CN101671665A - 一种制备电纺纤维膜固定化漆酶的方法 - Google Patents

一种制备电纺纤维膜固定化漆酶的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101671665A
CN101671665A CN200910180625A CN200910180625A CN101671665A CN 101671665 A CN101671665 A CN 101671665A CN 200910180625 A CN200910180625 A CN 200910180625A CN 200910180625 A CN200910180625 A CN 200910180625A CN 101671665 A CN101671665 A CN 101671665A
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzyme
fiber membrane
electrospun fiber
laccase
carrying
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN200910180625A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101671665B (zh
Inventor
牛军峰
代云容
刘佳
殷立峰
沈珍瑶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Normal University
Original Assignee
Beijing Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Normal University filed Critical Beijing Normal University
Priority to CN200910180625XA priority Critical patent/CN101671665B/zh
Publication of CN101671665A publication Critical patent/CN101671665A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101671665B publication Critical patent/CN101671665B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)

Abstract

本发明属于酶固定化领域，具体是涉及一种利用乳液静电纺丝技术制备电纺纤维膜固定化漆酶的方法。该方法是通过乳液电纺技术将漆酶原位包埋固定在电纺纤维中，其固定化漆酶的载体材料是具有良好生物相容性的聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3，即合成时聚乳酸与聚己内酯用量比例为7∶3)。具体包括两个步骤：载酶电纺纤维膜的制备及对其进行交联固定。载酶电纺纤维膜的制备是先将聚合物溶液和漆酶溶液配制成均质的乳液，然后将乳液进行静电纺丝，几小时后可收获载酶电纺纤维膜。对载酶电纺纤维膜进行交联固定是将膜暴露于戊二醛饱和蒸气中交联后即得到电纺纤维膜固定化漆酶。本发明提供了一种新的简单高效的制备固定化漆酶的方法，该方法所得的固定化漆酶催化活性高、稳定性好，且制备成本低廉。

Description

一种制备电纺纤维膜固定化漆酶的方法
技术领域
本发明属于酶固定化领域，具体为一种利用乳液静电纺丝技术制备聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)电纺纤维膜固定化漆酶的方法。
背景技术
漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，1883年由日本学者从紫胶漆树的分泌物中发现。随着研究的深入，人们证实许多生物，包括高等植物、微生物(主要是真菌，部分是细菌)以及昆虫的体内都存在着漆酶。漆酶一般含有4个铜离子，根据光谱和磁性特征可将其分为三类：I型Cu2+和II型Cu2+各一个，是单电子受体，呈顺磁性；III型Cu4+两个，是双电子受体，呈反磁性。I型Cu2+呈蓝色，在614nm处有特征吸收峰；II型Cu2+非蓝色，无特征吸收光谱；III型Cu4+是偶合的离子对(Cu2+-Cu2+)，在330nm处有宽的吸收带。这4个铜离子处于漆酶的活性部位，在氧化反应中起决定作用。漆酶的氧化能力较强，并且作用的底物相当宽泛，其中包括多环芳烃、氯酚、多氯联苯及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、甾体激素、除草剂、杀虫剂、染料等多种难降解的有机物。漆酶具有的优良特性为水体中有机污染物的降解提供了有效的途径，该方法具有条件温和、操作简单、对环境无污染等优点，在废水处理、生物漂白和生物传感器构建等方面有着巨大的应用前景。但由于游离漆酶易受环境条件影响而失活，难以实现重复利用且不能长期贮存，在实际应用中受到很大的限制。
20世纪50年代兴起的酶固定化技术实现了漆酶应用手段的创新。固定化漆酶不仅是改善漆酶重复利用性和稳定性的有效手段，且在降低成本，保护环境，生产自动化、连续化等许多方面都十分有利，它为漆酶的应用开拓了广阔的前景。固定化漆酶的性能主要取决于固定化时所使用的载体材料的性质。理想的载体材料应具备良好的机械强度、热稳定性和化学稳定性、耐生物降解性及对酶的高度亲和性、并能保持较高的酶活性等。近年来各界学者对漆酶的固定化进行了广泛的研究，采用的固定化载体包括明胶、磁性微球、活性炭、壳聚糖、高分子聚合物和亲水性微滤膜等多种材料。其中高分子聚合物材料因为抗微生物性能良好，机械强度大，且有相当的价格优势，所以用其研制漆酶固定化载体的前景看好。
静电纺丝纳米纤维膜就是一种以高分子聚合物为原料，利用静电纺丝技术制备而成的载体，具体是由聚合物溶液或熔体借助于高压静电作用进行喷射拉伸而形成超细纤维组成。因为静电纺丝纳米纤维膜具有孔隙率高、比表面积大、均一性好且制备简单等优点，它被人们认为是一种潜在的酶固定化基质。将其作为固定化酶的载体，有利于酶与底物充分接触，能有效提高酶的催化效率，且容易从反应体系中分离回收。但目前关于静电纺丝纤维膜固定化酶的研究主要集中在后固定酶方面，即先制备纤维膜，然后再用一些方法将酶固定在原膜或者修饰过的膜表面上。在这种情形下，尽管纤维膜有较大的比表面积，但酶只能单层固定在纤维膜表面，酶载量相对较低，且反应过程中酶脱落严重，导致酶重复利用性差；如果直接通过化学交联方法提高酶载量，酶活性会受到较大影响。
乳液电纺是静电纺丝技术的一个新的分支，因其能够通过直接电纺油-水或者水-油乳液制备壳-核结构药物纳米纤维而受到人们的关注。此外，乳液静电纺丝技术设备简单，反应条件温和，易于操作，且成本低廉，是一种经济高效的制备载药物纳米纤维的方法。但目前还未见有利用该方法固定化漆酶的研究。聚乳酸-聚己内酯共聚物是一种生物相容性良好且可生物降解的高分子材料，它在自然界中可逐渐完全降解为二氧化碳和水，并不会对环境造成二次污染，是一种环境友好材料。这种乳液电纺技术和环境友好材料的结合，为漆酶固定化技术提供了一种新的思路，有着广阔的发展前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单高效的固定化漆酶的制备方法，即利用乳液静电纺丝技术将漆酶原位包埋固定在聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3，即合成时聚乳酸与聚己内酯用量比例为7∶3)电纺纤维中的方法。本发明的另一个目的是提供一种新型的载酶量高、稳定性好、催化活性高，且生产成本低廉的电纺纤维膜固定化漆酶。
本发明的技术方案是：
本发明提供的电纺纤维膜固定化漆酶是以具有良好生物相容性的高分子量聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)为载体材料，通过电纺聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)/聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108/二氯甲烷溶液和漆酶水溶液混合形成的乳液，将漆酶原位包埋固定在聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)电纺纤维中，并对载酶电纺纤维膜进行交联固定。该电纺纤维膜固定化漆酶的制备方法包括两个步骤：载酶电纺纤维膜的制备及对其进行交联固定。
其中载酶电纺纤维膜的制备步骤包括：
1)将分子量为10万的聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3，即聚乳酸与聚己内酯合成比例为7∶3)颗粒溶于二氯甲烷中，加入嵌段共聚物表面活性剂，均匀混合后搅拌2小时得到共聚物混合凝胶；
2)称取10毫克杂色云芝漆酶溶于1毫升pH值为3.5的磷酸盐缓冲溶液中，震荡摇匀至全部溶解；
3)取步骤2)中所得漆酶溶液或者经过荧光素异硫氰酸酯标记的浓度为10毫克/毫升的漆酶溶液加入共聚物混合凝胶中，在旋涡混合器上混合20分钟直至形成均质乳液；
4)将步骤3)中所得乳液引入到高压静电纺丝装置中，调节各参数以获得稳定连续的喷射。纺丝全程中均用红外灯照射，以使二氯甲烷完全挥发；
5)在接收板的铝箔上收集电纺纤维膜，4～5小时后待纤维膜厚度达到0.5～1毫米，停止纺丝。所得载酶纤维膜储存在4℃下备用；
对载酶电纺纤维膜进行交联固定步骤包括：
1)将所得载酶纤维膜剪成2×2厘米小方块，将其暴露于戊二醛水溶液饱和蒸气中，在35℃条件下交联；
2)取出交联后载酶纤维膜以pH值为3.5的磷酸缓冲溶液反复冲洗，直至淋洗液中没有游离酶，即得电纺纤维膜固定化漆酶，并将其储存在4℃下备用。
本发明方法中，其中载酶电纺纤维膜的制备步骤1)中所述的嵌段共聚物表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108，其分子式为PEO132-PPO50-PEO132，分子量为15500克/摩尔。
本发明中聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)质量浓度为4％～6％，加入的嵌段共聚物F108的用量为聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)质量的10％。
本发明提供的利用乳液静电纺丝技术制备聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)电纺纤维固定化漆酶方法具有如下优点：
1.固定化载体聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)生物相容性好，用于酶固定化可以有效保护酶活性，且用于环境污染物降解领域不会引入二次污染。
2.嵌段共聚物表面活性剂可显著降低混合凝胶的表面张力，有利于形成均质乳液；同时提高了纤维膜整体的亲水性，对保持酶活性和稳定性起到重要作用。
3.以乳液静电纺丝技术制备载酶纤维膜，方法操作简单，条件温和，成本低，特别利于快速安置。
4.所制得的电纺纤维膜固定化漆酶载酶量高，酶活保持较好，且稳定性和重复利用性好，可降低经济成本。
附图说明
图1为载酶聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)电纺纤维膜在不同放大倍数下的扫描电子显微镜图像；其中，图1a)为载酶聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)电纺纤维膜放大1000倍扫描电子显微镜图像；图1b)为载酶聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)电纺纤维膜放大5000倍扫描电子显微镜图像；
图2为载酶聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)电纺纤维膜的激光共聚焦图像。
具体实施方式
本发明提供的利用乳液静电纺丝技术制备电纺纤维膜固定化漆酶的方法包括两个步骤：载酶电纺纤维膜的制备及对其进行交联固定。
载酶电纺纤维膜的制备步骤包括：
1)将分子量为10万的聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)颗粒溶于二氯甲烷中，加入嵌段共聚物表面活性剂F108，均匀混合后搅拌2小时得到共聚物混合凝胶，其中嵌段共聚物F108的用量为聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)重量的10％；
2)称取10毫克杂色云芝漆酶溶于1毫升pH值为3.5的磷酸盐缓冲溶液中，震荡摇匀至全部溶解。为使用激光共聚焦扫描显微镜观察漆酶在电纺纤维中的分布，实验中用于制备观察纤维膜形态的样品时均采用经过荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的浓度为10毫克/毫升的漆酶溶液；
3)取步骤2)中所得漆酶溶液加入共聚物混合凝胶中，在旋涡混合器上混合20分钟直至形成均质乳液，其中酶液与混合凝胶的体积比为0.8％～1.2％；
4)高压静电纺丝设备由直流高压电源、喷丝头和接收装置组成。将步骤3)中所得乳液引入到高压静电纺丝装置中，调节电源电压为9～12千伏，接收距离为14厘米，以获得稳定连续的喷射。纺丝全程中均用红外灯照射，以使二氯甲烷完全挥发；
5)在接收板的铝箔上收集电纺纤维膜，4～5小时后待纤维膜厚度达到0.5～1毫米，停止纺丝。所得载酶纤维膜储存在4℃下备用。
对载酶电纺纤维膜进行交联固定步骤包括：
1)将所得载酶纤维膜剪成2×2厘米小方块，将其暴露于质量浓度为25％的戊二醛水溶液饱和蒸气中，在35℃条件下交联1小时；
2)取出交联后载酶纤维膜以pH值为3.5的磷酸缓冲溶液反复冲洗，直至淋洗液中没有游离酶，即得电纺纤维膜固定化漆酶，并将其储存在4℃下备用。
在上述步骤中，聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)质量浓度为4％～6％，加入的嵌段共聚物F108的用量为聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)质量的10％。
本发明中，所使用的漆酶是本技术领域人员所熟悉的，可以通过试剂供应商获得，也可以通过较常规的微生物发酵获得，如可以取自杂色云芝(Polystictus versicolor)、白腐真菌(Trametes gallica)、佛罗里达侧耳(Pleurotus florida)等微生物的分泌物。
本发明中，所使用的高压静电纺丝装置为本领域公知的高压静电纺丝装置，其通常由高压直流电源、喷丝头和接收装置构成，所用部件如高压直流电源、注射器喷丝头和金属板等都可以通过相应设备供应商获得。
本发明方法中，所用的嵌段共聚物表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108，其分子式为PEO132-PPO50-PEO132，分子量为15500克/摩尔。
本发明在聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)体系中引入嵌段共聚物表面活性剂，可显著降低混合凝胶的表面张力，有利于形成均质乳液；同时也可以减小电纺纤维膜的接触角，提高浸润性，对保护酶活性起到重要作用。
本发明提供的聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)电纺纤维膜固定化漆酶的活性测试以2，2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)为底物。具体测定方法为在室温下取5片2×2厘米交联后的载酶电纺纤维膜(约20～30毫克)，然后将其加入到5毫升浓度为0.5毫摩尔/升ABTS水溶液中，持续震荡反应5分钟后，取反应液在紫外-可见分光光度计(Perkins-Elmer)上测量波长为420纳米处的吸光度值，然后根据酶活力定义计算酶活力。
本发明中，游离漆酶酶活测定方法如下：
在室温下取2.9毫升浓度为0.5毫摩尔/升ABTS水溶液，然后加入0.1毫升稀释后的酶液，在紫外-可见分光光度计(Perkins-Elmer)上测试反应3分钟时在420纳米下的吸光度值，然后根据酶活力定义计算酶活力。漆酶活性回收率(％)＝(固定化漆酶酶活/用于固定化的游离漆酶酶活)×100％。
实施例1
0.6克聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)溶解于12克二氯甲烷中，再加入0.06克嵌段共聚物表面活性剂F108，均匀混合后搅拌2小时得到共聚物混合凝胶。称取10毫克杂色云芝漆酶溶于1毫升pH值为3.5的磷酸盐缓冲溶液中，震荡摇匀至全部溶解。取0.1毫升上述漆酶溶液或经过荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的浓度为10毫克/毫升的漆酶溶液加入共聚物混合凝胶中，在旋涡混合器上混合20分钟直至形成均质乳液。然后将乳液引入高压静电纺丝装置待纺。调节高压电源电压为10千伏，接收距离为14厘米，获得稳定连续的喷射流，并在覆盖有铝箔纸的接收板上收集纤维产品。纺丝全程中均用红外灯照射，以使二氯甲烷完全挥发。4～5小时后待纤维膜厚度达到0.5～1毫米，停止纺丝，即得到载酶聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)电纺纤维膜。将载酶聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)电纺纤维膜在场发射扫描电子显微镜(FESEM S-4800场发射扫描电子显微镜，日立公司)下进行纤维形貌表征，其纤维呈现出珠线结构，大多直径为几百纳米的纤维上串有直径为几微米的珠泡，珠泡表面光滑。在激光共聚焦扫描显微镜(LSM510激光共聚焦扫描显微镜，德国蔡司)下观察漆酶在纤维中的分布，发现纤维上的多数珠泡内部发出绿色荧光，少数纤维中也呈现出绿色荧光。这表明多数漆酶分布在纤维上的珠泡内部，也有部分分布在纤维中。
将所得载酶纤维膜剪成2×2厘米小方块，将其暴露于10毫升质量浓度为25％的戊二醛水溶液饱和蒸气中，在35℃条件下交联1小时。然后取出交联后载酶纤维膜以pH值为3.5的磷酸缓冲溶液反复冲洗，直至淋洗液中没有游离酶，即得电纺纤维膜固定化漆酶样品(1#)，并储存在4℃下备用。该样品的酶活性回收率为54.6％。
实施例2
0.6克聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)溶解于12克二氯甲烷中，再加入0.06克嵌段共聚物表面活性剂F108，均匀混合后搅拌2小时得到共聚物混合凝胶。称取10毫克杂色云芝漆酶溶于1毫升pH值为3.5的磷酸盐缓冲溶液中，震荡摇匀至全部溶解。取0.15毫升上述漆酶溶液或经过荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的浓度为10毫克/毫升的漆酶溶液加入共聚物混合凝胶中，在旋涡混合器上混合20分钟直至形成均质乳液。然后将乳液引入高压静电纺丝装置待纺。调节高压电源电压为11千伏，接收距离为14厘米，获得稳定连续的喷射流，并在覆盖有铝箔纸的接收板上收集纤维产品。纺丝全程中均用红外灯照射，以使二氯甲烷完全挥发。4～5小时后待纤维膜厚度达到0.5～1毫米，停止纺丝，即得到载酶聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)电纺纤维膜。将载酶聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)电纺纤维膜在场发射扫描电子显微镜(FESEM S-4800场发射扫描电子显微镜，日立公司)下进行纤维形貌表征，其纤维呈现出珠线结构，大多直径为几百纳米的纤维上串有直径为几微米的珠泡，珠泡表面光滑。与实施例1结果相比，纤维上的珠泡略有增多。在激光共聚焦扫描显微镜(LSM510激光共聚焦扫描显微镜，德国蔡司)下观察漆酶在纤维中的分布，发现纤维上的多数珠泡内部发出绿色荧光，少数纤维中也呈现出绿色荧光。这表明多数漆酶分布在纤维上的珠泡内部，也有部分分布在纤维中。
载酶电纺纤维膜进行交联固定方法同实施例1(2#)。该样品的酶活性回收率为82.8％。
实施例3
0.6克聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)溶解于10克二氯甲烷中，再加入0.06克嵌段共聚物表面活性剂F108，均匀混合后搅拌2小时得到共聚物混合凝胶。称取10毫克杂色云芝漆酶溶于1毫升pH值为3.5的磷酸盐缓冲溶液中，震荡摇匀至全部溶解。取0.1毫升上述漆酶溶液或经过荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的浓度为10毫克/毫升的漆酶溶液加入共聚物混合凝胶中，在旋涡混合器上混合20分钟直至形成均质乳液。然后将乳液引入高压静电纺丝装置待纺。调节高压电源电压为9千伏，接收距离为14厘米，获得稳定连续的喷射流，并在覆盖有铝箔纸的接收板上收集纤维产品。纺丝全程中均用红外灯照射，以使二氯甲烷完全挥发。4～5小时后待纤维膜厚度达到0.5～1毫米，停止纺丝，即得到载酶聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)电纺纤维膜。将载酶聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)电纺纤维膜在场发射扫描电子显微镜(FESEM S-4800场发射扫描电子显微镜，日立公司)下进行纤维形貌表征，其纤维呈现出珠线结构，大多直径为几百纳米的纤维上串有直径为几微米的珠泡，珠泡表面光滑。与实施例1结果相比，纤维上的珠泡略有减少。在激光共聚焦扫描显微镜(LSM510激光共聚焦扫描显微镜，德国蔡司)下观察漆酶在纤维中的分布，发现纤维上的多数珠泡内部发出绿色荧光，少数纤维中也呈现出绿色荧光。这表明多数漆酶分布在纤维上的珠泡内部，也有部分分布在纤维中。
载酶电纺纤维膜进行交联固定方法同实施例1(3#)。该样品的酶活性回收率为68.2％。
实施例4
0.6克聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)溶解于15克二氯甲烷中，再加入0.06克嵌段共聚物表面活性剂F108，均匀混合后搅拌2小时得到共聚物混合凝胶。称取10毫克杂色云芝漆酶溶于1毫升pH值为3.5的磷酸盐缓冲溶液中，震荡摇匀至全部溶解。取0.15毫升上述漆酶溶液或经过荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的浓度为10毫克/毫升的漆酶溶液加入共聚物混合凝胶中，在旋涡混合器上混合20分钟直至形成均质乳液。然后将乳液引入高压静电纺丝装置待纺。调节高压电源电压为12千伏，接收距离为14厘米，获得稳定连续的喷射流，并在覆盖有铝箔纸的接收板上收集纤维产品。纺丝全程中均用红外灯照射，以使二氯甲烷完全挥发。4～5小时后待纤维膜厚度达到0.5～1毫米，停止纺丝，即得到载酶聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)电纺纤维膜。将载酶聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)电纺纤维膜在场发射扫描电子显微镜(FESEM S-4800场发射扫描电子显微镜，日立公司)下进行纤维形貌表征，其纤维呈现出珠线结构，大多直径为几百纳米的纤维上串有直径为几微米的珠泡，珠泡表面光滑。与实施例1结果相比，纤维上的珠泡明显增多。在激光共聚焦扫描显微镜(LSM510激光共聚焦扫描显微镜，德国蔡司)下观察漆酶在纤维中的分布，发现纤维上的多数珠泡内部发出绿色荧光，少数纤维中也呈现出绿色荧光。这表明多数漆酶分布在纤维上的珠泡内部，也有部分分布在纤维中。
载酶电纺纤维膜进行交联固定方法同实施例1(4#)。该样品的酶活性回收率为53.8％。

Claims (8)

1.一种制备电纺纤维膜固定化漆酶的方法，该方法包括两个步骤：载酶电纺纤维膜的制备及对其进行交联固定；
其中载酶电纺纤维膜的制备步骤包括：
1)将分子量为10万的聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3，即合成时聚乳酸与聚己内酯用量比例为7∶3)颗粒溶于二氯甲烷中，加入嵌段共聚物表面活性剂，均匀混合后搅拌2小时得到共聚物混合凝胶；
2)称取10毫克杂色云芝漆酶溶于1毫升pH值为3.5的磷酸盐缓冲溶液中，震荡摇匀至全部溶解；
3)取步骤2)中所得漆酶溶液或者经过荧光素异硫氰酸酯标记的浓度为10毫克/毫升的漆酶溶液加入共聚物混合凝胶中，在旋涡混合器上混合20分钟直至形成均质乳液；
4)将步骤3)中所得乳液引入到高压静电纺丝装置中，调节各参数以获得稳定连续的喷射。纺丝全程中均用红外灯照射，以使二氯甲烷完全挥发；
5)在接收板的铝箔上收集电纺纤维膜，4～5小时后待纤维膜厚度达到0.5～1毫米，停止纺丝。所得载酶纤维膜储存在4℃下备用；
对载酶电纺纤维膜进行交联固定步骤包括：
1)将所得载酶纤维膜剪成2×2厘米小方块，将其暴露于戊二醛水溶液饱和蒸气中，在35℃条件下交联；
2)取出交联后载酶纤维膜以pH值为3.5的磷酸缓冲溶液反复冲洗，直至淋洗液中没有游离酶，即得电纺纤维膜固定化漆酶，并将其储存在4℃下备用。
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：载酶电纺纤维膜的制备步骤1)中所述的表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108，其分子式为PEO132-PPO50-PEO132，分子量为15500克/摩尔。
3.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：载酶电纺纤维膜的制备步骤1)中聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)的质量浓度为4％～6％。
4.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：载酶电纺纤维膜的制备步骤1)中加入的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108的用量为聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)重量的10％。
5.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：载酶电纺纤维膜的制备步骤3)中漆酶溶液与混合凝胶的体积比为0.8％～1.2％。
6.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：对载酶电纺纤维膜进行交联固定步骤1)中所述的戊二醛水溶液质量浓度为25％。
7.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：对载酶电纺纤维膜进行交联固定步骤1)中所述的用戊二醛水溶液饱和蒸气交联的时间为1小时。
8.一种固定化漆酶，其特征在于：是以聚乳酸-己内酯共聚物(P(LA/CL)，7/3)为载体材料，并通过如权利要求1-7中任一权利要求所述的制备方法将漆酶原位包埋固定在电纺纤维中而得到。
CN200910180625XA 2009-10-27 2009-10-27 一种制备电纺纤维膜固定化漆酶的方法 Expired - Fee Related CN101671665B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200910180625XA CN101671665B (zh) 2009-10-27 2009-10-27 一种制备电纺纤维膜固定化漆酶的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200910180625XA CN101671665B (zh) 2009-10-27 2009-10-27 一种制备电纺纤维膜固定化漆酶的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101671665A true CN101671665A (zh) 2010-03-17
CN101671665B CN101671665B (zh) 2010-12-15

Family

ID=42019088

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200910180625XA Expired - Fee Related CN101671665B (zh) 2009-10-27 2009-10-27 一种制备电纺纤维膜固定化漆酶的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101671665B (zh)

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102206623A (zh) * 2011-04-20 2011-10-05 同济大学 静电纺丝制备纳米纤维酶膜的方法及其应用
CN102230231A (zh) * 2011-06-17 2011-11-02 上海理工大学 一种具有同轴纺丝喷头的红外辐射辅助高压静电喷雾装置及其应用
CN102266825A (zh) * 2011-06-17 2011-12-07 上海理工大学 一种具有单喷头的红外辐射辅助高压静电喷雾装置及其应用
CN102703415A (zh) * 2012-05-30 2012-10-03 北京师范大学 一种利用静电纺丝技术固定化辣根过氧化物酶的方法
CN102701429A (zh) * 2012-05-30 2012-10-03 北京师范大学 一种固定化辣根过氧化物酶去除水中五氯酚的技术
CN102701430A (zh) * 2012-05-31 2012-10-03 北京师范大学 一种利用珠线状生物酶活性纤维膜净化水中多环芳烃的方法
CN102730818A (zh) * 2012-07-06 2012-10-17 北京师范大学 一种基于脲酶固定化纳米膜修复水体富营养化污染的方法
CN104313789A (zh) * 2014-03-24 2015-01-28 长春工业大学 一种增强电纺丝膜机械性能的方法
CN108187644A (zh) * 2018-01-30 2018-06-22 吉林大学 乳化-光聚合制备微米级含酶凝胶微球的方法及应用
CN109612986A (zh) * 2018-12-04 2019-04-12 聚光科技(杭州)股份有限公司 检测试纸、制造方法及检测方法
CN110530933A (zh) * 2019-07-18 2019-12-03 广东工业大学 一种用于检测低分子量醇类气体的传感器膜及其制备方法和传感器
TWI715282B (zh) * 2019-11-07 2021-01-01 國立宜蘭大學 以電紡技術固定化酵素製備時間溫度感應器的製作方法
CN113832135A (zh) * 2021-10-22 2021-12-24 江苏奕农生物股份有限公司 一种改性聚丙烯微孔膜固定化漆酶的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003106655A2 (en) * 2002-06-18 2003-12-24 The University Of Akron Fibrous protein-immobilization systems
CN100340663C (zh) * 2004-08-06 2007-10-03 天津大学 固定化纤维素酶的聚乙烯醇纳米超细纤维膜及其制备方法
CN1300393C (zh) * 2005-07-01 2007-02-14 中国科学院长春应用化学研究所 超细纤维药物剂型的乳液电纺丝制备方法
CN101407803B (zh) * 2008-07-01 2011-04-06 北京师范大学 聚乳酸电纺纤维固定化漆酶及其制备方法

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102206623A (zh) * 2011-04-20 2011-10-05 同济大学 静电纺丝制备纳米纤维酶膜的方法及其应用
CN102230231A (zh) * 2011-06-17 2011-11-02 上海理工大学 一种具有同轴纺丝喷头的红外辐射辅助高压静电喷雾装置及其应用
CN102266825A (zh) * 2011-06-17 2011-12-07 上海理工大学 一种具有单喷头的红外辐射辅助高压静电喷雾装置及其应用
CN102703415A (zh) * 2012-05-30 2012-10-03 北京师范大学 一种利用静电纺丝技术固定化辣根过氧化物酶的方法
CN102701429A (zh) * 2012-05-30 2012-10-03 北京师范大学 一种固定化辣根过氧化物酶去除水中五氯酚的技术
CN102701430A (zh) * 2012-05-31 2012-10-03 北京师范大学 一种利用珠线状生物酶活性纤维膜净化水中多环芳烃的方法
CN102730818A (zh) * 2012-07-06 2012-10-17 北京师范大学 一种基于脲酶固定化纳米膜修复水体富营养化污染的方法
CN102730818B (zh) * 2012-07-06 2013-08-14 北京师范大学 一种基于脲酶固定化纳米膜修复水体富营养化污染的方法
CN104313789A (zh) * 2014-03-24 2015-01-28 长春工业大学 一种增强电纺丝膜机械性能的方法
CN104313789B (zh) * 2014-03-24 2018-08-17 长春工业大学 一种增强电纺丝膜机械性能的方法
CN108187644A (zh) * 2018-01-30 2018-06-22 吉林大学 乳化-光聚合制备微米级含酶凝胶微球的方法及应用
CN108187644B (zh) * 2018-01-30 2020-12-01 吉林大学 乳化-光聚合制备微米级含酶凝胶微球的方法及应用
CN109612986A (zh) * 2018-12-04 2019-04-12 聚光科技(杭州)股份有限公司 检测试纸、制造方法及检测方法
CN110530933A (zh) * 2019-07-18 2019-12-03 广东工业大学 一种用于检测低分子量醇类气体的传感器膜及其制备方法和传感器
TWI715282B (zh) * 2019-11-07 2021-01-01 國立宜蘭大學 以電紡技術固定化酵素製備時間溫度感應器的製作方法
CN113832135A (zh) * 2021-10-22 2021-12-24 江苏奕农生物股份有限公司 一种改性聚丙烯微孔膜固定化漆酶的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN101671665B (zh) 2010-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101671665B (zh) 一种制备电纺纤维膜固定化漆酶的方法
Dai et al. In situ encapsulation of laccase in microfibers by emulsion electrospinning: Preparation, characterization, and application
Das et al. Waste chimney oil to nanolights: A low cost chemosensor for tracer metal detection in practical field and its polymer composite for multidimensional activity
Yang et al. Release pattern and structural integrity of lysozyme encapsulated in core–sheath structured poly (dl-lactide) ultrafine fibers prepared by emulsion electrospinning
Rather et al. Overview on immobilization of enzymes on synthetic polymeric nanofibers fabricated by electrospinning
CN101407803B (zh) 聚乳酸电纺纤维固定化漆酶及其制备方法
Kim et al. Surface functionalized electrospun biodegradable nanofibers for immobilization of bioactive molecules
Dror et al. Encapsulation of enzymes in biodegradable tubular structures
Dai et al. Laccase-carrying electrospun fibrous membrane for the removal of polycyclic aromatic hydrocarbons from contaminated water
Roozbahani et al. Effects of chitosan alkali pretreatment on the preparation of electrospun PCL/chitosan blend nanofibrous scaffolds for tissue engineering application
Siqueira et al. Poly (lactic acid)/chitosan fiber mats: Investigation of effects of the support on lipase immobilization
Ma et al. Fabrication of wool keratin/polyethylene oxide nano-membrane from wool fabric waste
Xiaoqiang et al. Fabrication and properties of core‐shell structure P (LLA‐CL) nanofibers by coaxial electrospinning
CN107675364A (zh) 以乳液电纺技术制备双载药复合纤维膜的方法
Feng et al. Preparation of Cu (II)‐chelated poly (vinyl alcohol) nanofibrous membranes for catalase immobilization
Chuysinuan et al. Gallic acid‐loaded electrospun poly (L‐lactic acid) fiber mats and their release characteristic
Fazel et al. Electrospun polyvinyl alcohol/bovine serum albumin biocomposite membranes for horseradish peroxidase immobilization
Chen et al. Biocatalytic membranes prepared by inkjet printing functionalized yeast cells onto microfiltration substrates
Prado-Prone et al. Single-step, acid-based fabrication of homogeneous gelatin-polycaprolactone fibrillar scaffolds intended for skin tissue engineering
Zhong et al. Fabrication of lignosulfonate vesicular reverse micelles to immobilize horseradish peroxidase
Wang et al. Controllable biotinylated poly (ethylene-co-glycidyl methacrylate)(PE-co-GMA) nanofibers to bind streptavidin–horseradish peroxidase (HRP) for potential biosensor applications
US7723084B2 (en) Fibrous protein-immobilization systems
CN101265448B (zh) 油酯催化分离两相酶-膜生物反应器及其制备和应用
CN100457899C (zh) 壳聚糖/聚乙烯醇纳米纤维复合膜用于固定化酶的方法
CN101891292B (zh) 一种快速吸附去除水中微量多环芳烃的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20101215

Termination date: 20111027