CN102703415A - 一种利用静电纺丝技术固定化辣根过氧化物酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶固定化领域，具体是涉及一种利用乳液静电纺丝技术制备电纺纤维膜固定化辣根过氧化物酶的方法。该方法是通过乳液电纺技术将辣根过氧化物酶原位包埋固定在电纺纤维中，其固定化辣根过氧化物酶的载体材料是具有较强亲水性的可生物降解的聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)。载酶电纺纤维膜的制备是先将聚合物溶液和辣根过氧化物酶溶液配制成均质的乳液，然后将乳液进行静电纺丝，几小时后可得到电纺纤维膜固定化辣根过氧化物酶。本发明提供了一种新的简单高效的制备固定化辣根过氧化物酶的方法，该方法所得的固定化辣根过氧化物酶催化活性高、稳定性好，且制备成本低廉。
Description
技术领域
本发明属于酶固定化领域，具体为一种利用乳液静电纺丝技术制备聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)电纺纤维膜固定化辣根过氧化物酶的方法。
背景技术
辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，EC 1.11.1.7)是一种是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白。辣根过氧化物酶以铁卟啉为辅基，属血红素蛋白质类，其辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm。辣根过氧化物酶稳定，分子量小，比活性高，并且作用的底物宽泛，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。辣根过氧化物酶具有的优良特性为处理水体中有机污染物提供了有效的途径，该方法具有操作简单、条件温和、对环境无二次污染等优点，在废水处理、免疫学、临床化学、组织化学示踪等方面有着巨大的应用前景。但由于游离辣根过氧化物酶容易受到环境条件的影响而失活，难以实现重复利用并且不能长期贮存，在实际应用中受到很大的限制。
20世纪50年代兴起的酶固定化技术实现了辣根过氧化物酶应用手段的创新。固定化辣根过氧化物酶不仅是改善辣根过氧化物酶重复利用性和稳定性的有效手段，且在降低成本，生产自动化、连续化，保护环境等许多方面都十分有利，它为辣根过氧化物酶的应用开拓了广阔的前景。固定化辣根过氧化物酶的性能主要取决于固定化所使用的载体材料的性质。理想的载体材料应具备良好的机械强度、热稳定性、化学稳定性、对酶的亲和性，并能保持较高的酶活性等。近年来各界学者对辣根过氧化物酶的固定化进行了广泛的研究，采用的固定化载体包括明胶、粘土、纳米微粒、活性炭、壳聚糖、高分子聚合物和亲水性微滤膜等多种材料。其中高分子聚合物材料因为抗微生物性能良好，机械强度大，且有较好的价格优势，所以用其研制辣根过氧化物酶固定化载体的前景看好。
静电纺丝纤维膜就是一种以高分子聚合物为原料，利用静电纺丝技术制备而成的载体，具体是由聚合物溶液或熔体借助于高压静电场作用进行喷射拉伸而形成的纳米级至微米级纤维组成。静电纺丝纤维膜因其具有孔隙率高、比表面积大、机械强度高且制备简单等优点，被人们认为是一种潜在的酶固定化基质。将静电纺丝纤维膜作为固定化酶的载体，不仅有利于酶与底物充分接触，能有效提高酶的催化效率，还容易从反应体系中分离回收。但目前关于静电纺丝纤维膜固定化酶的研究主要集中在后固定方面，即先制备纤维膜，然后再用吸附、交联等方法将酶固定在原膜或者修饰过的膜表面上。利用吸附法固定酶时，尽管纤维膜有较大的比表面积，但酶只能单层固定在纤维膜表面，酶载量相对较低，且反应过程中酶容易脱 落，导致酶重复利用性差；如果通过化学交联方法提高酶载量，酶活性会受到较大影响。
乳液电纺是静电纺丝技术的一个新的分支，因其能够通过直接电纺油-水或者水-油乳液制备壳-核结构超细纤维而受到人们的关注。此外，乳液静电纺丝技术设备简单，易于操作，反应条件温和，且成本低廉，是一种经济高效的制备载酶超细纤维的方法。专利号为ZL 200810126027.X，名称为聚乳酸电纺纤维固定化漆酶及其制备方法，公开号为CN101407803的专利及专利号为ZL 200910180625.X，名称为一种制备电纺纤维膜固定化漆酶的方法，公开号为CN101671665的专利分别运用外消旋聚乳酸和聚乳酸-己内酯共聚物为原料制备固定化漆酶，但是两种材料都有较强的疏水性，存在与水体分离的缺点，限制其应用。聚乳酸-乙醇酸共聚物是一种生物相容性良好，可生物降解的高分子材料，它在自然界中可逐渐完全降解为二氧化碳和水，不会对环境造成二次污染，是一种环境友好材料。同时，聚乳酸-乙醇酸共聚物具有较强的亲水性，可增加用其制成的电纺纤维膜的浸润性。将乳液电纺技术和环境友好材料的结合，为辣根过氧化物酶固定化技术提供了一种新的思路，有着广阔的发展前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单高效的固定化辣根过氧化物酶的制备方法，即利用乳液静电纺丝技术将辣根过氧化物酶原位包埋固定在聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25，即合成时聚乳酸和乙醇酸用量比例为75/25)电纺纤维中的方法。本发明的另一个目的是提供一种新型的稳定性好、催化活性高，且生产成本低廉的电纺纤维膜固定化辣根过氧化物酶。
本发明的技术方案是：
本发明提供的电纺纤维膜固定化辣根过氧化物酶是以具有良好生物相容性的高分子量聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)为载体材料，通过电纺聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)/聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(F108)/二氯甲烷溶液与辣根过氧化物酶水溶液充分混合形成的乳液，将辣根过氧化物酶原位包埋固定在聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)电纺纤维中。
载酶电纺纤维膜的制备步骤包括：
1)将分子量为10万的聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)颗粒溶于二氯甲烷中，加入嵌段共聚物表面活性剂，均匀混合后搅拌3小时得到共聚物混合凝胶；
2)称取0.6毫克辣根过氧化物酶溶于0.3毫升pH值为4的磷酸盐缓冲溶液中，震荡摇匀至全部溶解；
3)取步骤2)中所得辣根过氧化物酶溶液或者经过荧光素异硫氰酸酯标记的浓度为2毫克/毫升的辣根过氧化物酶溶液加入共聚物混合凝胶中，搅拌直至形成均质乳液；
4)将步骤3)中所得乳液引入到高压静电纺丝装置中，调节各参数以获得稳定连续的喷射；
5)在接收板的铝箔上收集电纺纤维膜，电纺4～5小时后待纤维膜厚度达到0.5～1毫米，停止纺丝。所得载酶纤维膜储存在4℃下备用；
本发明方法中，其中步骤1)中所述的嵌段共聚物表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108，其分子式为PEO132-PPO50-PEO132，分子量为15500克/摩尔。
本发明中聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)质量浓度为11±0.5％，加入的嵌段共聚物F108的用量为聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)质量的11±0.5％。
本发明提供的利用乳液静电纺丝技术制备聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)电纺纤维固定化辣根过氧化物酶方法具有如下优点：
1.固定化载体聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)生物相容性好，用于酶固定化可以有效保护酶活性，且用于环境污染物降解领域不会引入二次污染。
2.嵌段共聚物表面活性剂可显著降低混合凝胶的表面张力，有利于形成均质乳液；同时提高了纤维膜整体的亲水性，对保持酶活性和稳定性起到重要作用。
3.以乳液静电纺丝技术制备载酶纤维膜，方法操作简单，条件温和，成本低。
4.所制得的电纺纤维膜固定化辣根过氧化物酶载酶活高，酶活保持较好，且稳定性和重复利用性好，可降低经济成本。
附图说明
图1为载酶聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)电纺纤维膜在不同放大倍数下的扫描电子显微镜图像；其中，图1大图为载酶聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)电纺纤维膜放大1000倍扫描电子显微镜图像；图1插入图为载酶聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)电纺纤维膜放大5000倍扫描电子显微镜图像；
具体实施方式
本发明提供的利用乳液静电纺丝技术制备电纺纤维膜固定化辣根过氧化物酶的制备步骤包括：
1)将分子量为10万的聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)颗粒溶于二氯甲烷中，加 入嵌段共聚物表面活性剂F108，均匀混合后搅拌2小时得到共聚物混合凝胶，其中嵌段共聚物F108的用量为聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)重量的11±0.5％；
2)称取0.6毫克辣根过氧化物酶溶于0.3毫升pH值为4的磷酸盐缓冲溶液中，震荡摇匀至全部溶解。为使用激光共聚焦扫描显微镜观察辣根过氧化物酶在电纺纤维中的分布，实验中用于制备观察纤维膜形态的样品时均采用经过荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的浓度为2毫克/毫升的辣根过氧化物酶溶液；
3)取步骤2)中所得辣根过氧化物酶溶液加入共聚物混合凝胶中，搅拌直至形成均质乳液，其中酶液与混合凝胶的体积比为2.5±0.1％；
4)高压静电纺丝设备由直流高压电源、喷丝头和接收装置组成。将步骤3)中所得乳液引入到高压静电纺丝装置中，调节电源电压为10千伏，接收距离为15厘米，以获得稳定连续的喷射；
5)在接收板的铝箔上收集电纺纤维膜，4～5小时后待纤维膜厚度达到0.5～1毫米，停止纺丝。所得载酶纤维膜储存在4℃下备用。
本发明中，所使用的辣根过氧化物酶是本技术领域人员所熟悉的，可以通过试剂供应商获得。
本发明中，所使用的高压静电纺丝装置为本领域公知的高压静电纺丝装置，其通常由高压直流电源、喷丝头和接收装置构成，所用部件如高压直流电源、注射器喷丝头和金属板等都可以通过相应设备供应商获得。
本发明方法中，所用的嵌段共聚物表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108，其分子式为PEO132-PPO50-PEO132，分子量为15500克/摩尔。
本发明在聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)体系中引入嵌段共聚物表面活性剂，可显著降低混合凝胶的表面张力，有利于均质乳液的形成；同时也可以减小电纺纤维膜的接触角，提高膜的浸润性，对保护酶活性起到重要作用。
本发明提供的聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)电纺纤维膜固定化辣根过氧化物酶的活性测试以2，2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)为底物。具体测定方法为在室温下取1片1.5×1.5厘米交联后的载酶电纺纤维膜(约15～20毫克)，然后将其加入到5毫升ABTS浓度为1.7毫摩尔/升，H2O2浓度为0.83毫摩尔/升的水溶液中，持续震荡反应5分钟后，取反应液在紫外-可见分光光度计(Perkins-Elmer)上测量波长为405纳米处的吸光度值，然后根据酶活力定义计算酶活力。
本发明中，游离辣根过氧化物酶酶活测定方法如下：
在室温下取4.9毫升ABTS浓度为1.7毫摩尔/升，H2O2浓度为0.83毫摩尔/升的水溶液， 然后加入0.1毫升稀释后的酶液，在紫外-可见分光光度计(Perkins-Elmer)上测试反应5分钟时在405纳米下的吸光度值，然后根据酶活力定义计算酶活力。
辣根过氧化物酶活性回收率(％)＝(固定化辣根过氧化物酶酶活/用于固定化的游离辣根过氧化物酶酶活)×100％。
实施例
将1.8克聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)溶解于15克二氯甲烷中，再加入0.2克嵌段共聚物表面活性剂F108，均匀混合后搅拌2小时得到共聚物混合凝胶。称取0.6毫克辣根过氧化物酶溶于0.3毫升pH值为4的磷酸盐缓冲溶液中，震荡摇匀至全部溶解。将上述辣根过氧化物酶溶液或经过荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的浓度为2毫克/毫升的辣根过氧化物酶溶液加入共聚物混合凝胶中，搅拌直至形成均质乳液。然后将乳液引入高压静电纺丝装置。调节高压电源电压为10千伏，接收距离为15厘米，获得稳定连续的喷射流，并在覆盖有铝箔纸的接收板上收集纤维产品。4～5小时后待纤维膜厚度达到0.5～1毫米，停止纺丝，即得到载酶聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)电纺纤维膜。将载酶聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，75/25)电纺纤维膜在场发射扫描电子显微镜(FESEM S-4800场发射扫描电子显微镜，日立公司)下进行纤维形貌表征，其纤维呈现出孔隙结构，直径为几百纳米的纤维上分布有大量孔隙。在激光共聚焦扫描显微镜(LSM510激光共聚焦扫描显微镜，德国蔡司)下观察辣根过氧化物酶在纤维中的分布，发现纤维上发出绿色荧光。这表明辣根过氧化物酶成功固定在纤维中。
将载酶纤维膜以pH值为4的磷酸缓冲溶液反复冲洗，直至淋洗液中没有游离酶，即得电纺纤维膜固定化辣根过氧化物酶样品，将其储存在4℃下备用。经测定，该样品的酶活性回收率为70.7％。
Claims (6)
1.一种制备电纺纤维膜固定化辣根过氧化物酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将分子量为10万的聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)颗粒溶于二氯甲烷中，加入嵌段共聚物表面活性剂，均匀混合后搅拌2小时得到共聚物混合凝胶；
2)称取0.6毫克辣根过氧化物酶溶于0.3毫升pH值为4的磷酸盐缓冲溶液中，震荡摇匀至全部溶解；
3)取步骤2)中所得辣根过氧化物酶溶液或者经过荧光素异硫氰酸酯标记的浓度为2毫克/毫升的辣根过氧化物酶溶液加入共聚物混合凝胶中，搅拌直至形成均质乳液；
4)将步骤3)中所得乳液引入到高压静电纺丝装置中，调节各参数以获得稳定连续的喷射；
5)在接收板的铝箔上收集电纺纤维膜，4～5小时后待纤维膜厚度达到0.5～1毫米，停止纺丝，所得载酶纤维膜储存在4℃下备用。
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：载酶电纺纤维膜的制备步骤1)中所述的表面活性剂为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108，其分子式为PEO132-PPO50-PEO132，分子量为15500克/摩尔。
3.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：载酶电纺纤维膜的制备步骤1)中聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)的质量浓度为11±0.5％。
4.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：载酶电纺纤维膜的制备步骤1)中加入的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物F108的用量为聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)重量的11±0.5％。
5.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：载酶电纺纤维膜的制备步骤3)中辣根过氧化物酶溶液与混合凝胶的体积比为2.5±0.1％。
6.一种固定化辣根过氧化物酶，其特征在于：是以聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)为载体材料，并通过如权利要求1-5中任一权利要求所述的制备方法将辣根过氧化物酶原位包埋固定在电纺纤维中而得到。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112695027A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-04-23 | 华南理工大学 | 一种实现酶解反应与产物纯化同步的固定化酶纳米纤维膜及制备和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101671665A (zh) * | 2009-10-27 | 2010-03-17 | 北京师范大学 | 一种制备电纺纤维膜固定化漆酶的方法 |
| CN101891292A (zh) * | 2010-07-27 | 2010-11-24 | 北京师范大学 | 一种快速吸附去除水中微量多环芳烃的方法 |
| CN102071541A (zh) * | 2010-11-17 | 2011-05-25 | 无锡中科光远生物材料有限公司 | 一种嵌套纳米结构静电纺丝纤维膜及其制备方法 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101671665A (zh) * | 2009-10-27 | 2010-03-17 | 北京师范大学 | 一种制备电纺纤维膜固定化漆酶的方法 |
| CN101891292A (zh) * | 2010-07-27 | 2010-11-24 | 北京师范大学 | 一种快速吸附去除水中微量多环芳烃的方法 |
| CN102071541A (zh) * | 2010-11-17 | 2011-05-25 | 无锡中科光远生物材料有限公司 | 一种嵌套纳米结构静电纺丝纤维膜及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 代云容 等: "静电纺丝纳米纤维膜固定化酶及其应用", 《化学进展》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112695027A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-04-23 | 华南理工大学 | 一种实现酶解反应与产物纯化同步的固定化酶纳米纤维膜及制备和应用 |
| CN112695027B (zh) * | 2020-12-31 | 2023-09-26 | 华南理工大学 | 一种实现酶解反应与产物纯化同步的固定化酶纳米纤维膜及制备和应用 |
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