CN101698884A - TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，所述检测液相芯片，主要包括有：与胺基修饰的支持探针偶联的微球；连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列、间隔臂序列、3’端的能与对应的支持探针的特异性序列互补配对的序列；连接目标基因mRNA与信号检测组分间的扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括5’端能与目标基因mRNA结合的特异性序列、间隔臂序列、3’端能与标记探针互补配对的序列。本发明还公开了运用该液相芯片对TOP2A mRNA表达水平检测的方法。本发明检测过程无需RNA提取、逆转录、PCR等步骤，检测结果受样本中RNA的质量影响较小，保证了检测结果的准确性；另一方面，由于液相芯片技术使多指标并行检测成为了现实，在一次检测中可设置多个内参基因，使检测结果更为可靠。

Description

TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片和检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及TOP2A mRNA表达检测液相芯片及检测方法。

背景技术

DNA拓扑酶II(Topo II)抑制剂药物是一类重要的化疗药物，主要有依托泊苷(etoposide)、开普拓、鬼臼噻吩苷、拓扑特肯等，其中，依托泊苷作为细胞周期特异性抗肿瘤Topo II抑制剂药物，主要用于治疗小细胞肺癌、恶性淋巴瘤、恶性生殖细胞瘤、白血病，对神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、卵巢癌、非小细胞及小细胞肺癌、胃癌和食管癌等有一定疗效。其抗癌机制是作用于DNA拓扑异构酶，形成药物-酶-DNA稳定的可逆性复合物，阻碍DNA修复。DNA拓扑异构酶II是一种真核生物生存所必需的泛酶，在几乎所有DNA代谢过程中发挥重要作用。Topo II有IIα型和IIβ型两种，其中Topo IIα(又称TOP2A)在细胞快速增殖期含量最高，对多种肿瘤细胞系Topo IIαmRNA检测表明，Topo IIα在各种肿瘤组织广泛表达，无明显组织特异性。Topo II介导DNA解结或解旋，在DNA代谢的细胞生命过程中起重要作用。因为其重要生理功能，Topo II已成为抗癌药物的重要作用靶点。Topo II抑制剂通过直接作用Topo II或仅与双链DNA中的一条链结合以影响Topo II功能。研究表明Topo IIα酶活性的降低或表达水平降低都会造成Topo II抑制剂药物耐药。研究报道：高表达的Topo IIα使用依托泊苷效果较好，低表达的Topo IIα对依托泊苷药物耐药。检测TOP2AmRNA表达水平可以有效预测化疗药物依托泊苷的疗效。

作为TOP2A表达水平的参照物，持家基因一般在体内可稳定表达，但由于这种稳定表达是相对的，在一定的病理状态或用药情况下，某些常用的持家基因的表达也会发生变化。选择在我们所研究对象中稳定表达的基因作持家基因，对保证检测结果的准确性至关重要。因此，本发明从一定数量的常用持家基因中进行筛选，确定3个合适的持家基因，分别是：β2-微球蛋白(B2M)、铁传递蛋白受体(TFRC)、TATA框结合蛋白(TBP)。

基于以上基因的表达水平与化疗药物疗效的相关性，专家推荐患者在接受化疗药物之前，应当进行相关的基因mRNA表达水平的检测，帮助临床医生根据患者的个体差异制定个体化用药方案，以提高药物疗效，减少药物毒副作用的发生。

目前，对基因的mRNA表达水平进行检测的技术主要有：逆转录定量PCR法、实时荧光定量PCR法、RNA原位核酸杂交(RISH)等。其中，RISH主要用于分析组织或细胞内RNA分布以了解特定基因的表达情况，且其过程较长、操作繁琐，不适合用于临床应用；而逆转录定量PCR法与实时荧光定量PCR法，首先，这两种方法均需要进行RNA抽提、逆转录，检测的结果受RNA降解影响大；其次，这两种方法只通过一对引物进行PCR扩增，容易产生非特异性结合，从而导致假阳性高；再次，这两种方法一般只有一个持家基因作对照，其准确性容易受到病理状态的影响；因此，逆转录定量PCR法与实时荧光定量PCR法作为临床应用均存在着难以克服的技术缺陷。

液相芯片技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，在微球的制造过程中，掺入不同比例的染色剂，从而形成100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的探针分子从而实现对多达100中待检物质的同步并行检测。因此，我们采用液相芯片技术可以同时检测多个基因的mRNA表达水平，实现了检测的高通量，大大提高了检测效率。

技术方案

本发明的目的之一是提供检测TOP2A mRNA表达水平的液相检测芯片。

实现上述目的的技术方案如下：

一种TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，主要包括有：

(1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述支持探针选自SEQ.NO.1-SEQ.NO.4，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；

(2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列P2、间隔臂序列、3’端能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包括有：针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.5-SEQ.NO.10中的2条或2条以上；针对B2M基因的选自SEQ.NO.11-SEQ.NO.15中的2条或2条以上，针对TFRC基因的选自SEQ.NO.16-SEQ.NO.20中的2条或2条以上，和针对TBP基因的选自SEQ.NO.21-SEQ.NO.25中的2条或2条以上；所述支持延伸探针的P3序列选自：SEQ.NO.26-SEQ.NO.29；

(3)扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括5’端能与目标基因mRNA结合的特异性序列P4、间隔臂序列、3’端序列P5，3’端还修饰有生物素；所述扩增延伸探针的特异性序列P4包括有：针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.30-SEQ.NO.39中的5条或5条以上；针对B2M基因的选自SEQ.NO.40-SEQ.NO.49中的5条或5条以上，针对TFRC基因的选自SEQ.NO.50-SEQ.NO.59中的5条或5条以上，和针对TBP基因的选自SEQ.NO.60-SEQ.NO.69中的5条或5条以上；所述P5为不存在内部发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列。

或一种TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，主要包括有：

(1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述支持探针选自SEQ.NO.1-SEQ.NO.4，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；

(2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列P2、间隔臂序列、3’端能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包括有：针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.5-SEQ.NO.10中的2条或2条以上；针对B2M基因的选自SEQ.NO.11-SEQ.NO.15中的2条或2条以上，针对TFRC基因的选自SEQ.NO.16-SEQ.NO.20中的2条或2条以上，和针对TBP基因的选自SEQ.NO.21-SEQ.NO.25中的2条或2条以上；所述支持延伸探针的P3序列选自：SEQ.NO.26-SEQ.NO.29；

(3)扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括5’端能与目标基因mRNA结合的特异性序列P4、间隔臂序列、3’端序列P5；所述扩增延伸探针的特异性序列P4包括有：针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.30-SEQ.NO.39中的5条或5条以上；针对B2M基因的选自SEQ.NO.40-SEQ.NO.49中的5条或5条以上，针对TFRC基因的选自SEQ.NO.50-SEQ.NO.59中的5条或5条以上，和针对TBP基因的选自SEQ.NO.60-SEQ.NO.69中的5条或5条以上；所述P5为不存在内部发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列；和

(4)标记探针，所述标记探针具有与扩增延伸探针P5互补配对的、序列(优选为SEQ.NO.84，且具有生物素修饰。

优选地，还包括有：填充序列，针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.70-SEQ.NO.71中的一条或多条；针对B2M基因的选自SEQ.NO.72-SEQ.NO.79中的一条或多条；和/或针对TFRC基因的选自SEQ.NO.80-SEQ.NO.83中的一条或多条。

优选地，所述间隔臂序列为5-10个T。更优选地，所述支持探针的间隔臂序列为8个T；所述支持延伸探针的间隔臂序列为5个T；所述扩增延伸探针的间隔臂序列为5个T。

本发明的另一个目的是提供一种检测TOP2A基因mRNA表达水平的方法。

实现上述目的技术方案如下：

一种使用上述液相芯片对TOP2A基因mRNA表达水平进行检测的方法，主要包括以下步骤：

(一)裂解样本释放总RNA，得裂解混合液；

(二)将裂解混合液、偶联有支持探针的微球、支持延伸探针、扩增延伸探针密封于杂交板中，54℃±1℃，600rpm震荡孵育过夜，支持延伸探针的序列P3与支持探针的P1结合互补结合，支持延伸探针的特异性序列P2与目标mRNA特异结合，从而将目标mRNA结合到微球上；扩增延伸探针带有生物素标记，扩增延伸探针的P4与目标mRNA特异结合从而实现目标mRNA信号的级联放大；

(三)步骤(二)的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；

(四)通过荧光检测仪检测。

或者包括以下步骤：

(一)裂解样本释放总RNA，得裂解混合液；

(二)将裂解混合液、偶联有支持探针的微球、支持延伸探针、扩增延伸探针密封于杂交板中，54℃±1℃，600rpm震荡孵育过夜，支持延伸探针的序列P3与支持探针的P1结合互补结合，支持延伸探针的特异性序列P2与目标mRNA特异结合，从而将目标mRNA结合到微球上；扩增延伸探针的P4与目标mRNA特异结合；

(三)再加入标记探针，标记探针带有生物素标记，50℃±1℃，600rpm震荡孵育1小时，标记探针与扩增延伸探针的序列P5互补配对结合，从而实现目标mRNA信号的级联放大；

(四)步骤(三)的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；

(五)通过荧光检测仪检测。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明所设计的各种探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统。运用本发明所述的液相芯片和检测方法，对TOP2A基因mRNA表达水平进行检测的，无需RNA提取、逆转录、PCR等步骤，检测结果受样本中RNA的质量影响较小，保证了检测结果的准确性；另一方面，以多个持家基因作对照(N≥3)，检测结果不易受病理状态的影响，准确性高使检测结果更为可靠。

(2)本发明使用的是探针的多位点特异配对、级联放大的方式来实现信号的放大，而不是PCR扩增的方法，提高了检测信号，实现了检测的特异性，避免了逆转录PCR和实时荧光定量PCR技术的假阳性。

(3)本发明所述的液相芯片和检测方法适用于新鲜组织、石蜡包埋固定组织、组织切片、穿刺组织等样本类型，对比起其他的mRNA检测方法，有着操作简易、准确性高、特异性高的特点。

具体实施方式

本领域的人员所知，所述间隔臂序列为用于将支持探针与微球表面间隔开来，在支持延伸探针与扩增延伸探针内部也存在间隔臂序列，通过在探针序列与胺基之间、探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂(间隔臂长度优选2-4)。本发明间隔臂优选为5-10个T，在中国，T的合成技术比较成熟，成本相对较低。

实施例1TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片试剂盒，主要包括有：

一、偶联有支持探针(SP)的微球

支持探针由三部分组成，5’端是与微球结合的胺基端，3’端是与支持延伸探针结合的特异性序列P1，长度为16nt，中间是8个寡聚核苷酸T的间隔臂序列，每个目标基因选用一种微球，并选用一条支持探针，每种微球具有不同的荧光编码。每个目标基因的支持探针如表1所示：

表1不同的目标基因及其选用微球的编号、支持探针(SP)

基因	微球号	SP序列(5’→3’)NH2+poly(dT)+P1	SEQ ID
				top2A	29	5’NH2-TTTTTTTT-CATATTACATTCACAT	1
B2M	22	5’NH2-TTTTTTTT-CTTTCTTTAATCTCAA	2
				TFRC	61	5’NH2-TTTTTTTT-CATTCAAATCTCAACT	3
TBP	33	5’NH2-TTTTTTTT-CAATTACTTCAAATCT	4

所有探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的支持探针用灭菌ddH₂O配成100nmol/ml的贮存液。微球包被的过程如下：

分别取5×10⁶个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的捕获探针(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有支持探针的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)，1mmol/LEDTA]中，2-8℃避光保存。

二、与目标基因mRNA特异结合的支持延伸探针(SE)、扩增延伸探针(AE)

1)支持延伸探针(SE)是连接支持探针(SP)与目标基因mRNA之间的序列，SE由三部分组成，5’端是能与目标基因mRNA结合的特异性序列P2，长度介于17nt至28nt，3’端是能与支持探针5’端P1序列通过碱基互补结合的特异性序列P3，中间是5个寡聚核苷酸T的间隔臂序列。每个目标基因分别设计5至7条支持延伸探针，以提高检测的特异性。使用时，针对每种目标基因，选择2条或2条以上支持延伸探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好(实验数据省略)，优选于使用5至7条支持延伸探针，以使特异性达到最好。合成后的每条探针分别用10mmol/LTris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。目标基因的支持延伸探针(SE)见表2、表3。

表2目标基因的支持延伸探针P2序列

表3目标基因的支持延伸探针的P3序列

2)扩增延伸探针(AE)是连接目标基因mRNA与信号检测组分之间的序列，AE由三部分组成，5’端是能与目标基因mRNA结合的特异性序列P4，3’端是能与标记探针互补配对的序列P5，(如不运用标记探针检测时，则3’端还修饰有生物素)，中间是5个寡聚核苷酸T的间隔臂序列。每个目标基因分别设计10至15条扩增延伸探针，从而将检测信号进行级联放大。合成后的每条探针分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。目标基因的扩增延伸探针(AE)见表3。所述P5的设计按照本领域的探针设计的公知常识，其为不存在内部发夹结构，探针内部和探针间都不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合，GC含量为50％-65％的序列，本发明优选为碱基组成为CCTATGCCTCCCGTGTCTA。使用时，针对每种目标基因，选择5条或5条以上扩增延伸探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好(实验数据省略)，优选于使用10条扩增延伸探针，以使特异性达到最好。

表4目标基因的扩增延伸探针(AE)

3)填充序列(FS)，将目标基因mRNA中没有与SE、AE特异结合的区域封闭，以减少后续反应中生物素或标记探针的非特异性结合，从而减少检测背景。填充序列的Tm值应与SE、AE接近，如表5所示。

表5目标基因的填充序列(FS)

三、标记探针(LP)

标记探针(LP)由两部分组成，其序列是能与扩增延伸探针3’端的序列P5互补结合的序列，5’端带有生物素标记，通过与扩增延伸探针结合实现目标mRNA信号的级联放大。

表6标记探针(LP)

实施例2运用实施例1所述的TOP2A mRNA表达检测液相芯片对临床样本的检测所述各种溶液的配方如下：

一、裂解样本释放总RNA

1.将FFPE肿瘤组织切片从载玻片上刮下，放入1.5ml离心管中，加入300ul匀浆缓冲液和3ul蛋白酶K(50ug/ul)，混合均匀，65℃消化2h。

2.消化2h后的样品，室温下13,000rpm离心5分钟，吸取中间澄清的溶液转移至新的1.5ml离心管中备用。(如溶液仍不澄清，则重复本步骤1～2次。)

二、目标mRNA通过与探针特异性结合固定在微球上。

1.取出探针工作液于室温融解，然后在95℃变性5分钟，马上置于冰上。

2.按下表配制工作液，混合均匀

3.将上述配制好的工作液分装至杂交板上，60ul/孔。然后将上述处理好的样品以40ul/孔分别加入杂交板中；空白对照加入匀浆缓冲液40ul/孔。密封杂交板，54℃±1℃，600rpm震荡孵育过夜(16-22h)。

4.用洗涤缓冲液润湿滤板1分钟，除去洗涤缓冲液。

5.将杂交板取出，500×g离心1分钟，将反应液全部转移至滤板中。

6.除去溶液，用200ul洗涤缓冲液洗涤3次。

三、通过杂交反应将目标RNA信号放大

1.加入标记探针工作液100ul/孔。50℃±1℃，600rpm震荡孵育1小时。

2.除去溶液，用200ul洗涤液洗涤2次。

四、与SA-PE结合，并在液相芯片阅读仪上检测

1.加入SA-PE工作液100ul/孔，600rpm震荡室温孵育30min。

2.抽滤除去溶液，用200ul SA-PE洗涤液洗涤2次，用吸水纸吸干滤板底部。

3.加入SA-PE洗涤液130ul/孔。室温，600rpm震荡孵育2至5分钟。

4.在液相芯片仪上读取数据。

五、数据分析

在4个目标基因中，其中目标基因1个：TOP2A；

持家基因3个，分别是：B2M、TFRC、TBP；

将读取的荧光值按照以下方法进行均一化处理：

步骤1：获得原始数据(MFI值)

步骤2：样品的MFI减去空白孔N的MFI＝net MFI

步骤3：每个样品的三个持家基因的net MFI值分别取几何平均值，得到相应的G1、G2、G3......Gn

步骤4：每个样品目标基因mRNA的net MFI除以对应的Gn得到相应的Nn。Nn即为已排除上样量差异，可在样品间进行相对表达量比较的数值。

本实施例中对10例样品进行检测，检测结果如下所示：

表7空白孔N与10例样品原始数据(MFI值)与TOP2A的相对表达量

实施例3：不同间隔臂的液相芯片对TOP2A表达水平的检测

一、液相芯片制备的设计(间隔臂的选择)

以所述液相芯片对TOP2A检测的支持探针为例，分别选用不同的间隔臂，具体设计如表8所示。探针SP、SE与AE的合成、SP序列包被微球、检测方法等如实施例1和实施例2所述。

表8间隔臂及其长度

间隔臂种类	长度	实验组
			poly(dT)	8	1
poly(dA)	8	2
			(CH2)n	15	3
poly(TTG)	3	4

二、样品检测

采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品11-15进行检测，检测结果如下(表中数据为检测荧光值)：

表9样品检测结果(检测荧光值<MFI值>)

Sample	实验组1	实验组2	实验组3	实验组4
					N	12	8	15	18
11	2765	2684	2785	2801
					12	8546	8567	8521	8596
13	1654	1664	1682	1678
					14	6523	6536	6574	6529
15	15260	15568	15280	15326

将4组设计的检测荧光值进行统计学分析，证明4组设计的检测效果没有差异。因此，这4种间隔臂的设计是等效的。

其它针对支持延伸探针、扩增延伸探针内部不同的间隔序列的液相芯片，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。

实施例4：标记探针的运用

液相芯片制备的设计(信号检测组分)

所述信号检测组分有两种选择，1)扩增延伸探针3’端序列P5的3’端带有生物素标记；2)扩增延伸探针3’端序列P5与标记探针(LP)通过碱基互补配对结合，同时标记探针的5’端带有生物素标记。这两种信号检测组分均能实现信号放大，检测到正常信号。其中，使用标记探针的生物素活性更加稳定，效果较优。

以所述液相芯片的检测TOP2A基因的两种信号检测组分为例，具体设计如表10所示。即所述液相芯片的组成为：

实验组1：支持探针偶联的微球、支持延伸探针、填充序列同实施例1，扩增延伸探针具有生物素标记；没有标记探针；

实验组2：支持探针偶联的微球、支持延伸探针、填充序列、标记探针同实施例1，扩增延伸探针不具有生物素标记。

表10信号检测组分

二、样品检测

采用上述设计制备的液相芯片，检测方法：实验组2同实施例2所述检测过程和方法对样品16-20进行检测，实验组1所述检测方法，省略(三、通过杂交反应将目标RNA信号放大)该步骤，其余同实施例2。

检测结果如下(表中数据为检测荧光值)：

表11样品检测结果(检测荧光值<MFI值>)

Sample	实验组1	实验组2
			N	15	18
16	2561	2658
			17	4526	4689
18	2578	2689
			19	3599	3625
20	8519	8595

将两组设计的检测荧光值进行统计学分析，证明两组设计的检测结果没有差异，因此，这两种信号检测组分对信号的检测是等效的。其中，使用标记探针的信号检测组分，由于其生物素的活性更为稳定，效果较优。

以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。

序列表

<110>广州益善生物技术有限公司

<120>TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片和检测方法

<160>84

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

catattacat tcacat                                    16

<210>2

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ctttctttaa tctcaa                                    16

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cattcaaatc tcaact                                    16

<210>4

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

caattacttc aaatct                            16

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gaaagtagaa aaggaggaag agtgaca                27

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gcctctgatg atttgagaag atgaa                  25

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

agccagaggg gacaggtcaa g                      21

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cttggatcaa atgttgtccc cga                23

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

tgtagacagg tcttaacaaa gtttacaa           28

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

gaaagtagaa aaggaggaag agtgaca            27

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

aaggccacgg agcgagacat                    20

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

ccattctctg ctggatgacg tg                    22

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

gctgaaagac aagtctgaat gctc                  24

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

ttaactatct tgggctgtga caaag                 25

<210>15

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

ggagacagca ctcaaagtag aatta                 25

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

acaatagccc aagtagccaa tcat                  24

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

tcggttcctg ccagtctctc ac                        22

<210>18

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

tctccgacaa ctttctcttc aggt                      24

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

ccagcctcac gagggacata t                         21

<210>20

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

acgccagact ttgctgagtt taa                       23

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

cgaagtgcaa tggtctttag gtca                     24

<210>22

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

cgtggttcgt ggctctctta tcc                      23

<210>23

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

tattttcttg ctgccagtct gg                       22

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

catcacagct ccccaccata ttct                     24

<210>25

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

caattctggg tttgatcatt ctgtag              26

<210>26

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

atgtgaatgt aatatg                         16

<210>27

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

ttgagattaa agaaag                         16

<210>28

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>28

agttgagatt tgaatg                         16

<210>29

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

agatttgaag taattg                         16

<210>30

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

ttttaaatca aactgctcta gtttta         26

<210>31

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>31

gaaccataaa gttctatctg atggtaa        27

<210>32

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>32

ggcacataag aggctgagtg tagtag         26

<210>33

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>33

ctgtgtcaag ttatagacac agccaa         26

<210>34

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>34

ctttgggaga ttcagactca gagg            24

<210>35

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>35

cttctgcaat ccagtcctct tagaa           25

<210>36

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>36

gctcattgct gagcatggtt atc             23

<210>37

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>37

tggagatttc ccaaaatgaa tcta            24

<210>38

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>38

cgttgataac attactcaag tcacacac            28

<210>39

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>39

gctgaaataa tcacataact actctaatt           29

<210>40

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>40

ttcaggaatg cccgcca                        17

<210>41

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>41

ccaggccaga aagagagagt agc                 23

<210>42

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>42

cctgaatctt tggagtacgc tgg            23

<210>43

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>43

ggatgaaacc cagacacata gcaa           24

<210>44

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>44

agtgggggtg aattcagtgt agta           24

<210>45

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>45

tcacacggca ggcatactca tct            23

<210>46

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>46

gctgcttaca tgtctcgatc cc             22

<210>47

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>47

tgcggcatct tcaaacctcc                    20

<210>48

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>48

gcaacctgct cagatacatc aaaca              25

<210>49

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>49

cctctaagtt gccagccctc cta                23

<210>50

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>50

atagtcccat agcagatact tccac              25

<210>51

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>51

caatcaagaa aaagacgatc acagc                25

<210>52

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>52

ctcagttttt ggttctaccc ctt                  23

<210>53

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>53

ctcctggctc ctccctcact g                    21

<210>54

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>54

cgacgtgctg cagggaagt                       19

<210>55

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>55

gctggtgaag tctgtgctgt cc            22

<210>56

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>56

ttttcattca gcagcttgat gg            22

<210>57

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>57

cgagttttga gcgctgtctt tg            22

<210>58

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>58

caggattctc caccaggtaa acaa          24

<210>59

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>59

gttgcagcct tactatacgc cac           23

<210>60

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>60

gcagctgcgg tacaatccc                    19

<210>61

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>61

tacaaccaag attcactgtg gatac             25

<210>62

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>62

gattatattc ggcgtttcgg gc                22

<210>63

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>63

atgattaccg cagcaaaccg c                 21

<210>64

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>64

gcacaccatt ttcccagaac tg                22

<210>65

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>65

ctgttcttca ctcttggctc ctg               23

<210>66

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>66

acccaacttc tgtacaactc tagc              24

<210>67

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>67

tcttgaagtc caagaactta gctgg             25

<210>68

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>68

gggtgagcac aaggccttct aa                22

<210>69

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>69

caggaaataa ctctggctca taacta            26

<210>70

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>70

aacagataat tatgctctat ctc               23

<210>71

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>71

agcaatttct cattgcttaa aga               23

<210>72

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>72

cggcccgaat gctgtca                     17

<210>73

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>73

cagtaagtca acttcaatgt cg               22

<210>74

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>74

ctttttcaat tctctctcca ttc              23

<210>75

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>75

agagatagaa agaccagtcc                  20

<210>76

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>76

agaatttgga attcatccaa tcc              23

<210>77

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>77

catatcaata ttaaaaagca agc                23

<210>78

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>78

ctacattttg tgcataaagt gta                23

<210>79

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>79

gaagatcatg tccatgttaa cat                23

<210>80

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>80

cgcaagattt tcatcttttt gag                23

<210>81

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>81

cacgaaattg attttcaaca tac                23

<210>82

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>82

ctgaatctta acaaaatgtt ga                 22

<210>83

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>83

ctaccgttct tatcaactat gat                23

<210>84

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>84

tagacacggg aggcatagg                     19

Claims (10)

1.一种TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，其特征是，主要包括有：

(1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述支持探针选自SEQ.NO.1-SEQ.NO.4，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；

(2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针主要包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列P2、间隔臂序列、3’端能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包括有：针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.5-SEQ.NO.10中的2条或2条以上；针对B2M基因的选自SEQ.NO.11-SEQ.NO.15中的2条或2条以上，针对TFRC基因的选自SEQ.NO.16-SEQ.NO.20中的2条或2条以上，和针对TBP基因的选自SEQ.NO.21-SEQ.NO.25中的2条或2条以上；所述支持延伸探针的P3序列选自：SEQ.NO.26-SEQ.NO.29；

(3)扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括有5’端能与目标基因mRNA结合的特异性序列P4、间隔臂序列、3’端序列P5，3’端还修饰有生物素；所述扩增延伸探针的特异性序列P4包括有：针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.30-SEQ.NO.39中的5条或5条以上；针对B2M基因的选自SEQ.NO.40-SEQ.NO.49中的5条或5条以上，针对TFRC基因的选自SEQ.NO.50-SEQ.NO.59中的5条或5条以上，和针对TBP基因的选自SEQ.NO.60-SEQ.NO.69中的5条或5条以上；所述P5为不存在发夹结构、探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列。

2.根据权利要求1所述的TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，其特征是，还包括有：填充序列，针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.70-SEQ.NO.71中的一条或多条；针对B2M基因的选自SEQ.NO.72-SEQ.NO.79中的一条或多条；和/或针对TFRC基因的选自SEQ.NO.80-SEQ.NO.83中的一条或多条。

3.根据权利要求1或2所述的TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。

4.根据权利要求1所述的TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，其特征是，

所述P5的组成为CCTATTGCCTCCCCGTTGTCTA。

5.一种TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，其特征是，主要包括有：

(1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端的与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述支持探针选自SEQ.NO.1-SEQ.NO.4，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；

(2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针，每条支持延伸探针主要包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列P2、间隔臂序列、3’端能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包括有：针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.5-SEQ.NO.10中的2条或2条以上；针对B2M基因的选自SEQ.NO.11-SEQ.NO.15中的2条或2条以上，针对TFRC基因的选自SEQ.NO.16-SEQ.NO.20中的2条或2条以上，和针对TBP基因的选自SEQ.NO.21-SEQ.NO.25中的2条或2条以上；所述支持延伸探针的P3序列选自：SEQ.NO.26-SEQ.NO.29；

(3)扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括有5’端能与目标基因mRNA结合的特异性序列P4、间隔臂序列、3’端序列P5；所述扩增延伸探针的特异性序列P4包括有：针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.30-SEQ.NO.39中的5条或5条以上；针对B2M基因的选自SEQ.NO.40-SEQ.NO.49中的5条或5条以上，针对TFRC基因的选自SEQ.NO.50-SEQ.NO.59中的5条或5条以上，和针对TBP基因的选自SEQ.NO.60-SEQ.NO.69中的5条或5条以上；所述P5为不存在内部发夹结构、探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列；和

(4)标记探针，所述标记探针具有与扩增延伸探针P5互补配对的序列，且末端具有生物素修饰。

6.根据权利要求5所述的TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，其特征是，还包括有：填充序列，包括有，针对TOP2A基因的选自SEQ.NO.70-SEQ.NO.71中的一条或多条；针对B2M基因的选自SEQ.NO.72-SEQ.NO.79中的一条或多条；和/或针对TFRC基因的选自SEQ.NO.80-SEQ.NO.83中的一条或多条。

7.根据权利要求5或6所述的TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。

8.根据权利要求5所述的TOP2A mRNA表达水平检测液相芯片，其特征是，

所述P5的组成为CCTATGCCTCCCGTGTCTA。

9.一种检测TOP2A基因mRNA表达水平的方法，其特征是，使用权利要求1-4任一项所述液相芯片，主要包括以下步骤：

(一)裂解样本释放总RNA，得裂解混合液；

(二)将裂解混合液、偶联有支持探针的微球、支持延伸探针、扩增延伸探针密封于杂交板中，54℃±1℃，600rpm震荡孵育过夜，支持延伸探针的序列P3与支持探针的P1互补结合，支持延伸探针的特异性序列P2与目标mRNA特异结合，从而将目标mRNA结合到微球上；扩增延伸探针带有生物素标记，扩增延伸探针的P4与目标mRNA特异结合从而实现目标mRNA信号的级联放大；

(三)步骤(二)的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；

(四)通过荧光检测仪检测。

10.一种检测TOP2A基因mRNA表达水平的方法，其特征是，使用权利要求5-8任一项所述液相芯片，主要包括以下步骤：

(一)裂解样本释放总RNA，得裂解混合液；

(二)将裂解混合液、偶联有支持探针的微球、支持延伸探针、扩增延伸探针密封于杂交板中，54℃±1℃，600rpm震荡孵育过夜，支持延伸探针的序列P3与支持探针的P1结合互补结合，支持延伸探针的特异性序列P2与目标mRNA特异结合，从而将目标mRNA结合到微球上；扩增延伸探针的P4与目标mRNA特异结合；

(三)再加入标记探针，标记探针带有生物素标记，50℃±1℃，600rpm震荡孵育1小时，标记探针与扩增延伸探针的序列P5互补配对结合，从而实现目标mRNA信号的级联放大；

(四)步骤(三)的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；

(五)通过荧光检测仪检测。