与伪手术组相比,ALI模型组大鼠4h血清中补体成分C3、C4含量明显降低,支气管肺灌洗液中SOD含量明显降低、MDA值显著升高、蛋白质含量明显升高,外周血和支气管肺灌洗液中白细胞数量明显升高;给予鱼腥草多糖后,ALI模型大鼠的血清补体成分含量明显升高,支气管肺灌洗液中SOD含量有所上升、MDA值显著下降、蛋白质含量显著下降,外周血和支气管肺灌洗液中白细胞数量同时也明显减少。同时,ALI模型大鼠肺组织的湿/干重比显著上升,鱼腥草多糖使肺组织湿/干重比明显下降(见图2,图3,图4)。
表3是ALI模型大鼠各病理指标。
表3
*与ALI造模组比较P<0.05,**与ALI造模组比较P<0.01,***与ALI造模组比较P<0.001
通过对病理切片的观察,发现造模组和鱼腥草多糖(25mg/kg)组的病理切片上有明显的肺泡壁增厚,大量白细胞聚集,还有肺部出血现象,炎症很严重。阳性对照组和鱼腥草多糖(100mg/kg)、鱼腥草多糖(50mg/kg)组可以看出较清晰的肺泡轮廓,有较完整的肺泡结构,提示炎症症状较轻。伪手术组肺泡轮廓清晰,有较完整的肺泡结构;肺泡壁炎性细胞含量极少,无出血,无萎缩,提示基本无炎症(见图5,图6,图7,图8,图9,图10)。病理学专家在不知实验分组的情况下按病理切片所反映的肺部损伤情况进行评级,评级指标包括病变范围、肺泡壁厚、肺泡渗出、炎症程度、充血情况等,严重程度以0-4计分(0分表示没有病变,4分表示病变极其严重),每项均以该组平均评分表示,采用Mann-Whitney法进行组间比较,表4是ALI模型大鼠肺部病理切片评级。
结果表明,鱼腥草多糖可显著改善4h血清中补体成分C3、C4的下降,减少肺水肿的程度,改善肺部的过氧化程度(即,升高肺灌洗液中SOD水平,降低其MDA水平)和炎症症状,减少体内白细胞的产生,减少肺部白细胞的聚集和中性粒细胞的分泌。
因此说明,鱼腥草多糖在体内也有抑制补体的作用,且能不同程度地改善二次打击引起的缺氧及肺脏炎症,缓解急性肺损伤大鼠模型症状。
表4
*与ALI造模组比较P<0.05,**与ALI造模组比较P<0.01,***与ALI造模组比较P<0.001
实施例5
雄性Wistar大鼠(体重210±20g),实验前将大鼠在实验环境中适应至少3天,自由摄取食水,每天进行2次适应性体温测量操作。记录所测定的体温,排除应激性高体温,剔除自身体温波动较大者(连续2次相差0.5℃)或体温超过38℃者。实验前一天将大鼠置于特定鼠笼中,自由饮水,禁食10h。正式实验开始之前须进行基础体温的测定。测定实验动物的体温3次,每次间隔20min,取3次体温的平均值为基础体温。
将动物随机分为6组(A、B、C、D、E、F组)。A组为正常对照组,B组为造模组,C、D、E组分别为鱼腥草总多糖大、中、小剂量组,F组为阳性对照组。除了A、B组灌胃给予生理盐水,其余各组灌胃给予相应的药物1.5ml,F组灌胃给予阿司匹林150mg/kg作为阳性对照。30min后,除了A组腹腔注射生理盐水1ml,其余各组均腹腔注射内毒素(LPS)50μg/kg。从0min开始6h内每隔30min测定一次体温,即于30min、60min、90min、120min、150min、180min、210min、240min、270min、300min、330min、360min进行体温测定,并定时观察实验动物是否表现出精神萎靡、寒颤、腹泻等症状。
将每个时间点记录的体温减去基础体温即得ΔT值,以每个时间点的ΔT值绘制体温变化曲线,并计算平均体温反应指数(TRI)。平均体温反应指数(TRI)即体温变化曲线与基线之间的面积。以cm2为单位,在坐标纸上以时间为横坐标轴,1h=1cm,发热高度为纵坐标,1℃=2cm,按梯形面积计算法计算6h体温变化曲线下的面积,所得的值即TRI值。结果显示,与正常对照组相比,内毒素诱导的发热模型大鼠体温明显升高。鱼腥草多糖对发热模型大鼠的体温有明显的降低作用,并能改善动物所表现出的发热症状(图11,附图12)。
表5是内毒素诱导发热的大鼠体温变化值及体温反应指数(TRI)(X±SD)。
表5
*与发热模型组比较P<0.05,**与发热模型组比较P<0.01,***与发热模型组比较P<0.001。
6h后,股动脉取血,进行白细胞计数,并将全血离心得血清,进行血清总补体活性的测定,以全溶血管(0.4mlH2O+0.1ml溶血素+0.1mlSRBC)作为100%溶血对照。与正常对照组相比,内毒素诱导的发热模型大鼠外周血白细胞数量显著上升。口服鱼腥草多糖后,发热模型大鼠的外周血白细胞数量明显降低(见图13)。
内毒素诱导发热后,大鼠血清总补体水平大幅度下降;鱼腥草总多糖给药组动物血清的补体水平有所上升(图14)。
表6是内毒素诱导发热的大鼠外周血白细胞数量及血清总补体水平(X±SD)。
表6
*与发热模型组比较P<0.05,**与发热模型组比较P<0.01,***与发热模型组比较P<0.001
Claims (2)
1.鱼腥草总多糖在制备防治急性肺损伤与急性呼吸窘迫综合征药物中的用途;
所述的鱼腥草总多糖通过下述方法制备:
取鱼腥草药材100g,粉碎,以95%乙醇冷浸提取三次,药渣于室温下置通风处晾干,然后用热水提取3次,过滤,合并提取液,浓缩,离心,上清液以三氯醋酸去游离蛋白,离心,上清液用水透析3天,透析液浓缩至小体积加乙醇至含醇量80%,离心,沉淀冷冻干燥即得总多糖,产物收率达3%以上,多糖含量超过70%,糖醛酸含量超过30%,蛋白质含量不超过9%。
2.权利要求1的鱼腥草总多糖在制备解热药物中的用途。
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2010
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