CN101691566A - 果糖二磷酸钠(fdp)含量测定专用固体复合酶(ald、tim、gdh)试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的果糖二磷酸钠(FDP)含量测定专用固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂其制备及应用方法，该固体复合酶由以下醛缩酶(ALD)、磷酸丙糖异构酶(TIM)、甘油磷酸脱氢酶(GDH)组成。本发明是以动物肌肉为主要原料在一定条件下提取含：醛缩酶(ALD)、磷酸丙糖异构酶(TIM)和甘油磷酸脱氢酶(GDH)的固体复合酶试剂。该固体复合酶在一定的条件下可测定果糖二磷酸钠类的含量，具有专属性强(仅与果糖二磷酸钠反应，与葡萄糖、果糖、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖均无反应)，重复性好(RSD＝1.45％，n＝6)，准确度较高，操作简便的特点。
Description
一种果糖二磷酸钠(FDP)含量测定专用固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂其制备及应用方法。
技术领域
本发明涉及一种果糖二磷酸钠(FDP)类含量测定专用固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂其制备方法。
背景技术
我国药典中现(试行)标准的果糖二磷酸钠的测定方法有酶法和二苯胺法，二苯胺法专属性较差，6-磷酸果糖、果糖均能干扰测定结果，酶法较二苯胺法专属性好。故国家药典委员会关于果糖二磷酸钠类产品转正标准中，需要将果糖二磷酸钠的测定方法中的二苯胺法改为酶法。但酶法中使用的醛缩酶(ALD)、磷酸丙糖异构酶(TIM)和磷酸甘油脱氢酶(GDH)目前国内没有产品，只能从国外购买。根据上述情况，我从2003年开始，对该类酶试剂进行科研和开发。经过多年开发、研制生产出果糖二磷酸钠(FDP)含量测定专用固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂，目前国内外均无同类产品。
本发明是最新研发成为了果糖二磷酸钠(FDP)类含量测定专用固体复合酶试剂。该产品经广州药检所李薇主任、苏广海主住、佟爱东主任多次试验、测试、计算，其各项性能均通过测定和鉴定并规范了测试和计算方法，其功能和方法，完全可以替代同类相关国外产品。该产品的应用办法于2009年加入国药典化发〔2009〕12号文件(果糖二磷酸钠及其制剂质量标准征求意见稿)中：果糖二磷酸钠(FDP)检测方法中的固体复合酶试剂。
果糖二磷酸钠(FDP)含量测定专用固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂在一定的条件下可测定果糖二磷酸钠的含量，具有专属性强(仅与果糖二磷酸钠反应，与葡萄糖、果糖、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖均无反应)，重复性好(RSD＝1.45％，n＝6)，准确度较高，操作简便的特点、优点。该产品填补了国内外相关领域的空白。弘扬了民族产业，打破了国外对果糖二磷酸钠(FDP)类酶试剂的垄断局面，为国内制药、科研用户降低了果糖二磷酸钠(FDP)测试成本。故此，该专用固体复合酶在果糖二磷酸钠类的含量测定上有着广泛的应用。
发明内容
本发明所解决的技术问题是：解决了ALD(醛缩酶)、TIM(磷酸丙糖异构酶)、GDH(甘油磷酸脱氢酶)的提取和各自独立液态以及活力不稳定等技术难题，采取低温定速分离过滤提取和复合低温冻干技术使其稳定性好，使用方便(使用时不需将ALD(醛缩酶)TIM(磷酸丙糖异构酶)GDH(甘油磷酸脱氢酶)另按量配制)和保持活力时间长等优点。
本发明专用固体复合酶其制备方法：
具体制备方法：
以下通过实施来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
取大白免一只，活杀剥皮割下臂、背及大腿部肌肉，低温下用绞肉机绞成肉泥(500毫升)，盛于1000毫升烧杯中，加入等体积水搅拌15分钟后用医用3-4层纱布挤压进行粗过滤，滤渣再用半量水二次抽提，合并两次滤液，加入标准试剂(含量在98％以上)固体流酸铵到饱和(固体流酸铵不溶解)，边加边拌，加完后放冰箱冷藏(5度左右)存放30分钟，存液冷冻离心30分钟，转速为4000转/分(转速过大时，大分子将被分离)，取离心上清液再精细过滤《通过石棉滤板布氏漏斗》去除尚存的沉淀悬浮物。清液中再加入标准试剂(含量在98％以上)固体流酸铵到80％的饱和度。然后将此液以7000转/分(此转速可将有效大分子分离)冷冻离心30分钟，沉淀为粉红色糊状物将其分装在培养皿中，冷冻干燥得粉红色固体。各组分的重量份是：ALD(醛缩酶)20-25份，TIM(磷酸丙糖异构酶)30-40份，GDH(甘油磷酸脱氢酶)30-35份(此物质中90％以上为有效物质其它物质不影响功效)。用研体研成粉末，测定活力，以每克酶每分钟催化FDP大于40微克为合格。外观为粉红色或淡白色固体粉末，将合格品按不同规格分装，密封，低温保存。
专用固体复合酶的活力测定方法：
见2009年加入国药典化发〔2009〕12号文件(果糖二磷酸钠及其制剂质量标准征求意见稿)中：果糖二磷酸钠(FDP)检测方法中的固体复合酶试剂。
专用固体复合酶的应用方法：
见2009年加入国药典化发〔2009〕12号文件(果糖二磷酸钠及其制剂质量标准征求意见稿)中：果糖二磷酸钠(FDP)检测方法中的固体复合酶试剂。
[试验例1]本发明专用固体复合酶，2005年在广州市药品检验所进行的鉴定试验
一、试验材料
1、供试验酶：本发明实施例1所制备的固体复合酶。
2、试验物：果糖二磷酸钠。
二、试验地点和时间
试验地点：广州市药品检验所
试验时间：2005年4月-2005年11月。
三、试验方法
1、仪器与试剂
cary-100紫外可见分光光度计(美国varian)；
D-无水葡萄糖对照品(批号110833-200302)、果糖对照品(批号100231-200303)、果糖二磷酸钠对照品(100539-200301，含量为74.1％)均购于中国药品生物制品检验所；
果糖二磷酸钠样品为国内海南长安国际制药有限公司；河北长天药业有限公司：国药集团国瑞药业有限公司提供；
6-磷酸葡萄糖(批号052k7043)、6-磷酸果糖(043k7005)购于Sigma公司；
还原型辅酶I(还原性烟酰胺腺嘌呤二核甘酸NADH)购于德国Boehringer Mannheim公司；
固体复合酶由发明人提供，商品名”怡心力”；
其他试剂均为分析纯。
2、实验方法和结果
2.1试液配制
2.1.1盐酸三乙醇胺缓冲液(0.4mol/L，pH7.6)：取盐酸三乙醇胺18.6g，加水200ml溶解，加3.7g乙二胺四乙酸二钠，用2mol/L氢氧化钠调节pH值至7.60，加水稀释至250ml。4℃保存，可稳定保存一周。
2.1.2复合酶溶液：取固体复合酶0.1g，用盐酸三乙醇胺缓冲液(pH7.6)溶解并稀释至10ml。垂熔漏斗过滤，4℃保存。
2.1.3还原型辅酶I(NADH)溶液：取还原型辅酶I 6.5mg，用盐酸三乙醇胺缓冲液溶解并稀释至50ml。
2.1.4空白酶溶液：取固体复合酶60mg，用盐酸三乙醇胺缓冲液(pH7.6)溶解并稀释至20ml。垂熔漏斗过滤，4℃保存，两天内使用。
2.1.5测定酶溶液：取空白酶溶液10ml，加还原型辅酶I 3.0mg，溶解后4℃保存，两天内使用。
2.2专属性：
分别取D-无水葡萄糖对照品、果糖对照品、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖、果糖二磷酸钠对照品适量，用水溶解并制成每1ml约含0.4mg的溶液，按含量测定方法项下测定吸光度，结果仅果糖二磷酸钠溶液的吸光度降低，其余溶液的吸光度无变化，表明国产复合酶试剂仅与果糖二磷酸钠反应，与葡萄糖、果糖、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖均无反应。
2.3还原型辅酶I(NADH)的摩尔吸收系数及浓度的确定
果糖二磷酸钠经醛缩酶的作用下，裂解成3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮(在磷酸丙糖异构酶作用下二分子可以互变)，3-磷酸甘油醛经脱氢酶氧化等一系列过程，生成丙酮酸[5]，这个反应需要还原型辅酶I(NADH)提供H+转化为NAD，引起NADH的数量变化，NADH在340nm波长处有特征吸收峰，NAD在340nm波长处却无这一吸收带，可以从NADH的吸光度变化，测定果糖二磷酸钠的含量。从默克索引“MERCK INDEX”可查到还原型辅酶I(NADH)在340nm波长处的摩尔吸收系数为6290，水分约为7~8％，固体复合酶活力测定方法的反应条件下，吸收度值为1左右时浓度约为0.012％。
2.4缓冲液的选择
选取盐酸三乙醇胺缓冲液(0.4mol/L，pH7.6)和Tris(三羟甲基铵基甲烷)缓冲液(0.1mol/L，pH7.6)分别按固体复合酶活力测定方法项下测定复合酶活力(批号050703)，结果分别为48.5μg/分钟/mg和50.7μg/分钟/mg，两者差别不大，为了与国家药品标准试验条件一致，选取盐酸三乙醇胺缓冲液测定复合酶活力。
2.5固体复合酶活力测定方法
2.5.1测定方法
取果糖二磷酸钠0.3g(按无水物计算)，用水溶解并稀释至10ml制成果糖二磷酸钠溶液。
取石英吸收池两只，一只加还原型辅酶I溶液2.99ml和果糖二磷酸钠溶液10μl，作为样品池；另一只加盐酸三乙醇胺缓冲液2.99ml和果糖二磷酸钠溶液10μl，作为空白池，摇匀，静置5分钟，照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版二部附录IVA)，在340nm波长处测定吸光度。向样品池中加入复合酶溶液40μl，在20℃～25℃立即摇匀并准确记时，于1、2、3、4、5分钟分别测定吸光度，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标作图，取近似直线部分的斜率(即平均每分钟吸收度的差值ΔA)按下式计算复合酶的活力。
式中：6.29×103为还原型辅酶I(NADH)的摩尔吸收系数
3为反应溶液体积(ml)
406.06为果糖二磷酸钠三钠盐的分子量(C6H11Na3O12P2)
1000为毫克转化为微克(μg)
2为果糖二磷酸钠反应系数
W为加入样品池中的酶溶液毫克数(mg)
2.5.2测定结果
四批复合酶的活力测定结果见表一，酶活力反应曲线见说明书附图1。
表一.复合酶活力测定结果
| 批号 | 050602 | 050703 | 050804 | 050905 |
| 加入酶量(mg) | 0.4088 | 0.4052 | 0.4040 | 0.4032 |
| 斜率(n＝2) | 0.1225 | 0.1809 | 0.1894 | 0.1735 |
| 酶活力(μg/分钟/mg) | 29.0 | 43.3 | 45.4 | 41.7 |
附图说明：图1是复合酶的活力反应曲线图
酶活力是指酶催化一定化学反应的能力[6]，实质上是以酶催化的反应速度来表示，酶催化的反应速度愈大，酶的活力就愈高，速度愈小，酶的活力就愈小。在进行酶活力测定时，应该选择反应产物与反应时间呈线性关系的区段，才能真实地代表酶活力。从图一可见，在上述测定方法的反应条件下，反应产物(吸光度)与反应时间呈线性关系，酶反应速度近似恒定，符合酶活力测定的要求。
复合酶活力系指每毫克酶每分钟催化果糖二磷酸钠的微克数(μg/分钟/mg)，应不少于40微克。
2.6含量测定方法
2.6.1测定方法
取本品适量，精密称定，加水溶解并制成每1ml约含0.4mg(按无水物计算)的溶液作为供试品溶液。
精密量取盐酸三乙醇胺缓冲液2ml，测定酶溶液1ml，置石英吸收池中；另精密量取盐酸三乙醇胺缓冲液2ml，空白酶溶液1ml置另一吸收池，作为空白，摇匀，静置15分钟，照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版二部附录IVA)，在340nm波长处测定吸光度A1。各池再分别精密加入供试品溶液0.1ml，摇匀，于20℃～25℃放置10分钟，在340nm波长处测定，直至吸光度基本不变，读取吸光度A2。求出吸光度差值ΔA(ΔA＝A1-1.0333A2)，按下式计算，即得。
式中3.0为加入供试品溶液前样品池中溶液的体积(ml)
6.29×103为还原型辅酶I(NADH)的摩尔吸收系数
2为果糖二磷酸钠反应系数
406.06为果糖二磷酸钠三钠盐的分子量(C6H11Na3O12P2)
0.1为供试品溶液加入体积(ml)
W为供试品的取样量(mg)(以无水物计算)
2.6.2线性范围
精密称取果糖二磷酸钠对照品，加水配成1mg/ml(按无水物计算)的对照品溶液，分别精密量取对照品溶液1、2、3、4、5、6ml，置10ml量瓶中，加水稀释到刻度，用三个批号(050703、050804、050905)的酶试剂按含量测定方法操作测定吸收度，将吸收度(A)与浓度(C)做线性回归，得果糖二磷酸钠的线性回归方程为：
A＝-0.003664+0.9960C，r＝0.9995
A＝0.004976+0.9805C，r＝0.9999
A＝0.007319+0.9696C，r＝0.9996
结果表明，果糖二磷酸钠在0.1~0.6mg/ml浓度范围内与吸收度呈良好线性关系。
2.6.3精密度试验
精密称取果糖二磷酸钠对照品，加水配成0.4mg/ml(按无水物计算)的对照品溶液，用上述四批固体复合酶溶液按含量测定方法操作重复测定吸收度，结果见表二。
表二.固体复合酶精密度试验结果
| 批号 | 050602 | 050703 | 050804 | 050905 |
| RSD(％) | 1.45(n＝6) | 0.849(n＝5) | 0.693(n＝6) | 0.319(n＝6) |
结果表明精密度良好。
2.6.4重复性试验
取注射用果糖二磷酸钠和果糖二磷酸钠注射液各一批，精密称定或量取多份，加水配成0.4mg/ml(按无水物计算)的溶液，按含量测定方法操作测定，结果见表三。
表三.重复性试验结果
| 剂型 | 注射用果糖二磷酸钠 | 果糖二磷酸钠注射液 |
| 批号 | 20040201 | 040517 |
| 含量(％) | 102.03 | 89.4 |
| RSD(％) | 0.97(n＝12) | 0.86(n＝9) |
结果表明重复性良好。
2.6.5回收率试验
精密称取已知含量的注射用果糖二磷酸钠(批号20040201)九份，置100ml量瓶中，配成相当于标示量70％、100％、130％的溶液，分别精密加入14.01mg/ml果糖二磷酸钠对照品溶液2ml，加水至刻度，按含量测定方法操作，回收率好。
取六批样品，分别制备样品溶液，按含量测定方法进行操作，测定结果见表六。
表六含量测定结果
| 样品名称 | 批号 | 结果 |
| 注射用果糖二磷酸钠 | 20040201 | 101.4％ |
| 注射用果糖二磷酸钠 | 20040202 | 97.4％ |
| 注射用果糖二磷酸钠 | 20040202 | 100.5％ |
| 果糖二磷酸钠注射液 | 040516 | 92.4％ |
| 果糖二磷酸钠注射液 | 040517 | 92.6％ |
| 果糖二磷酸钠注射液 | 040518 | 92.7％ |
3结论
3.1固体复合酶活力测定实际是测定酶反应的速度，为保证测得的是反应的初速度(反应产物与反应时间呈线性关系)，底物浓度应足够大，把酶完全饱和，这样酶反应对于底物来说是零级反应，测得的酶活力才能准确地代表酶的含量。固体复合酶活力测定方法的酶反应条件中，参与反应的还原型辅酶I(NADH)有0.5μmol，理论上作为底物的果糖二磷酸钠参与反应数量应不少于0.25μmol，固体复合酶参与反应数量为0.4mg，按酶活力为40μg/分钟/mg反应时间为5分钟计算，需要底物80μg，即0.2μmol，底物实际配制为0.74μmol，为理论值的3倍左右，底物浓度足够完成反应。如果固体复合酶活力过高，可适当调低复合酶溶液的浓度。酶活力愈大，表明酶含量愈高，通过测定酶活力，可控制固体复合酶的质量。
3.2含量测定方法中通过测定NADH的数量变化来测定底物果糖二磷酸钠的浓度，为了确保反应完全，应加入大量的酶和小量的底物。含量测定方法的的酶反应条件中，参与反应的还原型辅酶I(NADH)有0.4μmol，理论上作为底物的果糖二磷酸钠参与反应数量应少于0.2μmol，固体复合酶参与反应数量为3mg，按酶活力为40μg/分钟/mg计算，可催化底物120μg/分钟，即0.3μmol/分钟，底物实际配制为0.1μmol，为理论值的0.5倍左右，底物能够反应完全。如果固体复合酶活力过低，可适当调高复合酶溶液的浓度。
3.3含量测定方法中通过NADH在340nm波长处的摩尔吸收系数计算果糖二磷酸钠的含量，紫外分光光度计的波长准确度对测定结果有一定影响，实验数据表明，最大吸收波长与340nm波长处的吸光度差值可达0.001左右。
3.4酶反应生成物氧化型辅酶I(NAD)在340nm波长处有较弱吸收，国产试剂NAD(纯度90％以上)的0.1mg/ml溶液吸光度A340nm为0.0035，Sigma试剂NDA(纯度97％以上)的0.1mg/ml溶液吸光度A340nm为0.0025，约为同浓度NADH吸光度的0.3％。
3.5含量测定方法为底物测定法，而非速度法，测定环境的温度对酶反应速度有影响，对底物的总变化量影响不大。实验数据表明，测定温度高，达到吸光度基本不变的时间相对缩短，测定温度低，反应时间相对延长，但吸光度差值ΔA基本不变。
[试验例2]本发明专用固体复合酶2009年在广州市药品检验所在果糖二磷酸钠上的含量应用测定试验
一、试验材料
1、供试验酶：本发明实施例1所制备的固体复合酶。
2、试验物：果糖二磷酸钠。
二、试验地点和时间
试验地点：相关药厂
负责汇总单位：广州市药品检验所
试验时间：2009年2月-2009年6月。
2009年在广州市药品检验所根据2009年加入国药典化发〔2009〕12号文件要求，有资格生产果糖二磷酸钠的相关企业，对本发明实施例1所制备的固体复合酶进行测试。
三、试验方法
按2009年加入国药典化发〔2009〕12号文件(果糖二磷酸钠及其制剂质量标准征求意见稿)中：果糖二磷酸钠(FDP)检测方法。
四、试验结果
【含量测定】根据2009年加入国药典化发〔2009〕12号文件要求：各企业根据“混悬液酶试剂(进口)”、“固体复合酶试剂(国产)”两种方法对本品的含量测定进行研究，可根据不同的酶试剂确定其中一种方法。主要考察进口酶试剂和国产酶试剂哪个更符合检测的要求。
结果：
五、结论
上述试验结果表明，本发明的果糖二磷酸钠(FDP)含量测定专用固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂在果糖二磷酸钠上的含量测定效果试验，说明发明的果糖二磷酸钠(FDP)含量测定专用固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂与进口酶具有同等检测功能，完全可替代进口混悬液酶试剂即ALD(醛缩酶)TIM(磷酸丙糖异构酶)GDH(甘油磷酸脱氢酶)。
Claims (4)
1.一种新的果糖二磷酸钠(FDP)含量测定专用固体复合酶(ALD、TIM、GDH)试剂其制备及应用方法，该固体复合酶由以动物肌肉为原料从中提取以下ALD(醛缩酶)TIM(磷酸丙糖异构酶)GDH(甘油磷酸脱氢酶)的固体复合酶。
2.按照权利要求1所述的固体复合酶，其特征在于，各组分的重量份是：ALD(醛缩酶)20-25份，TIM(磷酸丙糖异构酶)30-40份，GDH(甘油磷酸脱氢酶)30-35份。
3.按照权利要求2所述的固体复合酶，其特征在于，各组分的重量份是：ALD(醛缩酶)20份，TIM(磷酸丙糖异构酶)30份，GDH(甘油磷酸脱氢酶)30份。
4.权利要求1-3任何一项所述固体复合酶在测定果糖二磷酸钠类含量的应用。
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