CN101710095B - 一种利用电荷识别效应测定多巴胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用电荷识别效应测定多巴胺的方法。将金电极用氧化铝粉抛光，依次在硝酸、无水乙醇和纯水泡洗，取出后超声洗涤5min，即得到干净的裸金电极。将金电极放入10-15mL含0.01mol/L半胱氨酸的0.1mol/L的HCl溶液中6h，即制得半胱氨酸修饰电极。然后电极再次在10-15mL含有0.02mol/L 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和0.04mol/L N-羟基琥珀酰亚胺的0.05mol/L二亚乙基三胺五乙酸的混合溶液中浸泡5h，即可制得二亚乙基三胺五乙酸/半胱氨酸/金修饰电极。对人体血清样品DA的含量进行检测，常见的干扰物质抗坏血酸、尿酸及其他氧化电位与DA相近的物质未见有明显的干扰。本发明能够用来测量血清中多巴胺的浓度，制作简单，使用方便。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用电荷识别效应测定多巴胺的方法，可用于人体血清样品中多巴胺的测定。
背景技术
多巴胺(3，4-二羟基-β-苯乙胺，DA)是一种非常重要的神经递质，且与帕金森病、亨丁顿舞蹈症和多动症等病症息息相关。目前，测量DA浓度的方法有很多，电化学方法因灵敏度高、选择性好而广泛应用，尤其是电化学型生物传感器能够进行活体分析，这一优点是其他方法无法比拟的。金刚石电极、玻碳电极、铂电极和金电极等裸电极都可以用来测DA，但抗坏血酸(AA)和尿酸(UA)因为氧化还原电位与DA相近，从而干扰最终测定结果。为了解决这个问题，人们做出了很多努力，例如：离子交换膜、离子液体-凝胶膜、聚合膜和自组装膜等。离子交换膜中最典型的膜就是Nafion膜，但Nafion膜有常见的几个缺点：膜厚度不均一、重现性差、响应时间长、价格昂贵，而自组装能够克服Nafion膜的这些缺点。二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)是一个由五个羧基(pKa(电离平衡常数)1.9，2.9，4.4，8.7，10.5)修饰二乙三胺的无机螯合物。目前还没有文献报道利用DTPA螯合物的静电识别来测定DA。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、选择性好可以对人血清样品中的多巴胺进行测定的方法。
构思如下：多巴胺在电极上明显的氧化还原峰，但是与多巴胺一同存在于血液中的抗坏血酸也有明显的氧化还原峰，且峰电位与多巴胺的峰电位相近。通过二亚乙基三胺五乙酸的电荷识别作用，多巴胺在电极上有响应，而抗坏血酸和尿酸则几乎没有响应，从而达到消除干扰的目的。
其基本原理是：在pH为7.4的磷酸缓冲溶液中，二亚乙基三胺五乙酸有五个羧基(pKa 1.9，2.9，4.4，8.7，10.5)，易带负电荷；多巴胺(pKa＝8.87)易带正电荷；而AA(pKa＝4.1)易带负电荷。根据电荷识别效应，带负电荷的二亚乙基三胺五乙酸吸引正电荷的多巴胺而排斥带负电荷抗坏血酸，从而消除了抗坏血酸的干扰。
具体步骤如下：
一、金电极的处理：
将金电极用氧化铝粉抛光，依次在硝酸(体积比为1∶1)、无水乙醇和纯水泡洗，取出后超声洗涤5min，即得到干净的裸金电极。
二、修饰电极的制备：
首先将金电极放入10-15mL含0.01mol/L半胱氨酸的0.1mol/L的HCl溶液中6h，即制得半胱氨酸修饰电极。然后电极再次在10-15mL含有0.02mol/L1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和0.04mol/L N-羟基琥珀酰亚胺的0.05mol/L二亚乙基三胺五乙酸的混合溶液中浸泡5h，即制得二亚乙基三胺五乙酸/半胱氨酸/金修饰电极。
三、干扰实验：
相对于5×10-6mol/L的多巴胺、5×10-5mol/L的抗坏血酸和5×10-5mol/L尿酸分别使多巴胺的峰电流增大了0.2％和1.2％，表明5×10-5mol/L的抗坏血酸和5×10-5mol/L尿酸对5×10-6mol/L的多巴胺无明显干扰，充分表明三胺五乙酸/半胱氨酸膜有良好的选择性。
四、标准工作曲线的绘制：
取20mL小烧杯，加入含0.1mol/L KCl的0.2mol/L磷酸缓冲溶液10mL，逐次加入25μL 5.0×10-5、5.0×10-6mol/L多巴胺溶液，根据多巴胺浓度c与峰电流i写出线性方程为i(μA)＝-3.8575c-0.8750×10-2，相关系数R为0.9971。
五、人体血清样品中多巴胺含量的测定：
将0.5mL除掉人血清白蛋白(HAS)后的血样加入到4.5mL 0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中，用标准加入法测人血清样品中多巴胺的浓度，并测量加标回收率。
本发明能够用来测量血清中多巴胺的浓度，且制作简单，使用方便。
附图说明
图1为本发明实施例修饰电极的安培i-t曲线，施加电位0.18V，磁力搅拌下连续加入5.0×10-5mol/L尿酸、5.0×10-5mol/L抗坏血酸和5.0×10-6mol/L多巴胺。
图2为本发明实施例修饰电极的安培i-t曲线，施加电位0.18V，磁力搅拌下连续加入5.0×10-5和5.0×10-6mol/L多巴胺。
具体实施方式
实施例：
将金电极依次用1.0μm、0.3μm和0.05μm的氧化铝粉抛光，依次在硝酸(体积比为1∶1)、无水乙醇和纯水泡洗，取出后超声洗涤5min。将裸金电极放入含0.01mol/L半胱氨酸的0.1mol/L的10mL的HCl溶液中6h，即制得半胱氨酸修饰电极。此裸金电极如果表面有其他杂质，则半胱氨酸很难修饰至电极上。然后再将制得的半胱氨酸修饰电极在含有0.02mol/L 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和0.04mol/L N-羟基琥珀酰亚胺的0.05mol/L二亚乙基三胺五乙酸的10mL混合溶液中浸泡5h，即制得二亚乙基三胺五乙酸/半胱氨酸/金修饰电极。
取20mL小烧杯，加入含0.1mol/L KCl的0.2mol/L磷酸缓冲溶液10mL，搅拌的情况下，逐次加入25μL 5.0×10-5、5.0×10-6mol/L多巴胺溶液，多巴胺浓度与峰电流的安培i-t曲线如图2，在1.0×10-7-6.0×10-3mol/L范围内，多巴胺浓度与氧化峰电流之间的线性方程为i(μA)＝-3.8575c-0.8750×10-2，相关系数R为0.9971，检出限(S/N＝3)为3.0×10-8mol/L。
用标准加入法测量人血清样品中多巴胺的浓度，为了避免人血清白蛋白的干扰，将0.2克的三氯乙酸加入到1mL血样中，在3000r/min的转速下离心10min，除掉沉淀的蛋白质，再取0.5mL清液转至4.5mL 0.2mol/L磷酸缓冲溶液中，利用伏安法对待测液进行测量，扫描电压-0.1V到0.6V。读出峰电流值i。用i(μA)＝-3.8575C-0.8750×10-2计算出C。即可知此血样中中所含多巴胺的量。1min后，加入5.0×10-6mol/L多巴胺，测回收率。
结果见表1。测定结果的回收率在99.6-100.8％之间，表明此方法可以用来准确测量血清中多巴胺的含量。
表1.人血清样品中多巴胺的含量和回收率
| 样品 | 测量值(μmol·L-1) | 加入量(μmol·L-1) | 回收率(％) |
| 1 | 4.24 | 0.5 | 100.8 |
| 2 | 2.99 | 0.5 | 100.4 |
| 3 | 3.58 | 0.5 | 99.6 |
| 4 | 1.44 | 0.5 | 100.2 |
Claims (1)
1.一种利用电荷识别效应测定多巴胺的方法，其特征在于具体步骤如下：
一、金电极的处理：
将金电极用氧化铝粉抛光，依次在体积比为1∶1的硝酸、无水乙醇和纯水泡洗，取出后超声洗涤5min，即得到干净的裸金电极；
二、修饰电极的制备：
首先将裸金电极放入10-15mL含0.01mol/L半胱氨酸的0.1mol/L的HCl溶液中6h，即制得半胱氨酸修饰电极；然后电极再次在10-15mL含有0.02mol/L1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和0.04mol/L N-羟基琥珀酰亚胺的0.05mol/L二亚乙基三胺五乙酸的混合溶液中浸泡5h，即制得二亚乙基三胺五乙酸/半胱氨酸/金修饰电极；
三、干扰实验：
相对于5×10-6mol/L的多巴胺，5×10-5mol/L的抗坏血酸和5×10-5mol/L尿酸分别使多巴胺的峰电流增大了0.2％和1.2％，表明5×10-5mol/L的抗坏血酸和5×10-5mol/L尿酸对5×10-6mol/L的多巴胺无明显干扰，表明三胺五乙酸/半胱氨酸膜有良好的选择性；
四、标准工作曲线的绘制：
取20mL小烧杯，加入含0.1mol/L KCl的0.2mol/L磷酸缓冲溶液10mL，逐次加入25μL 5.0×10-5、5.0×10-6mol/L多巴胺溶液，根据多巴胺浓度c与峰电流i写出线性方程为i＝-3.8575c-0.8750×10-2，i的单位为μA，相关系数R为0.9971；
五、人体血清样品中多巴胺含量的测定：
将0.5mL除掉人血清白蛋白后的血样加入到4.5mL 0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中，用标准加入法测人血清样品中多巴胺的浓度，并测量加标回收率。
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| 李磊,盛庆林,沈宇,郑建斌..多巴胺及抗坏血酸在CTAB/CS复合物膜修饰电极上的电化学行为及其测定.《陕西师范大学学报(自然科学版)》.2008,第36卷64-68. * |
| 李磊，盛庆林，沈宇，郑建斌。.多巴胺及抗坏血酸在CTAB/CS复合物膜修饰电极上的电化学行为及其测定.《陕西师范大学学报（自然科学版）》.2008,第36卷64-68. |
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