CN101703524B - 一种水蛭及含有水蛭的制剂的质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水蛭及含有水蛭的制剂的质量控制方法，该方法是以琥珀酸或琥珀酸钠为指标成分，通过对其定性和/或定量测定来对所述水蛭及含有水蛭的制剂进行质量控制。根据本发明所提供的这种更可靠、更准确地评价水蛭及含有水蛭的制剂的质量控制方法，可以对水蛭及含有水蛭的制剂进行精确地质量控制，从而提高药物的质量控制水平，确保制剂质量的均一性和疗效的稳定性。

Description

一种水蛭及含有水蛭的制剂的质量控制方法

技术领域

本发明涉及中药领域，具体而言，本发明涉及中药材水蛭及含有水蛭、或水蛭提取物、或水蛭有效部位、或水蛭有效部位群的药物制剂的质量控制方法。

背景技术

水蛭为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudonipponica Whitman或柳叶蚂蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥全体，夏、秋两季捕捉，用沸水烫死，晒干或低温干燥。其味咸、苦，性平，归肝经，有小毒，有破血、逐瘀、通经之效，用于癥瘕痞块、血瘀闭经、跌扑损伤；主治月经闭止、癥瘕腹痛、蓄血、损伤瘀血作痛、痈肿丹毒等症。

水蛭作为经典的破血逐瘀药物，为药典所收载。《中国药典》收载的水蛭药材品种有三种，其中作为药用的主要品种为水蛭科动物蚂蟥(whitmania pigra whitman)。水蛭是一味传统的活血化瘀中药，临床应用广泛，其主要成分为蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、酶、糖类及微量元素等，研究表明，水蛭素是其主要的活血成分之一，但是水蛭素在水蛭药材中含量极低。目前，国内外上市的中成药中，有一部分就是含有水蛭或水蛭提取物的制剂，这类制剂主要用于治疗心脑血管疾病，并取得了良好的效果，如脑血康、蛭龙血通、水蛭胶囊、脑血康滴丸、复方水蛭口服液、芪参胶囊、通心络胶囊等。但是，由于对水蛭中化学成分研究不充分，导致现有的药品标准中对水蛭或水蛭提取物的质量控制方法大多数为浸出物检查、水蛭对照药材薄层鉴别等，例如，《中华人民共和国药典2005版一部》水蛭药材标准中采用水蛭对照药材薄层鉴别，其含量测定只是粗略地记录水蛭浸出物消耗凝血酶的体积，以中和一个单位的抗凝血酶的量为一个抗凝血酶活性单位，其中规定，每1克水蛭药材含有抗凝血酶活性应不低于16.0U(式中的U为每1克含凝血酶活性单位，U/g)。这种鉴别或测量水蛭药材的方法，缺乏对水蛭中有效化学成分的定性鉴别和含量测定，专属性差，不能有效地控制水蛭及含有水蛭药物制剂的质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以有效控制水蛭药材及含有水蛭的药物制剂的质量的方法。

为了实现本发明的目的，本发明人进行了深入地研究，结果，本发明人首次在水蛭药材中分离得到琥珀酸和琥珀酸钠。琥珀酸(或琥珀酸钠)又称丁二酸(或丁二酸钠)，其具有解热、平喘和抗肿瘤等的作用，因此，水蛭药材及含水蛭的药物制剂中是否存在琥珀酸(或琥珀酸钠)及其含量的高低能在一定程度上反应水蛭药材及含水蛭的药物制剂的质量。在此基础上，本发明人研究了以琥珀酸或琥珀酸钠为指标成分，通过对其定性和/或定量测定来对所述水蛭及含有水蛭的制剂进行质量控制的方法，从而完成了本发明。

琥珀酸(丁二酸)            琥珀酸钠(丁二酸钠)

为了实现本发明的目的，本发明提供一种水蛭及含有水蛭的制剂的质量控制方法，该方法是以琥珀酸或琥珀酸钠为指标成分，通过对其定性和/或定量测定来对所述水蛭及含有水蛭的制剂进行质量控制。

在本领域中，所述质量控制通常是通过定性和/或定量测定来实现的。在本发明中，优选地，所述定性和/或定量是通过使用高效液相色谱法或薄层色谱法来进行的。

在本发明中，含有水蛭的制剂可以是水蛭单味药材提取物、或水蛭有效部位、或水蛭有效部位群的制剂，也可以是含有水蛭、或水蛭提取物、或水蛭有效部位、或水蛭有效部位群的复方制剂。其中优选地，所述含有水蛭的制剂包含水蛭和药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的载体是本领域技术人员所熟知的。在本文中，所述药学上可接受的载体是任选的，只要其不对制剂中有效成分的检测造成不利的影响即可，例如，其包括填充剂、润滑剂、崩解剂、润湿剂、溶剂等。

优选地，所述高效液相色谱法是按照下列步骤进行的：

1)将供试品制备成含有琥珀酸或琥珀酸钠的供试品溶液；

2)提供对照品溶液；

3)用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，柱温为25℃，检测波长为210nm，流动相为pH值为2.6的磷酸二氢钾缓冲盐水溶液，流速为1.0ml/min，理论塔板数按琥珀酸或琥珀酸钠计算不低于3000，分别将所述对照品溶液与所述供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积值用外标法计算琥珀酸或琥珀酸钠的含量。

其中，在步骤1)中，一种优选的方法是将供试品在溶剂(例如流动相)中处理(例如超声处理足够的时间)而配制成供试品溶液。所述供试品可以是不进行预处理的。其中一种优选的方法为：

1)将供试品粉碎，称取过40目筛的粉末1g，置于具塞的锥形瓶中，加50％甲醇50ml，超声处理60分钟；

2)将超声处理液滤过，残渣加50％甲醇洗涤，合并滤液和洗涤液；

3)水浴蒸干，残渣加20ml水溶解，用稀盐酸调pH值至1.5，以乙酸乙酯萃取4次，每次20ml，合并乙酸乙酯萃取液；

4)蒸干，残渣用50％甲醇溶解，并在10ml量瓶中用50％甲醇定容。

所述供试品也可以是进行预处理的，预处理的目的是使测定的结果更加清晰明确，从而方便该领域的专业技术人员判断和读取结果。预处理的方法可以包括：含水乙醇、含水甲醇或丙酮提取；醇沉；水沉；或以大孔树脂除杂纯化等等。

优选地，所述供试品溶液是通过下列步骤来制备的：

1)将供试品切成段，以70％的乙醇回流提取2次，每次1.5小时，合并两次醇提液，滤过，在0.06～0.08个大气压下减压回收乙醇并浓缩至浸膏，所述浸膏与所述供试品的重量比为1∶1；

2)向所述浸膏中加入95％的乙醇至含醇量为80％，放置过夜，滤过，滤液以NaOH水溶液调pH值至7.0，在冷却下放置过夜，滤过，将滤渣重结晶，然后将重结晶后的产物配制为所述供试品溶液。

优选地，所述供试品溶液是通过下列步骤来制备的：

1)将供试品切成段，以70％的乙醇回流提取2次，每次1.5小时，合并两次醇提液，滤过，在0.06～0.08个大气压下减压回收乙醇并浓缩至浸膏，所述浸膏与所述供试品的重量比为1.2∶1；

2)向所述浸膏中加入95％的乙醇至含醇量为80％，放置过夜，滤过，向滤液中加水进行水沉，放置过夜，过滤，滤液以盐酸调pH值至1.5，然后以乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，将回收乙酸乙酯后的产物上制备液相后配制成所述供试品溶液。

优选地，所述供试品溶液是通过下列步骤来制备的：

1)将供试品切成段，以70％的乙醇回流提取2次，每次1.5小时，合并两次醇提液，滤过，在0.06～0.08个大气压下减压回收乙醇并浓缩至浸膏，所述浸膏与所述供试品的重量比为1∶1，然后将所述浸膏加入水中进行水沉，放置过夜，滤过，得水沉液；

2)将大孔树脂湿法装柱，然后将所述水沉液上样，以水洗脱，流速为20ml/min，收集洗脱液，在80℃、0.06～0.08个大气压下减压回收水洗脱液中的水，浓缩得到浓缩液，所述浓缩液与所述供试品的重量比为1∶1；

3)向所述浓缩液中加入95％的乙醇至含醇量为80％，然后用NaOH将pH值调至7.5，滤过，将滤液在冷却下放置36小时，滤过，将滤渣重结晶，然后将重结晶后的产物配制为所述供试品溶液。

优选地，所述供试品溶液是通过下列步骤来制备的：

1)将供试品切成段，以70％的乙醇回流提取2次，每次1.5小时，合并两次醇提液，滤过，在0.06～0.08个大气压下减压回收乙醇并浓缩至浸膏，所述浸膏与所述供试品的重量比为1.2∶1，然后将所述浸膏加入水中进行水沉，放置过夜，滤过，得水沉液；

2)将大孔树脂湿法装柱，然后将所述水沉液上样，以水洗脱，流速为20ml/min，收集洗脱液，在80℃、0.06～0.08个大气压下减压回收水洗脱液中的水，浓缩得到浓缩液，所述浓缩液与所述供试品的重量比为1∶1；

3)用盐酸将所述浓缩液的pH值调至1.5，以乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，将回收乙酸乙酯后的产物上制备液相后配制成所述供试品溶液。

在所述步骤2)中，所述对照品溶液优选是通过下列步骤来制备的：称取琥珀酸或琥珀酸钠对照品10mg，加水超声使之溶解，并用水稀释成1mg/ml的溶液。

在所述步骤3)中，通过色谱峰的保留时间可以定性确定琥珀酸或琥珀酸钠，然后按峰面积值用外标法计算琥珀酸或琥珀酸钠的含量，从而可以进行水蛭及含有水蛭的制剂的质量控制。

明显地，本领域技术人员可以以琥珀酸或琥珀酸钠为指标成分，通过薄层色谱法对其定性和/或定量测定来对所述水蛭及含有水蛭的制剂进行质量控制。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在提供了一种更可靠、更准确的评价水蛭及含有水蛭的制剂的质量控制方法，运用本发明的方法可以对水蛭及含有水蛭的制剂进行精确地质量控制，从而提高了药物的质量控制水平，确保了制剂质量的均一性和疗效的稳定性。

附图说明

图1为检测水蛭药材中的琥珀酸的薄层色谱图，其中1为水蛭药材，2为琥珀酸对照品。

图2为检测脑络泰注射液中的琥珀酸的薄层色谱图，其中1为脑络泰注射液，2为琥珀酸对照品。

图3为检测水蛭药材中的琥珀酸钠的薄层色谱图，其中1为水蛭药材，2为琥珀酸钠对照品。

图4为琥珀酸对照品的HPLC色谱图。

图5为检测水蛭药材中的琥珀酸的HPLC色谱图。

图6为检测脑络泰注射液中的琥珀酸的HPLC色谱图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

在下文中，除非另有说明，否则涉及乙醇或甲醇的百分含量而言均是指它们的水溶液，并且含量为体积％。

实施例1：供试品溶液的制备

取干燥水蛭药材1千克，切成小段，以70％乙醇提取2次，第一次加醇量为7千克，第二次加醇量为6千克，每次回流提取1.5小时，合并两次醇提液，以200目的滤布滤过，在0.06～0.08个大气压下减压回收乙醇，将提取液浓缩至1千克(即浸膏与药材的重量之比为1∶1)，得浸膏，待用。

将浸膏以95％的乙醇醇沉到含醇量为80％，放置过夜，以滤纸滤过，滤液以NaOH水溶液调pH值至7.0，置冰箱中放置过夜，以滤纸滤过，得琥珀酸钠提取物粗结晶10.56克，以95％乙醇重结晶，得琥珀酸钠结晶9.71克。

取上述琥珀酸钠结晶10mg，精密称定，加50％的甲醇溶液超声溶解，并在10ml的量瓶中用50％的甲醇定容，即得供试品溶液。

实施例2：供试品溶液的制备

取干燥水蛭药材1千克，切成小段，以70％的乙醇提取2次，第一次加醇量为7千克，第二次加醇量为6千克，每次回流提取1.5小时，合并两次醇提液，以200目的滤布滤过，在0.06～0.08个大气压下减压回收乙醇，将提取液浓缩到1.2千克(即浸膏与药材重量比为1.2∶1)，得浸膏，待用。

将浸膏以95％的乙醇醇沉到含醇量为80％，放置过夜，以滤纸滤过，回收乙醇，加水至2.5千克，水沉，放置过夜，以滤纸过滤，滤液以盐酸调pH值至1.5，以乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，样品上制备液相(瓦立安牌218型，Varian UV-vis，Detector Modle 218)，得琥珀酸提取物结晶7.26克。

取上述琥珀酸结晶10mg，精密称定，加50％的甲醇溶液超声溶解，并在10ml的量瓶中用50％的甲醇定容，即得供试品溶液。

实施例3：供试品溶液的制备

取干燥水蛭药材1千克，切成小段，以70％的乙醇提取2次，第一次加醇量为7千克，第二次加醇量为6千克，每次回流提取1.5小时，合并两次醇提液，以200目的滤布滤过，在0.06～0.08个大气压下减压回收乙醇，将提取液浓缩到1.0千克(即浸膏与药材重量比为1∶1)，得浸膏，加水至2.5千克，水沉，放置过夜，滤过，得水沉液，待用。

取处理好的大孔树脂(HPD-100型)1.5千克，湿法装柱，上样，以3.6千克水洗脱，流速为20ml/min，收集洗脱液，在80℃、0.06～0.08个大气压下减压回收水洗脱液中的水，浓缩至1.0千克，待用。

将浓缩液以95％的乙醇醇沉到含醇量为80％，醇沉液以NaOH调pH值至7.5，以滤纸滤过，滤液置冰箱中放置36小时，得粗结晶10.82克，以95％乙醇重结晶，得琥珀酸钠结晶9.69克。

取上述琥珀酸钠结晶10mg，精密称定，加50％的甲醇超声溶解，并在10ml的量瓶中用50％的甲醇定容，即得供试品溶液。

实施例4：供试品溶液的制备

取干燥水蛭药材1千克，切成小段，以70％的乙醇提取2次，第一次加醇量为7千克，第二次加醇量为6千克，每次回流提取1.5小时，合并两次醇提液，以200目的滤布滤过，在0.06～0.08个大气压下减压回收乙醇，将提取液浓缩到1.2千克(即浸膏与药材重量比为1.2∶1)，得浸膏，加水至2.5千克，水沉，放置过夜，滤过，得水沉液，待用。

取处理好的大孔树脂(HPD-100型)1.5千克，湿法装柱，上样，以3.6千克水洗脱，流速为20ml/min，收集洗脱液，在80℃、0.06～0.08个大气压下减压回收水洗脱液中的水，浓缩至1.0千克，待用。

将浓缩液以盐酸调pH值至1.5，以乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，样品上制备液相(瓦立安牌218型，Varian UV-vis，Detector Modle 218)，得琥珀酸提取物结晶7.35克。

取上述琥珀酸结晶10mg，精密称定，加50％的甲醇超声溶解，并在10ml的量瓶中用50％的甲醇定容，即得供试品溶液。

实施例5：薄层色谱法检测水蛭药材中的琥珀酸

1)供试品溶液的制备

精密称取水蛭粉末(过40目筛)3g，置于具塞的锥形瓶中，加50％甲醇100ml，超声处理60分钟，取出，滤过，残渣加适量的50％甲醇洗涤，合并滤液和洗涤液，水浴蒸干，残渣加100ml水溶解，用稀盐酸调pH值至1.5，以乙酸乙酯萃取4次，每次100ml，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣用甲醇溶解，并在10ml量瓶中用甲醇定容。

2)对照品溶液的制备

称取琥珀酸对照品15mg，精密称定，加甲醇超声使之溶解，并在5ml的量瓶中用甲醇定容。

3)色谱条件

薄层板：硅胶G-0.6％CMC-Na(1∶2.5)板，(厚约0.3mm)，自然晾干；展开剂：苯-乙酸乙酯-乙酸(2∶1∶0.3)，上行展开后于120℃烘箱烤2h；显色剂：0.1％溴酚蓝/95％乙醇溶液，琥珀酸斑点为黄色，计算得R_f＝0.498，分离效果良好，薄层色谱图见图1。

实施例6：高效液相色谱法测定水蛭药材中琥珀酸的含量

1)色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，柱温25℃，检测波长210nm；流动相为pH值为2.6的磷酸二氢钾缓冲溶液，流速为1.0ml/min，理论塔板数按琥珀酸计算应不低于3000。

2)供试品溶液的制备：将水蛭药材粉碎，称取粉末(过40目筛)1g，精密称定，置于具塞的锥形瓶中，加50％甲醇50ml，超声处理60分钟，取出，滤过，残渣加适量的50％甲醇洗涤，合并洗涤液，水浴蒸干，残渣加20ml水溶解，用稀盐酸调pH值至1.5，以乙酸乙酯萃取4次，每次20ml，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣用50％甲醇溶解，并在10ml量瓶中定容，待测。

3)对照品溶液的制备：称取琥珀酸对照品10mg，精密称定，加水超声使之溶解，并用水稀释成1mg/ml的溶液。

4)测定法：照《中华人民共和国药典2005版一部》附录VI D的方法，精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，参见图4和图5。

按峰面积值用外标法计算样品含量，得每克水蛭药材中含琥珀酸7.153mg。

实施例7：薄层色谱法检测水蛭药材中的琥珀酸钠

1)供试品溶液的制备

按照与实施例1相同的方式制备琥珀酸钠供试品溶液。

2)对照品溶液的制备

称取琥珀酸钠对照品15mg，精密称定，加甲醇超声使之溶解，并在5ml的量瓶中用甲醇定容。

3)色谱条件

薄层板：硅胶G-0.6％CMC-Na(1∶2.5)板，(厚约0.3mm)，自然晾干；展开剂：苯-乙酸乙酯-乙酸(2∶1∶0.3)，上行展开后于120℃烘箱烤2h；显色剂：0.1％溴酚蓝/95％乙醇溶液，琥珀酸钠斑点为黄色，计算得R_f＝0.498，分离效果良好，薄层色谱图见图3。

实施例8：薄层色谱法检测脑络泰注射液中的琥珀酸

1)供试品溶液的制备

取脑络泰注射液(购自鲁南制药集团)2支，每支10ml，用水稀释至50ml，用稀盐酸调pH值至1.5，以乙酸乙酯萃取4次，每次50ml，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣用甲醇溶解，并在5ml量瓶中用甲醇定容，待测。

2)对照品溶液的制备

称取琥珀酸对照品10mg，精密称定，加甲醇超声使之溶解，并在5ml量瓶中用甲醇定容。

3)色谱条件

薄层板：硅胶G-0.6％CMC-Na(1∶2.5)板，(厚约0.3mm)，自然晾干；展开剂：苯-乙酸乙酯-乙酸(2∶1∶0.3)，上行展开后于120℃烘箱烤2h；显色剂：0.1％溴酚蓝/95％乙醇溶液，琥珀酸斑点为黄色，R_f＝0.503，分离效果良好，薄层色谱图见图2。

实施例9：高效液相色谱法测定脑络泰中琥珀酸的含量

1)色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，柱温25℃，检测波长210nm；流动相为pH值为2.6的磷酸二氢钾缓冲溶液，流速为1.0ml/min，理论塔板数按琥珀酸计算应不低于3000。

2)供试品溶液的制备：取脑络泰注射液2支，每支10m，用水稀释至50ml，用稀盐酸调pH值至1.5，以乙酸乙酯萃取4次，每次50ml，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣用甲醇溶解，并在5ml量瓶中用甲醇定容，待测。

3)对照品溶液的制备：称取琥珀酸对照品10mg，精密称定，加水超声使之溶解，并用水稀释成1mg/ml的溶液。

4)测定法：照《中华人民共和国药典2005版一部》附录VI D的方法精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，参见图6。

按峰面积值用外标法计算样品含量，得每毫升脑络泰注射液中含琥珀酸0.137mg。

Claims (9)

1.一种水蛭及含有水蛭的制剂的检测方法，其特征在于，该方法是以琥珀酸或琥珀酸钠为指标成分，通过对其定性和/或定量测定来进行检测的，所述定性和/或定量是通过使用高效液相色谱法或薄层色谱法来进行的。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有水蛭的制剂包含水蛭和药学上可接受的载体。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法是按照下列步骤进行的：

1)将供试品制备成含有琥珀酸或琥珀酸钠的供试品溶液；

2)提供对照品溶液；

3)用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，柱温为25℃，检测波长为210nm，流动相为pH值为2.6的磷酸二氢钾缓冲盐水溶液，流速为1.0ml/min，理论塔板数按琥珀酸或琥珀酸钠计算不低于3000，分别将所述对照品溶液与所述供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积值用外标法计算琥珀酸或琥珀酸钠的含量。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述对照品溶液是通过下列步骤来制备的：称取琥珀酸或琥珀酸钠对照品10mg，加水超声使之溶解，并用水稀释成1mg/ml的溶液。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液是通过下列步骤来制备的：

1)将供试品粉碎，称取过40目筛的粉末1g，置于具塞的锥形瓶中，加50％甲醇50ml，超声处理60分钟；

2)将超声处理液滤过，残渣加50％甲醇洗涤，合并滤液和洗涤液；

3)水浴蒸干，残渣加20ml水溶解，用稀盐酸调pH值至1.5，然后用乙酸乙酯萃取4次，每次20ml，合并乙酸乙酯萃取液；和

4)蒸干，残渣用50％甲醇溶解，并在10ml量瓶中用50％甲醇定容。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液是通过下列步骤来制备的：

1)将供试品切成段，以70％的乙醇回流提取2次，每次1.5小时，合并两次醇提液，滤过，在0.06～0.08个大气压下减压回收乙醇并浓缩至浸膏，所述浸膏与所述供试品的重量比为1∶1；

2)向所述浸膏中加入95％的乙醇至含醇量为80％，放置过夜，滤过，滤液以NaOH水溶液调pH值至7.0，在冷却下放置过夜，滤过，将滤渣重结晶，然后将重结晶后的产物配制为所述供试品溶液。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液是通过下列步骤来制备的：

1)将供试品切成段，以70％的乙醇回流提取2次，每次1.5小时，合并两次醇提液，滤过，在0.06～0.08个大气压下减压回收乙醇并浓缩至浸膏，所述浸膏与所述供试品的重量比为1.2∶1；

2)向所述浸膏中加入95％的乙醇至含醇量为80％，放置过夜，滤过，向滤液中加水进行水沉，放置过夜，过滤，滤液以盐酸调pH值至1.5，然后以乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，将回收乙酸乙酯后的产物上制备液相后配制成所述供试品溶液。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液是通过下列步骤来制备的：

1)将供试品切成段，以70％的乙醇回流提取2次，每次1.5小时，合并两次醇提液，滤过，在0.06～0.08个大气压下减压回收乙醇并浓缩至浸膏，所述浸膏与所述供试品的重量比为1∶1，然后将所述浸膏加入水中进行水沉，放置过夜，滤过，得水沉液；

2)将大孔树脂湿法装柱，然后将所述水沉液上样，以水洗脱，流速为20ml/min，收集洗脱液，在80℃、0.06～0.08个大气压下减压回收水洗脱液中的水，浓缩得到浓缩液，所述浓缩液与所述供试品的重量比为1∶1；

3)向所述浓缩液中加入95％的乙醇至含醇量为80％，然后用NaOH将pH值调至7.5，滤过，将滤液在冷却下放置36小时，滤过，将滤渣重结晶，然后将重结晶后的产物配制为所述供试品溶液。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液是通过下列步骤来制备的：

1)将供试品切成段，以70％的乙醇回流提取2次，每次1.5小时，合并两次醇提液，滤过，在0.06～0.08个大气压下减压回收乙醇并浓缩至浸膏，所述浸膏与所述供试品的重量比为1.2∶1，然后将所述浸膏加入水中进行水沉，放置过夜，滤过，得水沉液；

2)将大孔树脂湿法装柱，然后将所述水沉液上样，以水洗脱，流速为20ml/min，收集洗脱液，在80℃、0.06～0.08个大气压下减压回收水洗脱液中的水，浓缩得到浓缩液，所述浓缩液与所述供试品的重量比为1∶1；

3)用盐酸将所述浓缩液的pH值调至1.5，以乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，将回收乙酸乙酯后的产物上制备液相后配制成所述供试品溶液。

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