CN101054603B - 快速测定细胞角蛋白19(ck19)的方法和其引物及探针 - Google Patents

快速测定细胞角蛋白19(ck19)的方法和其引物及探针 Download PDF

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Abstract

提供了一种用于测定CK19mRNA的方法，其特征在于，使用与位于CK19基因的第一外显子上的区域杂交的第一引物和与位于第一外显子下游的CK19基因的第二外显子上的区域杂交的第二引物扩增CK19mRNA的部分。然后使用两种类型的探针检测扩增物。

Description

快速测定细胞角蛋白19(CK19)的方法和其引物及探针
发明领域
本发明涉及测定CK19mRNA，以及测定CK19和CK20mRNA的方法，尤其是在临床环境中。此外，提供了用于在实时基础上快速和特异性扩增以及检测CK19的mRNA的探针和PCR引物以及试剂盒。
发明背景
细胞角蛋白是一组形成细胞骨架的称作中间丝的蛋白质，且到目前为止，已经报道了至少20种亚种。那些细胞角蛋白主要地存在于上皮细胞中并且每个亚种的分布不同，这取决于上皮细胞的类型。
已报道细胞角蛋白19(CK19)在癌组织中比在正常组织中更丰富地表达，所述癌组织为如乳腺癌、胃癌、前列腺癌和肺癌，并且已研究了其应用到临床诊断中作为癌症诊断的临床标记以及也作为选择治疗策略的指标。例如，在早期乳腺癌中或者在早期胃癌中，存在使用CK19作为指标，通过诊断癌症是否转移到淋巴结，来判断外科手术期间减少淋巴结切割范围对于提高患者生活质量(QOL)的适当性的可能性。也有当使用CK19作为指标检查腹膜的洗涤物中存在或不存在癌细胞时，可评价患进行性胃癌患者腹膜接种(seeding)风险的可能性。
到目前为止，关于以高灵敏度检测基因的方法已经报道了LAMP方法、TRC方法、PCR方法等。
LAMP(环介导的等温扩增)法是一种使用四种引物和链上取代型DNA聚合酶在预定的温度有效地扩增目的基因的技术，其是针对将要扩增的基因区域中任何六个区域进行设计的(WO00/28082)。
TRC(转录反转录协同反应)法是一种在预定的温度扩增RNA的技术(EP0969101)，其中通过使用反转录酶的RNA酶活性和用于切割靶RNA的称作剪刀探针的DNA寡核苷酸修剪靶RNA以及通过重复反转录反应和转录反应扩增目的RNA区。在该技术中，RNA能够直接扩增，且因此在PCR和LAMP法中必需的反转录步骤不是必需的。
与PCR法相比，在那些用于核酸的扩增方法中扩增的步骤是复杂的，且另外，不可能同时扩增多个靶并且在一个反应管中检测它们中的每一个。这意味着不能在反应系统中结合用于区别假阴性和真阴性的内对照。因此，这种方法有如下问题，当应用到临床诊断时，可能不能区别假阴性样品，等等。
PCR法是一种具有良好重复性的可有效扩增任何DNA区域的技术，且目前，在医学、法医学、兽医科学、农业科学、药物科学、生物学等领域中从基础研究到实际工业，全世界广泛使用该技术。当将该技术与具有反转录活性的酶结合时，其也可能扩增任何mRNA区(RT-PCR)。也已报道了用于检测扩增产物的许多方法。当向PCR溶液中添加将荧光染料结合到DNA寡核苷酸中的荧光探针时，可实时进行扩增反应的监控(实时PCR)。也可能，当使用分别标记了多个荧光染料的荧光探针时，可在反应器中同时扩增多个靶DNAs(或RNAs)并且也可分别监控这种扩增反应的模式(多重实时PCR)。
尽管mRNA通过RT-PCR法的扩增是高度灵敏的，但是倘若在将要检测的样品中存在人DNA，即使仅存在少量，那么也扩增作为mRNA的计划的基因(DNA)。因此，可能难于判断扩增产物是来自RNA还是DNA。
在这种方法中有“假阳性”结果的某种可能性，其中将是阴性的结果判断为阳性。当这种方法应用到临床诊断时，这是个大问题。
作为避免这个问题的方法，在通过RT-PCR扩增RNA中进行这样的设计，从而使得内含子进入与这种RNA区域对应的基因的区域。
通常，基因被内含子隔开，所述内含子是不具有遗传信息的区域。因此，如果在通过RT-PCR扩增的区域中存在内含子，那么与mRNA的扩增产物相比，扩增DNA的PCR产物在内含子的程度上更大。在该情况中，即使当DNA污染了将要进行PCR的mRNA样品时，也可能可通过琼脂糖凝胶电泳等，其中可检测扩增产物大小的差异，来判断是mRNA被扩增还是DNA被扩增。
然而，当扩增没有内含子存在的基因区域时，扩增产物的大小与mRNA的情况完全相同。在这种情况中，不可能通过电泳进行判断。
当人基因(DNA)污染临床样品时，有存在加工型(process-type)假基因的另一个问题。假基因不作为基因发挥作用，且由于在加工型假基因的碱基序列中不存在内含子并且由于与mRNA的碱基序列有高度同源性，所以不可能通过扩增产物的大小进行判断。
已报道在CK19中存在加工型假基因。假基因与CK19mRNA的同源性至少90％。因此，如果发生假基因的扩增，那么与不具有内含子的基因区域的PCR的情况相比，有不能判断扩增产物是来自mRNA还是来自假基因的可能性。
因此，倘若在临床检验中通过使用的核酸扩增法如RT-PCR检测CK19mRNA，那么应彻底排除污染样品的DNA。换句话说，当解释所得的阳性结果时，除非其可区别阳性结果是否是由于CK19mRNA的“真阳性”还是由于CK19基因或CK19假基因的“假阳性”，否则其不可能应用于临床检验。
一种有效预防这种“假阳性”产生的方法是，彻底排除样品中的人DNA。已经报道了制备用于这种目的的样品的方法。然而，在制备这种样品的方法中，太多关注纯化的程度，且结果，制备样品需要的时间长，需要特殊的装置并且可处理的样品的数目有限。因此，在要求快速和简单的临床领域中该方法不总是有效。
已经有许多报道通过RT-PCR用于扩增和检测CK19mRNA的PCR引物和检测探针的出版物，且也已经有关于使用不扩增或检测CK19假基因的特殊装置的报道(Yuan，CC.，等，Gynecol.Oncol.，85：(1)148-153，2002；Dimmler，A.等，Laboratory Investigation，81：(10)1351-1361，2000；Gazzaniga，P.，等，Clin.Cancer Res.，7：577-583，2001；Stathopoulou，A.，等，Clin.Cancer Res.，9：5145·5151，2003；Fellowes，V.，等，Int.J.Oncol.，24：861-867，2004)。然而，目前这些出版物中没有一个满足临床领域中所要求的快速。
例如，在Yuan等中进行嵌套式PCR。然而，在该方法中仅在PCR中就需要5小时或更长的时间。特别是在Yuan等和在Stathopoulou等中，使用琼脂糖凝胶电泳用于扩增产物的检测，由此PCR结果的判断需要更长的时间。另外，在制备用于PCR的样品中，所有这些现有技术文献(Yuan，CC.，等；Dimmler，A.等；Gazzaniga，P.等；Stathopoulou，A.等；Fellowes，V.)都在单独的反应中进行PCR和mRNA的反转录反应(两步RT-PCR)，并且仅在反转录步骤中就需要约1小时。
在Dimmler等和在Fellowes等中，提到了将纯化的RNA样品进一步进行DNA酶处理。在使用核酸扩增法用于临床诊断的实际医学领域中，不优选被核酸酶污染。那是因为，如果在操作室或在实验设备内发生DNA酶或RNA酶的污染，那么有影响基因检验结果的可能性。因此，关于制备将要在临床检验中使用的用于核酸扩增的样品的方法，通常优选没有核酸酶的方法。
附图简述
图1是显示将以逐步方式稀释的CK19mRNA进行本发明的一步RT-PCR的结果的图。
图2是显示将人DNA和CK19假基因进行与图1的情况相同的一步RT-PCR的结果的图。
图3是显示将通过病理诊断确定癌症的转移为阳性的淋巴结(#1到#2)和通过病理诊断确定癌症转移为阴性的淋巴结(#3)进行本发明的一步RT-PCR的结果的图。
发明概述
在外科手术中，除了原发癌之外，必须切除癌症转移的器官和组织如淋巴结。然而，如本文上述已经提到的，必须完全除去污染的DNA等，以及高度纯化目的mRNA，以用于与癌症相关的特异性基因表达(mRNA)的精确检测目的，且因此需要长的时间来判断mRNA的存在或不存在。另一方面，允许进行外科手术的时间是有限的。因此，一直不可能在手术期间判断对癌症特异性的mRNA是否存在于在手术中所收集的组织和器官中。因此，为了防止术后癌症转移的复发，必须广泛切除可能转移的组织和器官如淋巴结，而不能判断癌症细胞是否实际上已转移。
关于上述，如果可能在短时间内判断与特异性癌症相关的mRNA是否存在于在外科手术中所收集的组织和器官的样品中，那么将大大地减少患者的负担。在这种情况中，可能切除仅仅是检测到癌症相关基因的mRNA的组织和器官。
本发明提供一种方法，其中CK19的mRNA是否存在于外科手术中所收集的组织和器官样品中以及所述组织和器官是否将要被切除的事实可在这样短的时间内确定，从而可在手术期间评价所述实事。
本发明通过选择引物和探针解决上述问题。因此，本发明公开了PCR引物以及检测探针的组合，借此通过PCR引物的选择性防止了假基因的扩增，并且，此外，通过检测探针的位置的选择不能检测到该基因。而且，当使用本发明的引物和探针时，不必用DNA酶处理用于进行PCR的样品。此外，如将在实施例中所示，当使用具有反转录能力的核酸合成元件时，可通过在相同反应器内进行反转录步骤和PCR步骤以及也通过进行实时PCR，将CK19mRNA的扩增和检测所需的时间缩短到约40分钟的程度。
因此，本发明提供一种测定CK19mRNA的方法，其包括
(a)使用引物扩增mRNA的部分，和
(b)使用两个探针检测所形成的扩增物(amplificates)，其中所述的引物是
-第一引物，其具有能使其与位于CK19基因的第一外显子上的区域杂交的序列，和
-第二引物，其具有能使其与位于第一外显子下游的CK19基因的第二外显子上的区域杂交的序列，且
其中所述的探针是
-第一探针，其具有能使其与位于所述第一引物结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的外显子的3’末端的区域杂交的序列，
-第二探针，其具有能使其与位于所述第一探针结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的相邻外显子5’末端的区域杂交的序列。
在上述方法中，可在某些实施方案中用供体和受体标记上述探针。例如，上述供体可以是FITC以及上述受体可选自罗丹明染料和花菁染料。上述第一探针在某些实施方案中可在其3’末端用供体标记以及上述第二探针可在其5’末端用受体标记。作为特异性实例，上述供体是FITC，且上述受体是LC-Red640，其是罗丹明染料。
罗丹明染料来自邻苯二甲酸酐与间二烷基氨基苯酚的稠合。例如，在EP567,622中公开了这种染料并且提到吡喃[3，2-g：5，6-g＇]diguanoline-13-yl，6-(2-羧基-3，4，5，6-四氯苯)-1，11-二乙基-1，2，3，4，8，9，10，11-八氢-2，2，4，8，10，10-六甲基高氯酸盐衍生物可用作罗丹明染料。
花菁染料是具有式R2N[CH＝CH]nCH＝N+R2R2<->R2N+＝CH[CH＝CH]nNR2(n是小数字)的合成染料。在该式中，氮和共轭链部分通常构成杂环系统的部分，如咪唑、吡啶、吡咯、喹啉和噻唑。例如在美国专利5,268,486、5,569,587、5,556,959和5,808,044的说明书中公开了这种染料。在某些方面称作Cy3.5亚磷酰胺的1-[3-(4-单甲氧基三苯甲基氧)丙基]-1′-[3-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)亚磷酰胺基]丙基]-3，3，3′，3′-四甲基-4，5-苯并茚并碳花菁(benzindocarbocyanine)可用作花菁染料。
本发明也提供一种同时测定CK19mRNA和CK20mRNA的方法，其包括
(a)使用用于CK19的一组引物和用于CK20的一组引物扩增mRNA的部分，和
(b)使用用于CK19的一组探针和用于CK20的一组探针检测所形成的扩增物，
其中所述的CK19mRNA的引物是
-第一引物，其具有能使其与位于CK19基因的第一外显子上的区域杂交的序列，和
-第二引物，其具有能使其与位于第一外显子下游的CK19基因的第二外显子上的区域杂交的序列，且
其中所述的CK19mRNA的探针是
-第一探针，其具有能使其与位于所述第一引物结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的外显子的3’末端的区域杂交的序列，和
-第二探针，其具有能使其与位于所述第一探针结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的相邻外显子5’末端的区域杂交的序列，且
其中所述的CK20mRNA的引物是
-第三引物，其具有能使其与位于CK20基因上的区域杂交的序列，和
·第四引物，其具有能使其与位于第三引物下游的CK20基因上的区域杂交的序列，且
其中所述的CK20mRNA的探针是
-第三探针，其具有能使其与位于所述第三引物结合的区域下游和所述第四引物结合区域上游的CK20基因上的区域杂交的序列，和
-第四探针，其具有能使其与位于所述第四引物结合的区域上游和所述第三探针结合的区域下游的CK20基因上的区域杂交的序列。
在上述方法的某些实施方案中，用供体和受体标记用于检测上述CK19mRNA的探针，用供体和受体标记用于检测上述CK20mRNA的探针，且这里，CK19供体/受体对不同于上述CK20供体/受体对。在其它实施方案中，用于检测上述CK19mRNA的探针对和用于检测上述CK20mRNA的探针对用相同供体标记，而用于检测上述CK19mRNA的受体与用于检测上述CK20mRNA的受体不同。
在特定的实施方案中，上述第一探针和第三探针在它们的3’末端用供体标记，而上述第二探针和第四探针在它们的5’、末端用受体标记。例如，上述供体可以是FTIC，且上述受体可选自罗丹明染料和花菁染料。在特殊的实例中，上述供体是FITC，且上述受体是LC-Red640和LC-Red610，其是罗丹明染料。
在优选的实施方案中，在相同反应容器内进行部分上述CK19mRNA和CK20mRNA的扩增以及上述扩增产物的检测。
本发明进一步提供用于CK19mRNA检测的材料的组合物，其包括
-第一引物，其具有能使其与位于CK19基因的第一外显子上的区域杂交的序列，
-第二引物，其具有能使其与位于第一外显子下游的CK19基因的第二外显子上的区域杂交的序列，
-第一探针，其具有能使其与位于所述第一引物结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的外显子3’末端的区域杂交的序列，和
-第二探针，其具有能使其与位于所述第一探针结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的相邻外显子5’末端的区域杂交的序列。
本发明也提供包括SEQ ID No.1的10-25个碱基对、与位于CK19基因的外显子4(其是第一外显子)上的区域杂交的的引物。在某些实施方案中，第一引物的特征是选自SEQ ID No.1的部分，含有至少两个与假基因的错配。优选地，第一引物具有与SEQ ID No.2完全相同的序列。
本发明也提供包括SEQ ID No.3的10-25个碱基对、与位于外显子4下游的CK19基因的第二外显子上的区域杂交的引物。在某些实施方案中，上述引物含有至少两个与上述CK19假基因的错配。在特定的实施方案中，上述CK19基因的第二外显子是外显子6。优选地，上述第二引物具有与SEQ ID No.4完全相同的序列。
本发明也提供一种引物的组合，其包括至少一个根据上述用于扩增CK19mRNA的部分的引物中的任何一个的引物。在优选的实施方案中，上述至少一个引物序列在其3’末端含有至少一个与CK19假基因的错配。
本发明也提供包括SEQ ID No.5(其是CK19mRNA的完全序列)的10-25个碱基对、与位于CK19基因的第一外显子的3’末端的区域杂交的第一探针。在某些实施方案中，上述第一探针与通过上述引物组合制备的扩增物杂交。在某些方面，上述CK19基因的第一外显子是外显子4。例如，上述第一探针的确切序列是SEQ ID No.6。
本发明进一步提供包括SEQ ID No.5(其是CK19mRNA的完全序列)的10-25个碱基对、与位于CK19基因的第二外显子的5’末端的区域杂交的第二探针。在某些实施方案中，上述第二探针与位于上述第一探针下游并且与通过上述引物组合制备的扩增物相邻的外显子杂交。在某些方面，位于CK19基因的第一外显子下游的外显子是外显子5。例如，上述第二探针的确切序列是SEQ ID No.7。
本发明也涉及用于CK19mRNA扩增物的鉴定的上述探针的组合。探针可用供体和受体标记。在探针组合的某些方面，上述供体是FITC，且上述受体选自罗丹明染料和花菁染料。在探针组合的另一个实施方案中，上述第一探针在其3’末端用供体标记，且以相邻方式结合在上述第一探针下游的第二探针在其5’末端用受体标记。在那种情况中，例如，上述供体是FITC，且上述受体是罗丹明染料，例如，LC-Red640。
本发明也提供一种扩增和检测CK19mRNA的试剂盒，其中所述的试剂盒至少包括一对引物，其具有
-第一引物，其具有能使其与位于CK19基因的第一外显子上的区域杂交的序列，和
-第二引物，其具有能使其与位于所述第一外显子下游的CK19基因的第二外显子上的区域杂交的序列，和
一对探针，其具有
-第一探针，其与位于所述第一引物结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的外显子3’末端的区域杂交，和
-第二探针，其与位于所述第一探针结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的相邻外显子5’末端的区域杂交。
在试剂盒的某些方面，上述引物对作为混合物存在，或者上述探针对作为混合物存在，或者上述引物对和上述探针对两者都作为混合物存在。上述试剂盒可进一步包含缓冲液。
本发明也提供一种用于CK19mRNA和CK20mRNA的组合扩增和检测的试剂盒。这种试剂盒至少包括两对引物和两对探针，其中将上述探针对CK19和CK20进行不同地标记。在试剂盒的某些实施方案中，所述的用于CK19mRNA的扩增和检测的引物和探针包括
-第一引物，其具有能使其与位于CK19基因的第一外显子上的区域杂交的序列，
-第二引物，其具有能使其与位于所述第一外显子下游的CK19基因的第二外显子上的区域杂交的序列，
-第一探针，其与位于所述第一引物结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的外显子3’末端的区域杂交，和
-第二探针，其与位于所述第一探针结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的相邻外显子5’末端的区域杂交。
在上述试剂盒的某些方面，上述引物对作为混合物存在，或者上述探针对作为混合物存在，或者上述引物对和上述探针对两者都作为混合物存在。上述试剂盒可能在某些实施方案中进一步包含缓冲液。
本发明提供用于通过实时RT-PCR和杂交探针技术特异性扩增和检测CK19mRNA的新的PCR引物和探针，特别是用于临床检验。此外，因此提供了反应条件。
为了实现即使当人DNA污染样品时，对CK19mRNA高度特异性的RT-PCR，根据下列设计确定PCR引物和检测探针的区域和位置：
1)进行设计，从而使得在RT-PCR中，两个PCR引物中的每个3’末端都包括CK19的假基因和CK19mRNA的错配位点，借此即使当可能扩增CK19mRNA时，也不可能扩增CK19假基因。
2)关于将要基因扩增的区域，选择满足上述条件并且含有CK19基因的至少一个外显子-内含子的边界的位点。
3)当用于检测的两个探针根据杂交探针技术与靶序列杂交时，以这种方式进行设计，从而使得上述外显子-内含子边界位于用于检测的两个探针的杂交位置之间。在其它情况中也可以以这样的方式进行设计，从而使得用于检测的两个探针之一在外显子-内含子边界上杂交，由此不能鉴定来自CK19基因的扩增物。
1)PCR引物的设计
由本发明提供的PCR引物与CK19mRNA互补性杂交。如果PCR引物也能与CK19假基因杂交，那么定位递延至一个碱基区，其中PCR引物的3’末端与至少一个碱基或者优选地两个碱基不互补。
由于本发明应用于临床诊断，所以设计PCR引物以便使得可能进行实时PCR。为了更特异，PCR引物的大小应当是10-25个碱基或者，优选地，17-18个碱基。关于GC％，优选是45％-55％。解链温度Tm应当是45℃-55℃或者，优选地，约52℃。
为了缩短PCR扩增时间，通过PCR扩增的扩增物的大小优选是150-250碱基对。另外，必须在通过PCR扩增的区域中存在基因的一个或多个外显子-内含子边界。
在通过PCR扩增的区域中，设置用于检测的探针杂交的位点。
2)用于检测的探针的设计
关于由本发明所提供的用于检测的两种类型的探针，它们中的每一种都与通过PCR扩增的CK19mRNA互补性杂交。
用于检测的两种类型的探针是用不同荧光染料标记的DNA寡核苷酸，且一种称作供体探针，而另一种称作受体探针。在供体探针中，其5’末端用荧光染料标记，而在受体探针中，其3’末端进行荧光标记。
设计那些用于检测的两个探针，以便于与仅以1-5个碱基的程度相隔的非常接近的区域杂交。结果，在两个探针上标记的荧光染料之间发生所谓的荧光共振能量转移(FRET)。为了更特异，当照射激发供体探针的荧光染料的光时，激发的能量转移到相邻的受体探针上的荧光染料上，因此产生荧光。这种现象仅当两个探针在刚好相邻位置上杂交时才发生。
用于检测的探针的大小约10-25个碱基，或者，优选地，18-22个碱基。GC％优选是45％-55％。解链温度应当是50℃-65℃，且设置为比引物的解链温度高5℃，此外，将受体探针的解链温度设置为比供体探针的解链温度高2-3℃。
3)RT-PCR法和反应方案
可在热循环仪上进行使用由本发明所提供的PCR引物和检测探针的PCR，其中所有实时PCR都是可能的。在那时，每个机器的温度控制性质和相应的荧光滤光器是不同的，且因此，一旦需要，就要求PCR条件和荧光染料选择的最优化。这里在实施例中，当使用Light
Figure S07196033020070420D000111
(销售商：Roche Diagnostic K.K.)时，将举例说明PCR条件。
在进行RT-PCR中，首先将作为靶的mRNA进行反转录以合成cDNA，然后进行PCR。当将反转录步骤和PCR步骤分开时(两步RT-PCR)，可用使用由本发明所提供的PCR引物和检测探针的PCR。在其它应用中，也可能在一个反应容器中进行反转录步骤和PCR步骤的情况中(一步RT-PCR)使用引物。这里在实施例中，显示更快的一步RT-PCR的结果。
4)用于PCR扩增物的检测的方法
为了使用由本发明所提供的检测探针，必须使用一种热循环仪，其装备了产生能激发供体探针的荧光染料的波长的光源并且也装备了能测量受体探针的荧光染料的荧光的检测器。
这里在实施例中，当使用Light Cycler
Figure S07196033020070420D00011082348QIETU
(销售商：RocheDiagnostic K.K.)时显示了PCR条件。
5)试剂和试剂盒
也可在试剂盒中连同扩增和检测作为靶的CK19基因的mRNA所需的试剂一起提供本发明的PCR引物和检测探针。
实施例
本发明的实施例将显示如下，尽管本发明不仅限于那些实施例。
实施例1：PCR引物的设计
如上文已提到的，已报道了CK19的加工型的假基因。必须制备即使当这种假基因污染样品时仍不被影响的PCR引物。
为了这种目的，制备三种正向引物(F1-F3)和两种反向引物(R1-R2)。以这种方式设计F1至F3和R1，从而使得它们的3’末端显示CK19假基因和CK19mRNA的错配位点。以这样的方式设计R2，从而使得在其碱基序列中存在内含子-外显子的边界。F1和R1含有CK19假基因的两个错配，且F2、F3和R2有CK19假基因的一个错配。
F1：TGAGTGACATGCGAAGC(SEQ ID No.5碱基的799-815)(SEQ ID No.2)
F2：CGCCAAGATCCTGAGTG(SEQ ID No.5碱基的788-804)(SEQ ID No.8)
F3：GACATGCGAAGCCAATAT(SEQ ID No.5碱基的804-821)(SEQ ID No.9)
R1：TGTGTCTTCCAAGGCA(SEQ ID No.5碱基的1007-1022)(SEQ ID No.4)
R2：CCAAGGCAGCTTTCAT(SEQ ID No.5碱基的999-1014)(SEQ ID No.10)
在下列条件下使用F1/R1、F1/R2、F2/R2和F3/R2的引物组合进行PCR。
关于用于反应的酶(Tth DNA聚合酶)，使用在商业上获得的试剂盒(Light
Figure S07196033020070420D000121
RNA Master杂交探针；销售商：Roche DiagnosticK.K.)。
50mM乙酸锰                         3.25mM
PCR引物                            各0.25μM
Tth DNA聚合酶                      7.5μl/反应
CK19mRNA或CK19假基因               105拷贝/PCR
将含有上述组分的反应溶液(20μl)置于玻璃毛细管内，并使用Light
Figure S07196033020070420D000131
在表1中所示的条件下进行一步RT-PCR，且通过3％琼脂糖凝胶电泳分析5μl反应产物。
表1：
程序1：RT
 
循环程序数据 值
循环 1
分析模式 无
温度靶 片段1
靶温度(℃) 61
温育时间(小时：分钟：秒) 00:05:00
温度转换率(℃/s) 20.0
第二靶温度(℃) 0
步长(Step size)(℃) 0.0
步进延迟(循环) 0
获得模式 无
程序2：变性
 
循环程序数据 值
循环 1
分析模式 无
温度靶 片段1
靶温度(℃) 95
温育时间(小时：分钟：秒) 00:00:30
温度转换率(℃/s) 20.0
第二靶温度(℃) 0
步长(℃) 0.0
步进延迟(循环) 0
获得模式 无
程序3：扩增
Figure S07196033020070420D000141
程序4：冷却
 
循环程序数据 值
循环 1
分析模式 无
温度靶 片段1
靶温度(℃) 40
温育时间(小时：分钟：秒) 00:00:30
温度转换率(℃/s) 20.0
第二靶温度(℃) 0
步长(℃) 0.0
步进延迟(循环) 0
获得模式 无
在F1/R1(在F1和R1两者中，存在CK19假基因的两个错配)中，尽管记录到被认为是CK19基因的扩增物的一些条带，但是根本没有记录到CK19假基因的扩增物。
在F1/R2、F2/R2和F3/R2(在所有R2、F2和F3中，存在一个与CK19假基因的错配)中，尽管没有记录到被认为是CK19基因的扩增物的条带，但是记录到少许CK假基因的扩增物。
据判断难于不通过检测探针的改进来检测CK19假基因的扩增物，由此选择进一步使用没有记录到CK19假基因的扩增物的F1/R1。
实施例2：检测探针的设计
制备并比较两组检测探针。关于供体探针(P1和P1b)，将它们的3’-末端用FITC标记，而关于受体探针，将它们的5’-末端用LC-Red460标记。
第1组
P1：GTCATGGCCGAGCAGAACC(SEQ ID No.5碱基的825-843)(SEQ ID No.11)
P2：AAGGATGCTGAAGCCTGGT(SEQ ID No.5碱基的846-864)(SEQ ID No.12)
第2组
P1b：AAGCCTGGTTCACCAGCCG(SEQ ID No.5碱基的856-874)(SEQ ID No.6)
P2c：CTGAAGAATTGAACCGGGAGG(SEQ ID No.5碱基的877-897)(SEQ ID No.7)
第2组以这种方式设计，从而将外显子-内含子的边界位于两个探针的杂交位置之间，而第1组不这样设计。
为了探针组的评价，将含有下列组分的20μl反应溶液置于玻璃毛细管内，并使用Light Cycler
Figure S07196033020070420D00015082640QIETU
在表1所示的条件下进行一步RT-PCR。
50mM乙酸锰                             3.25mM
PCR引物F1和R1                          各0.25μM
供体探针(P1或P1b)                      25nM
受体探针(P1或P2c)                      100nM
Tth DNA聚合酶                          7.5μl/反应
CK19mRNA或CK19假基因                   105拷贝/PCR
结果，在第1组中记录到了由于CK19基因的扩增的荧光信号，而在第2组中，根本没有记录到荧光信号。
从上述研究中看到，确立了引物(F1和R1)和探针(P1b和P2c)的组合，其中通过选择PCR引物排除了CK19假基因的扩增并且通过选择检测探针排除了CK19基因的扩增信号。
实施例3：CK19mRNA的实时RT-PCR
显示了作为阳性对照的CK19mRNA以及人DNA和CK19假基因的实时RT-PCR的实例。
将CK19mRNA以逐步方式稀释10倍并且使用Light Cycler将105-102拷贝进行一步RT-PCR。类似地，通过RT-PCR扩增500ng人DNA或者105拷贝的CK19假基因并进行检测(所需时间约40分钟)。反应溶液的组成(20μl/PCR)如下：
50mM乙酸锰                     3.25mM
PCR引物F1和R1                  各0.25μM
供体探针P1b                    25nM
受体探针P2c                    100nM
Tth DNA聚合酶                  7.5μl/反应
结果显示在图1和图2中。在那些图中，纵坐标显示荧光的强度，而横坐标显示PCR循环数。
当通过RT-PCR扩增CK19mRNA时，在PCR循环数中产生荧光信号取决于最初的量(图1)，而当类似地将人DNA或CK19假基因进行PCR时，没有记录到这种荧光信号(图2)。
实施例4：人淋巴结中CK19mRNA的检测
显示了使用临床样品的CK19mRNA的实时RT-PCR的实例。在从患cT1NO的胃癌患者中切除的淋巴结中，选择通过病理诊断记录了癌症转移的淋巴结和没有记录到癌症转移的淋巴结，并在含有硫氰酸胍的缓冲液(600μl)中匀浆。使用MagNA Lyser
Figure S07196033020070420D00016082842QIETU
(销售商：Roche Diagnostic K.K.)进行匀浆。向450μl匀浆中添加蒸馏水(500μl)并以14500×g离心，并将上清液(900μl)转移到新管内。向该管中添加用5μM生物素标记的2μl寡核苷酸(生物素-5′-gcttcacatccctccgctgattctcttga)，并使混合物在37℃静置10分钟，因此寡核苷酸和CK19mRNA杂交。
那之后，向其添加用抗生物素蛋白涂覆的磁性颗粒并允许混合物在37℃再放置10分钟，因此在磁性颗粒上捕获mRNA-寡核苷酸复合物。将磁性颗粒用含有表面活性剂的缓冲液洗涤两次以除去过多的组分，然后添加50μlTE缓冲液，从而使得磁性颗粒充分悬浮于其中，并且加热提取磁性颗粒上的CK19mRNA(所需时间约45分钟)。
将所提取的样品(2μl)进行一步RT-PCR。其具体的条件与实施例3中的条件相同(所需的时间是约40分钟)。
结果显示在图3中。在病理诊断中癌症的转移为阳性的淋巴结(#1-#2)在RT-PCR中是阳性的，而在病理诊断中癌症的转移为阴性的淋巴结(#3)在RT-PCR中是阴性的。
实施例5：多重实时RT-PCR的实例
在临床检验中，有时候通过一次测量检验多个检验项目。这对于节约成本和劳力是重要的。尤其是当进行关于存在或不存在癌症细胞以及关于转移的诊断时，仅通过一个单一标记的结果的判断具有错误诊断风险的某种可能性。因此，如果除了CK19mRNA外，可同时进行其它标记的实时RT-PCR，那么可提高将检验应用到临床诊断的有效性。
现在，将作为与CK19相同类型的细胞角蛋白的CK20的mRNA连同CK19mRNA一起进行扩增。此外，确立了单独检测的方案。尽管RT-PCR的条件与上述实施例3中的条件相同，但是向反应溶液中添加用于CK20的PCR引物(CK20F和CK20R)和检测引物(CK20P1和CK20P2)。在检测探针中，对于供体探针用FITC标记3’末端，而对于受体探针，用LC-Red610标记5’末端，以用于与CK19的检测波长进行区分。
CK20F：ATCAAGCAGTGGTACGAAAC(SEQ ID No.13)
CK20R：AGGACACACCGAGCATTT(SEQ ID No.14)
CK20P1：ATTACAGACAAATTGAAGAGCTGCC(SEQ ID No.15)
CK20P2：AGTCAGATTAAGGATGCTCAACTGC(SEQ ID No.16)
50mM乙酸锰                          3.25mM
CK19PCR引物F1和R1                   各0.25μM
CK19供体探针P1b                     25nM
CK19受体探针P2c                     100nM
CK20PCR引物CK20F和CK20R             各0.25μM
CK20供体探针CK20P1                  25nM
CK20受体探针CK20P2                  100nM
Tth DNA聚合酶                       7.5μl/反应
阳性对照，CK19基因的mRNA
阳性对照，CK20基因的mRNA
在相同试管中扩增CK19和CK20两者的mRNA，并且由于它们不同的检测波长(CK19为640nm，且CK20为610nm)，分别监控它们的扩增。
序列表
<110>F.Hoffmann-La Roche AG
<120>快速测定细胞角蛋白19(CK19)的方法和其引物及探针
<130>b056769
<160>
<210>1
<211>115
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>
<222>
<223>编码细胞角蛋白19的mRNA的部分
<400>1
Figure S07196033020070420D000191
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>引物F1
<400>2
<210>3
<211>559
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>
<222>
<223>编码细胞角蛋白19的mRNA的部分
<400>3
Figure S07196033020070420D000201
<210>4
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>引物R1
<400>4
Figure S07196033020070420D000202
<210>5
<211>1407
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>外显子1
<222>1..473
<223>
<220>
<221>外显子2
<222>374..556
<223>
<220>
<221>外显子3
<222>557..713
<223>
<220>
<221>外显子4
<222>714..875
<223>
<220>
<221>外显子5
<222>876..1001
<223>
<220>
<221>外显子6
<222>1002..1380
<223>
<400>5
Figure S07196033020070420D000203
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<223>探针P1b
<400>6
Figure S07196033020070420D000212
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<223>探针P2c
<400>7
Figure S07196033020070420D000213
<210>8
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<223>引物F2
<400>8
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<223>引物F3
<400>9
Figure S07196033020070420D000222
<210>10
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<223>引物R2
<400>10
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<223>探针P1
<400>11
<210>12
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<223>引物F1
<400>12
Figure S07196033020070420D000225
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>20
<223>引物CK20F
<400>
Figure S07196033020070420D000231
<210>14
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<223>引物CK20R
<400>14
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<223>探针CK20P1
<400>15
Figure S07196033020070420D000233
<210>16
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>
<223>引物CK20P2
<400>16
Figure S07196033020070420D000234

Claims (20)

1.一种测定CK19mRNA的方法，其包括
(a)使用引物扩增mRNA的部分，和
(b)使用两个探针检测所形成的扩增物；
其中所述引物是
-第一引物，其具有能使其与位于CK19基因的第一外显子上的区域杂交的序列，和
-第二引物，其具有能使其与位于第一外显子下游的CK19基因的第二外显子上的区域杂交的序列，
其中至少一个所述引物的序列在其3’末端含有至少一个与上述CK19假基因的错配，以及任何一个所述引物含有至少两个与上述CK19假基因的错配；且
其中所述的探针是
-第一探针，其具有能使其与位于所述第一引物结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的外显子的3’末端的区域杂交的序列，和
-第二探针，其具有能使其与位于所述第一探针结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的相邻外显子5’末端的区域杂交的序列，
一个所述探针用供体标记，以及另一个所述探针用受体标记。
2.根据权利要求1的方法，其中所述供体是FITC(异硫氰酸荧光素)，且所述受体选自罗丹明染料和花菁染料。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述第一探针在其3’末端用供体标记，且其中所述第二探针在其5’末端用受体标记。
4.根据权利要求1-3中任何一项的方法，其中所述第一探针与位于CK19基因的外显子4的3’末端的区域杂交，以及所述第二探针与位于CK19基因的外显子5的5’末端的区域杂交。
5.一种同时测定CK19mRNA和CK20mRNA的方法，其包括
(a)使用用于CK19的一组引物和用于CK20的一组引物扩增mRNA的部分，和
(b)使用用于CK19的一组探针和用于CK20的一组的探针检测所形成的扩增物；
其中所述的CK19mRNA的引物是
-第一引物，其具有能使其与位于CK19基因的第一外显子上的区域杂交的序列，和
-第二引物，其具有能使其与位于第一外显子下游的CK19基因的第二外显子上的区域杂交的序列，
其中至少一个所述引物的序列在其3’末端含有至少一个与上述CK19假基因的错配，以及任何一个所述引物含有至少两个与上述CK19假基因的错配；且
其中所述的CK19mRNA的探针是
-第一探针，其具有能使其与位于所述第一引物结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的外显子的3’末端的区域杂交的序列，和
-第二探针，其具有能使其与位于所述第一探针结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的相邻外显子5’末端的区域杂交的序列；
其中所述的CK20mRNA的引物是
-第三引物，其具有能使其与位于CK20基因上的区域杂交的序列，和
-第四引物，其具有能使其与位于第三引物下游的CK20基因上的区域杂交的序列，且
其中所述的CK20mRNA的探针是
-第三探针，其具有能使其与位于所述第三引物结合的区域下游和所述第四引物结合的区域上游的CK20基因上的区域杂交的序列，和
-第四探针，其具有能使其与位于所述第四引物结合的区域上游和所述第三探针结合的区域下游的CK20基因上的区域杂交的序列，
其中用于检测CK19的探针用供体和受体标记，将用于检测CK20的探针用供体和受体标记，其中CK19供体/受体对与CK20供体/受体对不同。
6.根据权利要求5的方法，其中用于CK19检测的一组探针和用于CK20检测的一组探针含有相同的供体，而用于检测CK19的受体不同于用于检测CK20的受体。
7.根据权利要求5或6的方法，其中将所述第一和第三探针在其3’末端用供体标记，其中将所述第二和第四探针在其5’末端用受体标记。
8.根据权利要求5-7中任何一项的方法，其中所述供体是FITC，且所述受体选自罗丹明染料和花菁染料。
9.根据权利要求5-8中任何一项的方法，其中所述第一探针与位于CK19基因的外显子4的3’末端的区域杂交，以及所述第二探针与位于CK19基因的外显子5的5’末端的区域杂交。
10.用于CK19mRNA的扩增和检测的试剂盒，其中所述的试剂盒至少包括
一对引物，其具有
-第一引物，其具有能使其与位于CK19基因的第一外显子上的区域杂交的序列，和
第二引物，其具有能使其与位于所述第一外显子下游的CK19基因的第二外显子上的区域杂交的序列；
其中至少一个所述引物的序列在其3’末端含有至少一个与上述CK19假基因的错配，以及任何一个所述引物含有至少两个与上述CK19假基因的错配；
以及一对探针，其具有
-第一探针，其与位于所述第一引物结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的外显子3’末端的区域杂交，和
-第二探针，其与位于所述第一探针结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的相邻外显子5’末端的区域杂交，
一个所述探针用供体标记，以及另一个所述探针用受体标记。
11.根据权利要求10的试剂盒，其中在混合物中含有引物对，或者其中在混合物中含有探针对，或者在混合物中含有引物对和探针对。
12.根据权利要求10或11的试剂盒，进一步含有缓冲液。
13.根据权利要求10-12中任何一项的试剂盒，其中所述第一探针与位于CK19基因的外显子4的3’末端的区域杂交，以及所述第二探针与位于CK19基因的外显子5的5’末端的区域杂交。
14.用于CK19mRNA和CK20mRNA的组合扩增和检测的试剂盒，其中所述的试剂盒至少包括两对引物和两对探针，其中将所述探针对于CK19和CK20进行不同地标记，且其中所述的用于CK19mRNA扩增的引物包括
-第一引物，其具有能使其与位于CK19基因的第一外显子上的区域杂交的序列，和
-第二引物，其具有能使其与位于所述第一外显子下游的CK19基因的第二外显子上的区域杂交的序列；
其中至少一个所述引物的序列在其3’末端含有至少一个与上述CK19假基因的错配，以及任何一个所述引物含有至少两个与上述CK19假基因的错配；
以及所述的用于CK19mRNA的检测的探针包括
-第一探针，其与位于所述第一引物结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的外显子3’末端的区域杂交，和
-第二探针，其与位于所述第一探针结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的相邻外显子5’末端的区域杂交，
将用于检测CK19的探针用供体和受体标记，且将用于检测CK20的探针用供体和受体标记，其中CK19供体/受体对与CK20供体/受体对不同。
15.根据权利要求14的试剂盒，其中所述的用于CK20mRNA的引物是
-第三引物，其具有能使其与位于CK20基因上的区域杂交的序列，和
-第四引物，其具有能使其与位于第三引物下游的CK20基因上的区域杂交的序列，且
其中所述的用于CK20mRNA的探针是
-第三探针，其具有能使其与位于所述第三引物结合的区域下游和所述第四引物结合的区域上游的CK20基因上的区域杂交的序列，和
-第四探针，其具有能使其与位于所述第四引物结合的区域上游和所述第三探针结合的区域下游的CK20基因上的区域杂交的序列。
16.根据权利要求14或15的试剂盒，其中在混合物中含有引物对，或者在混合物中含有探针对，或者在混合物中含有引物对和探针对。
17.根据权利要求14-16中任何一项的试剂盒，进一步含有缓冲液。
18.根据权利要求14-17中任何一项的试剂盒，其中所述第一探针与位于CK19基因的外显子4的3’末端的区域杂交，以及所述第二探针与位于CK19基因的外显子5的5’末端的区域杂交。
19.用于检测CK19mRNA的物质的组合物，其包括
-第一引物，其具有能使其与位于CK19基因的第一外显子上的区域杂交的序列，
-第二引物，其具有能使其与位于所述第一外显子下游的CK19基因的第二外显子上的区域杂交的序列，
-第一探针，其具有能使其与位于所述第一引物结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的外显子3’末端的区域杂交的序列，和
-第二探针，其具有能使其与位于所述第一探针结合的区域下游和所述第二引物结合的区域上游的CK19基因的相邻外显子5’末端的区域杂交的序列，
其中至少一个所述引物的序列在其3’末端含有至少一个与上述CK19假基因的错配，以及任何一个所述引物含有至少两个与上述CK19假基因的错配，以及其中一个所述探针用供体标记，以及另一个所述探针用受体标记。
20.根据权利要求19的物质的组合物，其中所述第一探针与位于CK19基因的外显子4的3’末端的区域杂交，以及所述第二探针与位于CK19基因的外显子5的5’末端的区域杂交。
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