CN101690887B - 寡肽反相色谱固定相及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明寡肽反相色谱固定相及其制备方法，采用“链接化学”作为键合反应方法键合寡肽分子，首先在硅胶表面引入末端炔基，然后以甲醇、乙腈、二甲亚砜或这些溶剂的混合体为反应溶剂，将修饰有叠氮基团的寡肽键合到硅胶表面，即得寡肽反相色谱固定相；该固定相具有结构规整有序，反应位点单一，而且在结构中引入三唑环、脲键、苯环、肽键、酯基将产生多种作用力，如氢键作用、静电相互作用、π-π作用、偶极-偶极相互作用、疏水性相互作用等等，可在与C18构建的二维中实现对复杂组分的正交性分离；采用“链接化学”作为键合反应方法，可以在温和的条件下实现高选择性和高转化率的固载。

Description

寡肽反相色谱固定相及其制备方法

【技术领域】

本发明涉及液相色谱固定相技术，具体的说，是一种使用“链接化学”(click chemistry)作为键合方法键合寡肽反相色谱固定相的制备方法。

【技术背景】

反相高效液相色谱(英文简称RP-HPLC)是目前使用最为广泛的高效分离技术，但是，目前反相色谱中最常使用的疏水固定相，如C18，C8等主要是长链烷烃，导致固定相与被分离组分之间作用力过于单一(主要是疏水性相互作用)，使得对于复杂组分(如在蛋白组学、代谢组学、制药工业、天然产物等领域)的分离面临着巨大的挑战。反相/反相二维色谱是复杂组分分离的一种重要手段，由不同的反相固定相构建的二维色谱，如氰基柱/C18、聚乙二醇/C18、二氧化锆/C18已有文献报道。但是，目前可与C18固定相结合用于二维色谱分离的新型反相固定相依然十分匮乏。因此，发展新型反相固定相在方法学研究和实际应用中都具有重大的意义。

“链接化学”、或为“点击化学”(click chemistry)是由贝瑞·夏普利斯(K.Barry Sharpless)等提出的，其核心是用少量简单可靠和高选择性的化学转变来获得更广泛的分子多样性，它开创了快速、有效、甚至是100％可靠的、高选择性地制造各类新化合物的合成化学新领域。其中，最为广泛应用的反应是Huisgen 1，3-diploar cycloaddition反应，它在色谱固定相的合成上发挥了很重要的作用，其反应式如下：

【发明内容】

本发明的目的在于提供一种新型的寡肽反相色谱固定相及其制备方法，以满足在对复杂组分分离的要求，并可与传统的长链烷烃固定相(C18)联用，构建二维色谱。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种寡肽反相色谱固定相，其结构为：

其中，R是由疏水性氨基酸合成的寡肽。

所述的疏水性氨基酸包括丙氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸。

一种寡肽反相色谱固定相的制备方法，其特征是，使用“链接化学”作为键合方法键合寡肽分子，包括以下步骤：

(1)硅胶表面引入炔基

①在有机溶剂中加入硅烷偶联剂、丙炔胺，硅烷偶联剂、丙炔胺的摩尔比为1～5∶1.2～5，于60～150℃条件下反应6～36小时；

②然后加入活化的微球型硅胶，每克微球型硅胶所需的硅烷偶联剂为1～10mmol；

③在80～120℃条件下继续反应12～48小时后，用砂芯漏斗过滤，依次用二氯甲烷、甲醇、丙酮洗涤，得到固体物；

④将步骤(1)③所得的固体物于真空干燥箱中在40～120℃条件下干燥6～12小时，即得末端炔基硅胶；

(2)用“链接化学”键合寡肽反相色谱固定相

①将步骤(1)制备的炔基硅胶加入体积比为1/1～10/1的乙腈/甲醇或二甲基亚砜/甲醇混合溶剂中，每克炔基硅胶所需混合溶剂量为20～50mL；

②再加入修饰有叠氮基团的寡肽及催化剂，修饰有叠氮基团的寡肽加入的摩尔剂量为硅胶上炔基的摩尔剂量的1～15倍，催化剂为一价铜，所用摩尔剂量为叠氮寡肽摩尔剂量的1～10％；

③在10～80℃条件下反应72～200小时后，用砂芯漏斗过滤，依次用甲醇、重量浓度为2～20％的EDTA二钠水溶液、水、甲醇、丙酮洗涤，得到固体物；

④将步骤(2)③所得的固体物于真空干燥箱中在40～80℃条件下干燥6～12小时，即得寡肽反相色谱固定相。

上述步骤(1)①采用的有机溶剂为N，N--二甲基甲酰胺，每克硅胶所需有机溶剂的量为5～30mL。

上述步骤(1)①采用的硅烷偶联剂的结构为：

其反应式为：

上述步骤(1)②采用的微球型硅胶是为粒径和孔径均匀的全多孔硅胶球状体，其粒径为5～40μm，孔径为60～300

上述步骤(2)采用的修饰有叠氮基团的寡肽是由疏水性氨基酸合成的。

所述的疏水性氨基酸包括丙氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸。

上述步骤(2)②采用的修饰有叠氮基团的寡肽加入的摩尔剂量为硅胶上炔基的摩尔剂量的1～5倍。

上述步骤(2)②采用的催化剂为一价铜，所用剂量为叠氮寡肽摩尔剂量的5～10％。

本发明的积极效果是：

(1)寡肽反相色谱固定相结构规整有序，反应位点单一，而且在结构中引入三唑环、脲键、苯环、肽键、酯基将产生多种作用力，如氢键作用、静电相互作用、π-π作用、偶极-偶极相互作用、疏水性相互作用等等，可在与C18构建的二维中实现对复杂组分的正交性分离。

(2)采用“链接化学”作为键合反应方法，可以在温和的条件下实现高选择性和高转化率的固载。

【附图说明】

附图1为本发明寡肽反相色谱固定相的制备方法的流程框图；

附图2为本发明实施例制备的苯甘氨酸二肽固定相在反相模式下的柱效评价色谱图；

附图3为本发明实施例制备的苯甘氨酸二肽固定相与C18进行正交性评价结果图。

【具体实施方式】

本发明所述的寡肽反相色谱固定相可有效地用于反相色谱模式，在与传统的长链烷烃固定相(C18)构建的二维中实现高度的正交分离。以下结合附图说明给出本发明的实施例，对本发明做进一步的说明；提供的实施例仅限于说明本发明，而非对本发明实施范围的限定。

实施例包含以下步骤：

(1)叠氮磺酰咪唑盐酸盐的制备

将50mmol磺酰氯(约4mL)在冰水浴下滴加入50mmol NaN₃(约3.2g)的100mL无水MeCN的悬浮液中，混合物在室温下搅拌过夜；

将100mmol咪唑(约6.8g)在冰水浴下慢慢加入上述体系中，得到的乳浊液在室温下再搅拌过夜；

在混合物中加入75mL乙酸乙酯稀释，依次用2×75mL H₂O，2×120mL饱和NaHCO₃溶液进行萃取，有机相加入无水Na₂SO₄干燥，抽滤，成盐：将HCl的EtOH溶液(5.4mL乙酰氯在冰水浴下滴加到19mLEtOH中生成)滴加到上述有机相中，析出白色固体，抽滤，用乙酸乙酯洗涤，得到固体叠氮磺酰咪唑盐酸盐；

(2)叠氮L-苯甘氨酸二肽的制备

将6mmol磺酰咪唑叠氮盐酸盐(约1.26g)加入5mmol L-苯甘氨酸(0.76g)、13.5mmol K₂CO₃(1.87g)、0.05mmol CuSO₄·5H₂O(12.5mg)和25mL MeOH的混合物中，在室温下反应12小时(h)，用稀盐酸调节PH值为2，滤去固体，将滤液浓缩，除去MeOH；加入乙酸乙酯和水进行萃取，滤液干燥浓缩后得到叠氮L-苯甘氨酸；将叠氮L-苯甘氨酸上的羧基与L-苯甘氨酸甲酯上的氨基缩合，得到叠氮L-苯甘氨酸二肽；

(3)炔基硅胶的制备

在250mL三口烧瓶中加入100mL无水N，N-二甲基甲酰胺、35mmol(约8.66mL)3-异氰酸丙基三乙氧基硅烷、42mmol丙炔胺(约2.88mL)，在85℃条件下反应12小时(h)，然后加入粒径为5μm的球形硅胶颗粒10g，在110℃条件下再反应31小时(h)，然后依次用300mL二氯甲烷、500mL甲醇、250mL丙酮洗涤，在60℃条件下真空干燥7小时，即得到末端炔基硅胶；

(4)利用“链接化学”制备L-苯甘氨酸二肽固定相

取2.5g干燥后的末端炔基硅胶置于反应器中，加入50mL甲醇、50mL乙腈、3.05mmol叠氮L-苯甘氨酸二肽(约0.99g)，然后加入0.15mmol碘化亚铜作为催化剂，室温下反应108小时(h)，依次用300mL甲醇、300mL10％的EDTA二钠溶液、300mL水、300mL甲醇、200mL丙酮洗涤，室温下真空干燥12小时即得L-苯甘氨酸二肽固定相产品，其结构为：

(5)装柱进行色谱评价

将所得的L-苯甘氨酸二肽固定相填装于2.1mm×100mm的不锈钢HPLC色谱柱中，制得的色谱柱用于测试其在反相色谱模式下测试柱效，流动相为乙腈/水＝15/85，流速为0.2mL/min，柱温为30℃，检测波长为220nm，色谱图如附图3所示(图中，1为尿嘧啶，2为苯胺，3为苯酚，4为甲苯，5为乙苯)。

利用25个芳香族化合物对苯甘氨酸二肽柱和C18柱展开正交性评价，流动相为乙腈/水＝30/70，如附图4所示(图中1～25分别是：1为苯、2为甲苯、3为氯苯、4为溴苯、5为硝基苯、6为苯甲醚、7为苯甲酸乙酯、8为邻氯苯乙酮、9为对硝基苯乙酮、10为2-氯苯甲醛、11为肉桂醛、12为间甲基肉桂醛、13为邻氯肉桂醛、14为吲哚、15为5-甲氧基吲哚、16为6-甲基吲哚、17为2-氯硝基苯、18为4-氯硝基苯、19为对氯苯酚、20为2-硝基酚、21为3-硝基酚、22为1-萘酚、23为2-萘酚、24为邻甲苯胺、25为对乙苯胺)，二维系统正交度高达63.49％。

Claims (10)

1.一种寡肽反相色谱固定相，其特征在于，其结构为：

其中，R是由疏水性氨基酸合成的寡肽。

2.根据权利要求1所述的寡肽反相色谱固定相，其特征在于，所述的疏水性氨基酸包括丙氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸。

3.一种如权利要求1所述的寡肽反相色谱固定相的制备方法，其特征在于，使用“链接化学”作为键合方法键合寡肽分子，包括以下步骤：

(1)硅胶表面引入炔基

①在有机溶剂中加入硅烷偶联剂、丙炔胺，硅烷偶联剂、丙炔胺的摩尔比为1～5∶1.2～5，于60～150℃条件下反应6～36小时；

②然后加入活化的微球型硅胶，每克微球型硅胶所需的硅烷偶联剂为1～10mmol；

③在80～120℃条件下继续反应12～48小时后，用砂芯漏斗过滤，依次用二氯甲烷、甲醇、丙酮洗涤，得到固体物；

④将步骤(1)③所得的固体物于真空干燥箱中在40～120℃条件下干燥6～12小时，即得末端炔基硅胶；

(2)用“链接化学”键合寡肽反相色谱固定相

①将步骤(1)制备的炔基硅胶加入体积比为1/1～10/1的乙腈/甲醇或1/1～10/1的二甲基亚砜/甲醇混合溶剂中，每克炔基硅胶所需混合溶剂量为20～50mL；

②再加入修饰有叠氮基团的寡肽及催化剂，修饰有叠氮基团的寡肽加入的摩尔剂量为硅胶上炔基的摩尔剂量的1～15倍，催化剂为一价铜，所用摩尔剂量为叠氮寡肽摩尔剂量的1～10％；

③在10～80℃条件下反应72～200小时后，用砂芯漏斗过滤，依次用甲醇、重量浓度为2～20％的EDTA二钠水溶液、水、甲醇、丙酮洗涤，得到固体物； 

④将步骤(2)③所得的固体物于真空干燥箱中在40～80℃条件下干燥6～12小时，即得寡肽反相色谱固定相。

4.根据权利要求3所述的寡肽反相色谱固定相的制备方法，其特征在于，步骤(1)①采用的有机溶剂为N，N--二甲基甲酰胺，每克硅胶所需有机溶剂的量为5～30mL。

5.根据权利要求3所述的寡肽反相色谱固定相的制备方法，其特征在于，步骤(1)①采用的硅烷偶联剂的结构为：

其反应式为：

6.根据权利要求3所述的寡肽反相色谱固定相的制备方法，其特征在于，步骤(1)②采用的微球型硅胶是为粒径和孔径均匀的全多孔硅胶球状体，其粒径为5～40μm，孔径为60～ 

7.根据权利要求3所述的寡肽反相色谱固定相的制备方法，其特征在于，步骤(2)采用的修饰有叠氮基团的寡肽是由疏水性氨基酸合成的。

8.根据权利要求7所述的寡肽反相色谱固定相的制备方法，其特征在于，所述的疏水性氨基酸包括丙氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸。

9.根据权利要求3所述的寡肽反相色谱固定相的制备方法，其特征在于，步骤(2)②采用的修饰有叠氮基团的寡肽加入的摩尔剂量为硅胶上炔基的摩尔剂量的1～5倍。

10.根据权利要求3所述的寡肽反相色谱固定相的制备方法，其特征在于，步骤(2)②采用的催化剂为一价铜，所用剂量为叠氮寡肽摩尔剂量的5～10％。 

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