CN101671710A - 一种利用固定化酶生产低聚木糖和木糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用固定化酶制备低聚木糖和木糖的方法。本发明所提供的生产低聚木糖和木糖的方法，包括以下步骤：1)将玉米芯用水浸泡后进行汽爆处理，得到汽爆液，调整汽爆液的pH值至6.0－7.0；2)将固定化木聚糖酶和步骤1)的汽爆液在50－80℃条件下反应，得到低聚木糖；将固定化木聚糖酶－木糖苷酶和及步骤1)的汽爆液或桦木聚糖液在50－70℃条件下反应，得到木糖。本发明所提供的生产低聚木糖和木糖的方法具有操作简单、反应条件温和、经济性好、并能显著提高木聚糖酶及木糖苷酶的利用率，以及能降低生产成本等优点。

Description

一种利用固定化酶生产低聚木糖和木糖的方法

技术领域

本发明涉及一种利用固定化酶生产低聚木糖和木糖的方法。

背景技术

低聚木糖又称木寡糖，是指由2-7个木糖，以β-1，4-糖苷键连接而成的低聚糖。因其具有独特的性质而在食品行业及畜牧业中得到广泛应用，近些年来已经在工业生产中得到了可观的经济效益和社会效益。

低聚木糖一般是利用木聚糖酶水解半纤维素得到的。利用固定化木聚糖酶对木聚糖进行水解相关的研究较多，应用特点也各有不同。艾志录等(大孔树脂D380固定化橄榄绿链霉菌E-86来源木聚糖酶的研究，食品与发酵工业，2004(02)：12-24.)选择了有代表性的14种吸附和离子交换树脂进行了橄榄绿链霉菌E-86来源的木聚糖酶固定化试验，确定树脂D380固定化效果较优并研究了其固定化条件，最终获得的固定化酶活力可达64U/g载体。周玉恒等(Eudragit L-100固定球毛壳霉菌木聚糖酶酶学性质的研究，食品科学，2007(03)：198-203.)采用可逆溶解性聚合物Eudragit L-100对球毛壳菌木聚糖酶进行了吸附固定化试验，结果显示，当Eudragit L-100浓度为1.0％时，获得10.6U/mg载体的固定化酶活和88.47％的酶回收率。以上研究多集中于木聚糖酶的固定方面，关于具体应用的研究较少。另外，现有的研究主要是关于木聚糖酶的固定化，对于固定化木聚糖酶-木糖苷酶及其应用的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用固定化酶生产低聚木糖和木糖的方法。

本发明所提供的生产低聚木糖和木糖的方法包括以下步骤：

1)将玉米芯用水浸泡后进行汽爆处理，抽滤得到含有木聚糖溶出物的汽爆液，调整汽爆液的pH值至6.0-7.0；

2)将固定化木聚糖酶和步骤1)的汽爆液在50-80℃条件下反应，得到低聚木糖；将固定化木聚糖酶-木糖苷酶和步骤1)的汽爆液或桦木聚糖溶液在50-70℃条件下反应，得到木糖。

具体的，可将固定化木聚糖酶装柱，在50-80℃条件下，将步骤1)的汽爆液以200mL/h的流速过柱，收集流出液，得到低聚木糖；将固定化木聚糖酶-木糖苷酶装柱，在50-70℃条件下，将步骤1)的玉米芯汽爆液或桦木聚糖溶液以200mL/h的流速过柱，收集流出液，得到木糖。

所述步骤1)中，玉米芯和水的配比为1g玉米芯：(8-20)mL水。所述玉米芯的浸泡时间为8-12h。

所述汽爆处理的条件为165-175℃条件下反应20-40min。

上述方法中，所述固定化木聚糖酶是按照如下方法制备的：

将环氧载体Eupergit C 250L经亚氨基二乙酸活化后，按照100-300U木聚糖酶/g环氧载体Eupergit C 250L的比例加入木聚糖酶，20-50℃固定36-60h，得到固定化木聚糖酶。

所述木聚糖酶和环氧载体Eupergit C 250L的配比优选为200U木聚糖酶：1g环氧载体Eupergit C 250L。所述固定温度优选为25℃。

上述方法中，所述固定化木聚糖酶-木糖苷酶是按照如下方法制备的：

将环氧载体Eupergit C 250L经亚氨基二乙酸活化后，按照100-300U木聚糖酶和20-80U木糖苷酶/g环氧载体Eupergit C 250L的比例加入木聚糖酶和木糖苷酶，20-50℃固定36-60h，得到固定化木聚糖酶-木糖苷酶。

所述木聚糖酶、木糖苷酶和环氧载体Eupergit C 250L的配比优选为200U木聚糖酶和53.2U木糖苷酶：1g环氧载体Eupergit C 250L。所述固定温度优选为25℃。

本发明的另一个目的是提供一种利用固定化酶生产木糖的方法。

本发明的利用固定化酶生产木糖的方法是将固定化木聚糖酶-木糖苷酶和玉米芯汽爆液或桦木聚糖溶液在50-70℃条件下反应，得到木糖。

本发明利用汽爆的方法对玉米芯进行预处理实现半纤维素(木聚糖)和纤维素的分离，然后利用固定化木聚糖酶水解玉米芯汽爆液生产低聚木糖；利用固定化木聚糖酶-木糖苷酶水解玉米芯汽爆液或桦木聚糖溶液生产木糖，有效提高酶的利用效率。本发明所提供的生产低聚木糖和木糖的方法具有操作简单、反应条件温和、经济性好、并能显著提高木聚糖酶及木糖苷酶的利用率，以及能降低生产成本等优点。

附图说明

图1为固定化温度对固定化木聚糖酶得率的影响

图2为固定化木聚糖酶水解玉米芯汽爆液后HPLC法测定水解液中糖的组成

图3为固定化温度对固定化木聚糖酶-木糖苷酶得率的影响

图4为玉米芯汽爆液在反应柱中的流速对水解液中糖成分的影响

图5为桦木聚糖溶液在反应柱中的流速对水解液中糖成分的影响

具体实施方式

下述实施例中所述方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中所述百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、以玉米芯汽爆液为原料制备低聚木糖

1、玉米芯汽爆液的制备

称取100g玉米芯(20-40目)(含木聚糖32.4％)，按1∶8的配比加入800mL蒸馏水，室温浸泡10h后加入高压罐中，加盖密封，加热，待反应温度达到170℃时开始计时，温度控制在170℃左右维持30min后立即打开球型阀，将物料释放到收集罐中。待所收集的物料温度降至60-70℃时进行抽滤，所得滤液即为玉米芯汽爆液。将玉米芯汽爆液冷却至室温后采用地衣酚-盐酸法测定其总糖含量，采用Somogyi方法测定其直接还原糖的含量。结果表明，玉米芯汽爆液中，总糖及直接还原糖的质量百分含量分别为20.1％和17.5％。

用1M的NaOH溶液将汽爆液的pH值调节至6.0，4℃冰箱冷藏备用。

2、固定化木聚糖酶的制备

(1)木聚糖酶酶液的制备

嗜热拟青霉(Paecilomyes thermophila)J18(购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为AS3.6885，参见中国专利：200710063139.0)种子从保存PDA斜面上划线接种于新配制的PDA平板上，然后将平板放置于40-60℃培养箱中静置培养2-8d。

液体发酵培养基：玉米芯粉40g/L，胰蛋白胨10g/L，CaCl₂0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，FeSO₄0.3g/L；121℃灭菌20min，培养基的pH值为7。

液体发酵：从上述嗜热拟青霉J18平板上刮下1cm²大小的嗜热拟青霉菌丝体，接种在装有60mL液体发酵培养基的三角瓶中，在空气浴振荡摇床中，50℃、200rpm振荡培养，培养5d后将发酵液10,000×g冷冻离心10min，上清液即为含有木聚糖酶、β-木糖苷酶的粗酶液。

向上述得到的粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末，使粗酶液中硫酸铵的饱和度达到40％，冰浴条件下搅拌1h，10,000×g离心10min，将沉淀用0.05mol/L、pH 6.0的柠檬酸缓冲液溶解，得到的溶解液即为木聚糖酶酶液。

采用DNS法测定上述获得的木聚糖酶酶液中木聚糖酶的活力，具体测定方法如下：取0.1mL上述获得的木聚糖酶酶液，加入到0.9mL用0.05mol/L、pH 6.0的柠檬酸缓冲液配制的1％(质量百分含量)桦木木聚糖(Sigma公司，美国)溶液中，50℃反应10min；DNS(3，5-二硝基水杨酸)显色法测定所产生的木糖的量。将50℃条件下，每分钟生成1μmol木糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

根据上述测定结果，将上述获得的木聚糖酶酶液调至待固定酶液中木聚糖酶的酶活为400U/mL，木糖苷酶的酶活小于0.2U/mL。

(2)环氧载体的制备

称取40g Eupergit C 250L(多孔丙烯酸微球，孔径100nm，德国Rohm Pharma公司产品)，加入80mL硼酸钠-亚氨基二乙酸(IDA)缓冲液(硼酸钠浓度为0.1M，亚氨基二乙酸浓度为2M，氢氧化钠调pH至8.5)，于25℃水浴摇床中反应2h，摇床转速为150rpm(旋转半径26mm)。玻璃砂芯漏斗过滤后，用蒸馏水冲洗三次，得到40g经亚氨基二乙酸活化的EupergitC 250L。

(3)固定化木聚糖酶的制备

将上述步骤(2)获得的40g活化的Eupergit C 250L悬浮于200mL上述步骤(1)制备木聚糖酶酶液中(酶活添加总量8,000U，每克固定载体对应酶活添加量200U)，150rpm(旋转半径26mm)，分别于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和50℃的水浴摇床中反应48h后用玻璃砂芯漏斗真空抽滤，200mL柠檬酸缓冲液(pH 6.0，50mM)冲洗三次，得到固定有不同量木聚糖酶的Eupergit C 250L固定化木聚糖酶。

测定上述得到的固定有木聚糖酶的Eupergit C 250L中固定化木聚糖酶的活力和滤液中木聚糖酶的活力，计算酶固定化得率(固定酶活×100％/酶活添加量)，以确定固定化温度对酶固定化得率的影响，结果如图1所示。

从图1可以看出，在20-40℃时，木聚糖酶的酶固定化得率较高，在25℃时，酶固定化得率基本达到最大值。

将上述步骤(2)获得的40g活化的Eupergit C 250L悬浮于100、200和300mL上述步骤(1)制备的木聚糖酶酶液中(酶活添加总量分别为4,000、8,000、12,000U，每克载体对应酶活总添加量100、200、300U)，150rpm(旋转半径26mm)、25℃水浴摇床中反应48h后用玻璃砂芯漏斗真空抽滤，200mL柠檬酸缓冲液(pH6.0，50mM)冲洗三次，得到固定有不同量木聚糖酶的Eupergit C 250L固定化木聚糖酶。

分别测定上述得到的固定有不同量木聚糖酶的Eupergit C 250L固定化木聚糖酶的活力和滤液中木聚糖酶的活力，计算酶固定化得率(固定的总酶活×100％/酶活总添加量)，以确定木聚糖酶加酶量对酶固定化得率的影响，结果如表1所示。

表1木聚糖酶加酶量(每克载体)对酶固定化得率的影响

综合考虑酶固定化得率和酶载量，由表1中的数据可以看出，当每克固定载体对应木聚糖酶酶活添加量为200U时，酶固定化得率和酶载量较好，此时固定化木聚糖酶的酶活为52.7U/g，以下实验均采用酶活为52.7U/g的固定化木聚糖酶进行。

3、固定化木聚糖酶水解玉米芯汽爆液制备低聚木糖

在内径为12mm的不锈钢夹套层析柱中加入40g上述步骤2制备的酶活为52.7U/g的固定化木聚糖酶，使柱床高度为30cm。连接蠕动泵和部分收集器，用50mMpH 6.0的柠檬酸缓冲液平衡30min，反应柱床温度设定为60℃。将上述步骤1制备的玉米芯汽爆液利用蠕动泵泵入层析柱中，调节玉米芯汽爆液的流速为200mL/h，酶解反应2h后得到400mL水解液，TLC分析水解液中糖的组成，Somogyi法测定水解液中直接还原糖的含量，计算玉米芯汽爆液中木聚糖的水解率以及固定化木聚糖酶的生产效率。

实验重复三次。以下实验结果为三次重复实验的平均值。

结果表明，由步骤1制备的玉米芯汽爆液得到的400mL水解液中直接还原糖(低聚木糖)的质量百分含量为17.5％。

固定化木聚糖酶水解玉米芯汽爆液后得到的反应液中低聚糖的组成采用HPLC法进行测定，具体条件为：色谱柱：COSMOSIL/COSMOGEL；流动相：75％体积百分含量乙腈/25％体积百分含量水；流速：1mL/min；进样量：10μL；柱温：35℃。水解液中糖的组成如图2和表2所示。

表2固定化木聚糖酶水解玉米芯汽爆液的糖组成

结果表明，水解液中木二糖和木三糖占总糖的比例达73.1％。

实施例2、以玉米芯汽爆液为原料制备木糖

1、玉米芯汽爆液的制备

具体制备方法参见实施例1步骤2。

2、固定化木聚糖酶-木糖苷酶的制备

(1)待固定酶液的制备

嗜热拟青霉(Paecilomyes thermophila)J18种子从保存PDA斜面上划线接种于新配制的PDA平板上，然后将平板放置于40-60℃培养箱中静置培养2-8d。

液体发酵培养基：玉米芯粉碳源40g/L，胰蛋白胨10g/L，CaCl₂0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，FeSO₄0.3g/L；121℃灭菌20min，培养基的pH值为7。

液体发酵：从上述嗜热拟青霉J18平板上刮下1cm²大小的嗜热拟青霉菌丝体，接种在装有60mL液体发酵培养基的三角瓶中，在空气浴振荡摇床中，50℃、200rpm振荡培养，培养5d后将发酵液10,000×g冷冻离心10min，上清液即为含有木聚糖酶、β-木糖苷酶的粗酶液。

向上述得到的粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末，首先使粗酶液中硫酸铵的饱和度达到40％，冰浴条件下搅拌1h，10,000×g离心10min，取上清液。向上清液中继续缓慢加入硫酸铵粉末使硫酸铵饱和度达到60％，同样冰浴条件下搅拌1h，10,000×g离心10min，将沉淀用0.05mol/L、pH 6.0的柠檬酸缓冲液溶解，得到的溶解液即为含有木聚糖酶和木糖苷酶的酶液。

木聚糖酶的活力方法同上述实施例1。

β-木糖苷酶的活力按照Lacke(Methods Enzymol，1988，160：679-684)的方法进行测定，具体过程如下：取50μL上述获得的酶液，加入到200μL用50mM pH 6.5的磷酸缓冲液配制的5mM的pNP-Xylocopyranoside中，50℃反应10min后，加入1M Na₂CO₃溶液终止反应，410nm处测定吸光值。将50℃条件下，每分钟生成1μmol pNP所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

根据上述测定结果，将上述获得的酶液调至待固定酶液中木聚糖酶的酶活为400U/mL，木糖苷酶的酶活为106.4U/mL，进行下一步的固定化。

(2)环氧载体的制备

具体制备方法参见实施例1步骤2。

(3)固定化木聚糖酶-木糖苷酶的制备

将上述步骤(2)获得的40g活化的Eupergit C 250L悬浮于200mL上述步骤(1)制备的含有木聚糖酶和木糖苷酶的酶液中(酶活添加总量木聚糖酶8,000U，木糖苷酶2128U；即每克载体对应酶活添加量木聚糖酶200U，木糖苷酶53.2U)，150rpm(旋转半径26mm)，分别于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和50℃的水浴摇床中反应48h后用玻璃砂芯漏斗真空抽滤，200mL柠檬酸缓冲液(pH 6.0，50mM)冲洗三次，得到固定有木聚糖酶和木糖苷酶的Eupergit C 250L固定化木聚糖酶-木糖苷酶。

测定上述得到的固定有木聚糖酶和木糖苷酶的Eupergit C 250L固定化木聚糖酶-木糖苷酶的活力和滤液中木聚糖酶和木糖苷酶的活力，计算酶固定化得率(固定酶活×100％/酶活添加量)，以确定固定化温度对酶固定化得率的影响，结果如图3所示。

由图3可以看出，在20-40℃时，木聚糖酶酶固定化得率较高，在25℃时酶固定化得率基本达到最大值；而在20-30℃时，木糖苷酶酶固定化得率较高，在25℃时酶固定化得率同样达到最大值。因此选用25℃作为固定化温度。

将上述步骤(2)获得的40g活化的Eupergit C 250L分别悬浮于100、200和300mL上述步骤(1)制备的含有木聚糖酶和木糖苷酶的酶液中(酶活添加总量木聚糖酶4,000、8,000、1,2000U，木糖苷酶1064、2128、3192U；即每克载体对应酶活添加量：木聚糖酶100、200、300U，木糖苷酶26.6、53.2、79.8U)，150rpm、25℃水浴摇床中反应48h后用玻璃砂芯漏斗真空抽滤，200mL柠檬酸缓冲液(pH6.0，50mM)冲洗三次，得到Eupergit C 250L固定化木聚糖酶-木糖苷酶。

分别测定上述得到的固定有木聚糖酶和木糖苷酶的Eupergit C 250L固定化木聚糖酶-木糖苷酶的活力和滤液中木聚糖酶和木糖苷酶的活力，计算酶固定化得率(固定酶活×100％/酶活添加量)，以确定木聚糖酶和木糖苷酶的加酶量对酶固定化得率的影响，结果如表3所示。

表3木聚糖酶和木糖苷酶加酶量(每克载体)对酶固定化得率的影响

结果表明，当每克固定载体对应酶活总添加量为木聚糖酶200U、木糖苷酶53.2U时，酶固定化得率及酶载量较好，此时固定化木聚糖酶-木糖苷酶中，木聚糖酶的酶活为53.9U/g，木糖苷酶的酶活为34.5U/g，以下的实验均采用木聚糖酶的酶活为53.9U/g、木糖苷酶的酶活为34.5U/g的固定化木聚糖酶-木糖苷酶进行。

3、用固定化木聚糖酶-木糖苷酶水解玉米芯汽爆液制备木糖

在内径为12mm的不锈钢夹套层析柱中加入40g上述步骤1制备的木聚糖酶的酶活为53.9U/g、木糖苷酶的酶活为34.5U/g的固定化木聚糖酶-木糖苷酶，使柱床高度为30cm。连接蠕动泵和部分收集器，用50mM pH 6.0的柠檬酸缓冲液平衡30min，反应柱床温度设定为60℃。将400mL玉米芯汽爆液利用蠕动泵泵入层析柱中，调节流速分别为200、300、400、500mL/h，酶解反应2h后得到400mL水解液，TLC分析水解液中糖的组成，HPLC法测定水解液中木糖的含量，计算水解液中木糖的含量。

实验重复三次。以下实验结果为三次重复实验的平均值。

玉米芯汽爆液在反应柱中流速对水解液中糖成分的影响如图4所示。从图4中可以看出，当玉米芯汽爆液在反应柱中流速为200-300mL/h时，水解产物主要是以木糖为主，水解液中木糖占总糖的比例达80％左右。

实施例3、以桦木聚糖溶液为原料制备木糖

1、固定化木聚糖酶-木糖苷酶的制备

具体制备方法同实施例2。以下的实验均采用木聚糖酶的酶活为53.9U/g、木糖苷酶的酶活为34.5U/g的固定化木聚糖酶-木糖苷酶进行。

2、用固定化木聚糖酶-木糖苷酶水解桦木聚糖溶液制备木糖

在内径为12mm的不锈钢夹套层析柱中加入40g上述步骤1制备的木聚糖酶的酶活为53.9U/g、木糖苷酶的酶活为34.5U/g的固定化木聚糖酶-木糖苷酶，使柱床高度为30cm。连接蠕动泵和部分收集器，用50mM pH 6.0的柠檬酸缓冲液平衡30min，反应柱床温度设定为60℃。将400mL 2％(质量百分含量)的桦木聚糖(Sigma公司，美国)利用蠕动泵泵入层析柱中，调节桦木聚糖溶液的流速为200mL/h，酶解反应2h后得到400mL水解液，TLC分析水解液中糖的组成，HPLC法测定水解液中木糖的含量，计算水解液中木糖的含量。

实验重复三次。以下实验结果为三次重复实验的平均值。

桦木聚糖溶液在反应柱中流速对水解液中糖成分的影响如图5所示。其中，M分别为木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖标准品的检测结果；1表示桦木聚糖溶液在反应柱中流速为500mL/h时的检测结果；2表示桦木聚糖溶液在反应柱中流速为200mL/h时的检测结果。从图5中可以看出，当桦木聚糖溶液在反应柱中流速为200mL/h时，水解产物主要是以木糖为主，水解液中木糖占总糖的比例达90％以上。

Claims (9)

1、一种利用固定化酶生产低聚木糖和木糖的方法，包括以下步骤：

1)将玉米芯用水浸泡后进行汽爆处理，得到汽爆液，调整汽爆液的pH值至6.0-7.0；

2)将固定化木聚糖酶和步骤1)的汽爆液在50-80℃条件下反应，得到低聚木糖；将固定化木聚糖酶-木糖苷酶和步骤1)的汽爆液在50-70℃条件下反应，得到木糖。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，将固定化木聚糖酶装柱，在50-80℃条件下，将步骤1)的汽爆液以200-500mL/h的流速过柱，收集流出液，得到低聚木糖；将固定化木聚糖酶-木糖苷酶装柱，在50-70℃条件下，将步骤1)的汽爆液以200-500mL/h的流速过柱，收集流出液，得到木糖。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述汽爆液以200mL/h的流速过柱。

4、根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述固定化木聚糖酶是按照如下方法制备的：

将环氧载体Eupergit C 250L经亚氨基二乙酸活化后，按照100-300U木聚糖酶/g环氧载体Eupergit C 250L的比例加入木聚糖酶，20-50℃固定36-60h，得到固定化木聚糖酶。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：环氧载体Eupergit C 250L经亚氨基二乙酸活化后，按照200U木聚糖酶/g环氧载体Eupergit C 250L的比例加入木聚糖酶，25℃固定36-60h，得到固定化木聚糖酶。

6、根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述固定化木聚糖酶-木糖苷酶是按照如下方法制备的：

将环氧载体Eupergit C 250L经亚氨基二乙酸活化后，按照100-300U木聚糖酶和20-80U木糖苷酶/g环氧载体Eupergit C 250L的比例加入木聚糖酶和木糖苷酶，20-50℃固定36-60h，得到固定化木聚糖酶-木糖苷酶。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：环氧载体Eupergit C 250L经亚氨基二乙酸活化后，按照200U木聚糖酶和53.2U木糖苷酶/g环氧载体Eupergit C250L的比例加入木聚糖酶和木糖苷酶，25℃固定36-60h，得到固定化木聚糖酶-木糖苷酶。

8、一种利用固定化酶生产木糖的方法，是将固定化木聚糖酶-木糖苷酶和桦木聚糖在50-70℃条件下反应，得到木糖。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述固定化木聚糖酶-木糖苷酶装柱，50-70℃条件下，将质量百分含量为2％的桦木聚糖溶液以200-500mL/h的流速过柱，收集流出液，得到木糖。

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