CN101671742B

CN101671742B - 检测葡萄苦腐病菌的引物和探针及其检测方法

Info

Publication number: CN101671742B
Application number: CN2009102361126A
Authority: CN
Inventors: 杜洪忠; 吴品珊
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2009-10-20
Filing date: 2009-10-20
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2029-10-20
Also published as: CN101671742A

Abstract

本发明提供了一种葡萄苦腐病菌检测用引物及探针，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。本发明还进一步提供了检测葡萄苦腐病菌的方法，该方法以样品总DNA为模板，利用上述引物和探针进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。本发明探针特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度高，为进出口安全提供了保证。

Description

检测葡萄苦腐病菌的引物和探针及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及葡萄苦腐病菌检测用引物和探针及其检测方法。

背景技术

葡萄苦腐病(bitter rot)是美国和澳大利亚等国葡萄(Vitis viniferaL.)上重要的果实腐烂病害，其病原菌葡萄苦腐病菌(Greeneriauvicola)主要分布在美国、澳大利亚、新西兰、巴西、南非、希腊、印度、日本和中国台湾，我国大陆没有明确记录，是我国重要的检疫性有害生物。G.uvicola病菌可侵染葡萄的果实和枝叶，对鲜食葡萄和酒用葡萄等都有严重影响，使葡萄的产量和果实的质量、风味下降。G.uvicola病菌可随水果(葡萄)贸易进行传播，为保护我国经济发展，我国已对多个国家的鲜食葡萄实行了市场准入，密切防范该危险性有害生物的进入。

本发明选择葡萄苦腐病菌ITS序列设计一条荧光标记探针和一对引物，建立了葡萄苦腐病菌的荧光PCR检测方法，反应结束即可根据扩增曲线判定是否有葡萄苦腐病菌。

发明内容

本发明目的在于提供一种葡萄苦腐病菌检测用引物及一种葡萄苦腐病菌检测用探针。

本发明另一目的在于提供一种葡萄苦腐病菌的检测方法。

根据发明目的，本发明提供一种葡萄苦腐病菌检测用引物，其核苷酸序列为：

FP：5’-TCGCGGCTGGAGAAGG-3’

RP：5’-TCGATGCCAGAACCAAGAGAT-3’。

本发明还提供一种含有前述引物的试剂盒。

本发明还提供一种与前述引物配合使用的探针，其核苷酸序列为：5’-TGCCGGTGGCCCTGTAAACTCTTGT-3’，该探针一端标记有报告荧光染料，另一端采用了荧光性的淬灭基团。

前述的探针，其5’端标记有FAM荧光染料，3’端采用了荧光性的淬灭基团TAMRA。可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物序列设计其他类型的探针，以适用不同方法的荧光PCR检测。

本发明还提供一种含有前述引物及探针的试剂盒。

本发明另外提供一种检测葡萄苦腐病菌的方法，其是以样品总DNA为模板，利用前述的引物及探针进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

前述的方法，其中实时荧光PCR的反应过程中的退火和延伸温度为60℃。

本发明通过分析已报道葡萄苦腐病菌ITS序列的基础上，分别设计引物和荧光探针。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1和2所示；所述探针核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示，该探针为普通的Taqman探针。

普通Taqman探针技术，即将报告荧光染料标记在探针的5’端，而3′端采用了荧光性的淬灭基因，当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基因吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将与模板结合的探针切断，淬灭基团的抑制作用消失，报告荧光染料产生荧光信号，从而实现对葡萄苦腐病菌的检测。

本发明还进一步给出了应用上述引物和探针的荧光PCR检测方法，具体地说本发明以样品总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应，反应体系为：8μL超纯水，12.5μL2×Master Mix，1μL引物FP(10μmol/L)，1μL引物RP(10μmol/L)，1.5μL TaqMan探针(10μmol/L)，1μL(1ng)总DNA，总体积为25μL。TaqMan One-Step RT-PCR MasterMix Reagents购自Applied Biosystems公司。

反应条件：第一个循环为95℃10min；随后40个循环，94℃15s，60℃1min。

本发明根据葡萄苦腐病菌ITS序列设计的引物及探针，该探针特异性好，用于荧光PCR检测灵敏性高。此外，本发明检测方法准确性高、灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有葡萄苦腐病菌，为进出口安全提供了保证。

附图说明

图1是本发明实施例4采用实时荧光PCR技术检测葡萄苦腐病菌的结果示意图，1：G.uvicola；2：感染G.uvicola的红提葡萄；3：ddH₂O；4：空白对照；5：红提葡萄；6：Plasmopara viticola；7：Colletotrichum gloeosporioides；8：Botrytis cinerea；9：Coniothyriumdiplodiella；10：Monilinia fructigena；11：Penicillium expansum；12：Mucor piriformis；

图2是本发明实施例5检测方法的灵敏度检测实验结果示意图，1：DNA浓度50ng/μL；2：DNA浓度5ng/μL；3：DNA浓度0.5ng/μL；4：DNA浓度0.05ng/μL；5：DNA浓度0.005ng/μL；6：DNA浓度0.0005ng/μL；7：DNA浓度0.00005ng/μL；8：ddH₂O；9：空白对照。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 引物及探针的设计和合成

根据葡萄苦腐病菌ITS序列，采用探针设计软件Express 3.0设计引物及探针，引物序列为：

FP(正向)：5’-TCGCGGCTGGAGAAGG-3’

RP(反向)：5’-TCGATGCCAGAACCAAGAGAT-3’

探针的序列为：5’-TGCCGGTGGCCCTGTAAACTCTTGT-3’，

该探针的5’端用FAM荧光染料标记，3′端采用了荧光性的淬灭基团TAMRA。

实施例2 总DNA的提取

1)采集适量真菌菌丝体或染病果实、叶片，用液氮研成粉末，取0.4g装入1.5mL离心管中。

2)预热CTAB提取液到65℃，加600μL到装有粉末的1.5mL离心管中，混匀。

3)立即置于65℃水浴1h，后加入(500μL)氯仿/异戊醇(24∶1)，上下颠倒数次，13200g离心10分钟。

4)吸取上清液约400μL于一新2.0ml离心管，加入(500μl)氯仿/异戊醇(24∶1)，500μL CTAB提取液，轻轻混匀，13200g离心10分钟。

5)取800μl上清于一新1.5mL离心管，加入500μL异丙醇，轻轻混匀，室温放置20min。

6)13200g离心20min，去上清，用70％乙醇洗沉淀，室温干燥。

7)加入50μL 1×TE Buffer(10mM Tris-HCl；1mM EDTA；含20μg Rnase；PH＝8.0)，置于4℃过夜，待DNA溶解后，检测DNA浓度及质量。

实施例3 实时PCR扩增方法的建立

1、实时荧光PCR反应体系

以总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应，反应体系为：8μL超纯水，12.5μL2×Master Mix，1μL引物FP(10μmol/L)，1μL引物RP(10μmol/L)，1.5μL TaqMan探针(10μmol/L)，1μL(1ng)总DNA，总体积为25μL。

2、实时荧光PCR反应条件

将样品管放入ABI公司ABI 7700荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应：第一个循环为95℃10min；随后40个循环，94℃15s，60℃1min。每个循环结束后采集数据。反应结束后根据扩增曲线判定结果。

实施例4 葡萄苦腐病菌实时PCR方法的特异性确定

以真菌菌丝体或染病葡萄果实、叶片的总DNA为模板，以葡萄上其他常见真菌以及健康的葡萄为对照，通过实时荧光PCR检测荧光强度变化。

试验结果：

以真菌菌丝体或染病葡萄果实、叶片总DNA为模板，通过实时荧光PCR检测可观察到明显的荧光强度(ΔRn)变化，而葡萄上其他常见真菌以及健康的葡萄样本的荧光强度没有变化，结果如图1所示。

实施例5 检测方法的灵敏度实验

用超纯水分别稀释G..Uvicola的DNA，进行相对灵敏度检测，在25μL反应体系中，DNA分别为50ng/μL、5.0ng/μL、0.5ng/μL、0.05ng/μL、0.005ng/μL、0.0005ng/μL和0.00005ng/μL。检测结果如图2所示，最低检测限是0.0005ng/μL。

序列表

<110>中国检验检疫科学研究院

<120>检测葡萄苦腐病菌的引物和探针及其检测方法

<130>KHP09113177.9

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tcgcggctggagaagg 21

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tcgatgccagaaccaagagat 24

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tgccggtggccctgtaaactcttgt 23

Claims

1.一种葡萄苦腐病菌检测用引物，其特征在于其核苷酸序列为：

FP：5’-TCGCGGCTGGAGAAGG-3’

RP：5’-TCGATGCCAGAACCAAGAGAT-3’。

2.含有权利要求1所述引物的试剂盒。

3.一种与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于其核苷酸序列为：5’-TGCCGGTGGCCCTGTAAACTCTTGT-3’，该探针一端标记有报告荧光染料，另一端采用了荧光性的淬灭基团。

4.如权利要求3所述的探针，其特征在于，该探针5’端标记有FAM荧光染料，3’端采用了荧光性的淬灭基团TAMRA。

5.含有权利要求1所述引物以及权利要求3或4所述探针的试剂盒。

6.一种检测葡萄苦腐病菌的方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，利用权利要求1所述的引物以及权利要求3或4所述的探针进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，实时荧光PCR的反应过程中的退火温度为60℃。