CN101669936B - 一种含红车轴草素的药物组合物及其在医药上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含红车轴草素和/或樱黄素的药物组合物，通过体内广泛分布的选择性雌激素受体调节剂作用，具有预防和治疗心血管系统和骨质疏松等作用。还用于制备治疗癌症和药物先导化合物的药物。可以通过口服、鼻吸入、直肠或胃肠外、局部用药的方式施用于需要这种治疗的患者，每日给药剂量为1mg-4mg/kg，可以一次或多次施用。制剂多样如固体制剂、液体制剂、霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂、皮下植入剂等。尤其在肠道部位作用的缓释片剂、包衣片剂等。

Description

一种含红车轴草素的药物组合物及其在医药上的应用

本申请为发明名称为《一种含红车轴草素、樱黄素的药物组合物及其在医药上的应用》、申请号200510031097.3、申请日2005年10月25日的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及药物组合物及其用途，具体涉及含红车轴草素(Pratensein)、樱黄素(Prunetin)的药物组合物及其在医药上的应用。

背景技术

异黄酮类成分广泛存在于植物中，具有多种生物活性，如抗癌、降低血脂、植物雌性激素样作用、提高机体免疫力等作用，有关黄酮类成分的相关研究一直为国内外学者所重视并不断深入。

红车轴草(Trifolium pretense L.)又名三叶草、红花苜蓿等，多用作牧草，全草中含多种黄酮和异黄酮类成分化合物，现代药理研究证明，红车轴草具有显著的生物活性，已报道的活性有：

1、雌性激素样作用：该植物中含有多种异黄酮类成分具有雌性激素样作用，如鹰嘴豆芽素(biochanin)A和B(即芒柄花素formononetin)、染料木素(genistein)、大豆素(daidzein)等，但上述异黄酮的雌激素样作用均弱，当然也有研究认为鹰嘴豆芽素B作用最弱或无活性。

2、抗癌作用：有报告称本品水提物给大鼠灌服或注射，能抑制肉瘤S₄₅的生长；其中所含染料木素对人鼻咽癌KB细胞有细胞毒活性。

3、降血脂作用：报告表明染料木素能降低血清中甘油三酯及胆固醇的作用，而鹰嘴豆芽素A也能抑制血清胆固醇升高，大豆素也显示明显的降脂作用。

4、其它作用：有文献报道本品有抗病原微生物作用，其中所含三叶豆紫檀甙有抗真菌的作用。

目前为止，报道的红车轴草总黄酮或红车轴草提取物多以鹰嘴豆芽素A和B为主要组成成分，或兼带少量染料木素、大豆素，其中的红车轴草素、樱黄素的含量甚微，一般没有列入含量检测范围，它们的化学结构式为：

                          R₁  R₂  R₃  R₄

鹰嘴豆芽素A(biochanin)    Me  OH  H   H

鹰嘴豆芽素B(formononetin) Me  H   H   H

大豆素(daidzein)          H   H   H   H

染料木素(genistein)       H   OH  H   H

红车轴草素(pratensein)    Me  OH  H   H

樱黄素(prunetin)          H   OH  H   Me

到目前为止，还未见国内外对红车轴草素、樱黄素或其苷类作为选择性雌激素受体调节剂的研究报道以及相关医药应用方面的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种含红车轴草素和/或樱黄素的药物组合物，通过选择性雌激素受体调节剂作用，具有预防和治疗心血管系统、骨质疏松和癌症等作用。

本发明红车轴草素和/或樱黄素以经典的E-SCREEN法测定雌激素样活性，显示出二者均可促进MCF-7细胞的增殖，具有雌激素样作用，活性为药物雌二醇的10^-5-10^-3。

本发明红车轴草素和/或樱黄素在心血管系统和骨骼中对某些雌激素应答性组织发挥选择性作用。体外试验也证实二者均可显著地促进成骨细胞的增殖，并可显著增加细胞基质钙和矿化结节钙。显示具有预防和治疗心血管系统疾病和骨质疏松症方面可发挥作用。

本发明动物实验还发现红车轴草素或樱黄素的毒性很低，大剂量使用时动物的行为也无任何显著变化。

本发明的药物组合物含有治疗有效量的上述通式(1)红车轴草素、樱黄素为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。

本发明的红车轴草素和/或樱黄素和药物组合物可用于制备治疗癌症、绝经期骨质疏松、心脑血管疾病和药物先导化合物的药物。

上述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂等。其制剂形式包括各种固体剂型及液体剂型。另外还可以在组合物中加入其它辅剂和香味剂、甜味剂等。

本发明的红车轴草素、樱黄素可以药物组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或胃肠外、局部用药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油性悬浮剂等或其它液体制剂如糖浆等；用于胃肠外时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。局部给药时，可将其制成霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂、皮下植入剂等。优选的形式是片剂、缓释片剂、包衣片剂、胶囊、鼻喷雾剂、皮下植入剂，特别优选在肠道的特定部位缓释的制剂。

本发明的药物组合物的各种剂型可以按照药学领域常规的生产方法制备，例如使红车轴草素和/或樱黄素活性成份与一种或多种载体混合，根据不同适应症选择不同给药途径将其制成临床应用所需的合适剂型。

本发明的药物组合物的活性成份是红车轴草素，樱黄素，优选含有重量比为0.1％-99.5％的活性成分，最优选含有重量比为0.5％-95％的活性成分。

本发明的活性成份的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等调整，其每日给药剂量为1mg-4mg/kg，可以一次或多次施用。

下面的实施例可以使本专业技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

实施例1

红车轴草素(pratensein)、樱黄素(prunetin)的雌激素样活性

本实验以MCF-7雌激素依赖性乳腺癌细胞为生物测试载体，采用经典的E-SCREEN法测定其雌激素样活性。

本实验设DMSO溶剂对照组(阴性)、1nM雌二醇对照组(阳性)、红车轴草素组(1uM、10uM)、樱黄素组(1uM、10uM)。

结果显示：红车轴草素、樱黄素能显著的促进MCF-7细胞的增殖，具有雌激素样作用，但其活性仅为雌二醇的10^-5-10^-3。

实施例2

红车轴草素(pratensein)、樱黄素(prunetin)与雌激素受体相互作用的分子模拟

采用计算机辅助药物设计方法，以雌激素受体(ER β，ER α)作为靶标模型，以分子力学优化的方法获得pratensein和prunetin分子的活性构象，用分子对接程序计算受体与配基间的相互作用。

结果显示：pratensein及prunetin均可进入雌激素受体的结合腔，结果还提示二者与ERβ的结合力要比与ERα的结合力强7-10倍。另外，分子上某些位置被取代，对其活性有一定影响。

由于人体ERβ和ERα存在组织分布上的差异，ERβ主要存在于脑、骨骼、膀胱和血管上皮组织，提示pratensein及prunetin可能在心血管系统和骨骼中对某些和ERα雌激素应答性组织发挥选择性作用。

实施例3

红车轴草素(pratensein)、樱黄素(prunetin)对体外培养成骨细胞的影响

取新生1-3天SD大鼠头盖骨用酶消化法分离成骨细胞，第三代细胞经MTT法、甲基百里香酚蓝(MTB)比色法观察红车轴草素、樱黄素对体外培养成骨细胞增值、细胞基质钙及矿化结节钙的影响。

结果显示：红车轴草素、樱黄素0.1-10umol/L浓度均能显著地促进成骨细胞增殖，并能显著增加细胞基质钙和矿化结节钙。具体结果见下表：

*P＜0.05，**P＜0.01与control比较；^△P＜0.05，^△△P＜0.01与NaF比较

实施例4

红车轴草素(pratensein)、樱黄素(prunetin)在医药领域中的应用pratensein和prunetin与雌激素受体相互作用的分子模拟结果提示，pratensein、prunetin均极有可能为一选择性雌激素受体调节剂，结合对选择性雌激素受体调节剂现有的研究成果，因此pratensein及prunetin极有希望开发成为预防或治疗与骨质疏松症有关药物、预防或治疗与癌症有关药物、预防或治疗与绝经期相关疾病有关药物、预防或治疗与心脑血管系统疾病，保护心血管功能药物，并以各种剂型使用或各种给药途径用于临床。

实施例5

红车轴草素、樱黄素(1∶1)的组合物(样品I)对卵巢切除大鼠的影响

以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔给药麻醉，大鼠备皮，摘除两侧卵巢，术后休养9天后开始给药。大鼠分为四组，正常组、模型组、样品I 100mg/kg组，雌激素50微克/kg组，每日给药。持续30天。

给药20日起，大鼠每日阴道涂片10天，观察生理周期。用200微升的移液枪吸取50微升0.9％的生理盐水注射液，注入阴道，回吸灌洗液，玻片均匀涂片。晾干后瑞士染液、Giemsa染液染色，400倍电子显微镜下进行分类计数。给药30日后，取血清，在动物全自动生化分析仪上测定血清甘油三酯、总胆固醇。测定大鼠血清雌激素、孕激素含量。

样品I对卵巢切除大鼠血清甘油三酯、总胆固醇的影响

研究发现，药物有降低甘油三酯和总胆固醇的趋势。

预实验结果表明，样品I对卵巢切除大鼠的子宫重量、阴道生理周期变化、血清甘油三酯、总胆固醇等，都有一定的作用。

注：样品I表示的是红车轴草素、樱黄素(1∶1)的组合物

实施例6

样品I对维甲酸所致大鼠骨质疏松症的预防作用。

大鼠随机分为6组，正常对照组、模型对照组、样品I低、中、高剂量组、阳性对照组，除正常对照组外，各组大鼠均口服维甲酸70mg/kg，服用量1ml/100g大鼠，每天1次，连续14天，同时每天各组大鼠依次口服以下样品，正常对照组、维甲酸模型组为相应溶剂10ml/kg、样品I低剂量组4mg/kg、中剂量组12mg/kg、高剂量组36mg/kg、阳性药羟乙基膦酸钠50mg/kg，服用量均为1ml/100g大鼠，每天1次，连续28天，其间每周称体重1次，以体重调整给药用量。

给药结束，取血分离血清，按试剂盒方法测S-Ca、S-P含量，取大鼠双侧股骨，在X线骨密度仪扫描，测出骨密度(g/cm²)，称骨重(W)，测骨长(L)，骨直径(D)，计算骨表观线密度(W/L)、表观面密度(W/L·D)，然后110℃烘干一小时，再置于马福炉内200、400、600、800℃各灰化2小时，灰化结束冷却后，称灰重(Wash·g)，用6NHCl提取后测骨灰Ca、骨灰P含量，以100g骨灰含Ca或P的克数表示。

另一侧股骨头用3％HNO₃脱钙后作石蜡切片，HE染色，显微镜下测骨小梁宽度。以上结果均以给药组与模型组比较，模型组与正常对照组比较。实验当天及第1周内各组动物体重无明显差异(P＞0.05)，给药后2、4周维甲酸模型组体重比正常对照组体重减轻(P＜0.01、P＜0.05)，但用药后各组动物体重均明显增加，其中低剂量组(4mg/kg)有体重增加但无统计意义，而样品I样品I中、高剂量组(12mg/kg、36mg/kg)及羟乙基膦酸钠组大鼠第2、4周的体重均比模型组增加(P＜0.05)，各剂量组相互比较无明显差异。模型组大鼠股骨骨密度比正常对照组低(P＜0.01)，血清Ca含量也较模型组低(P＜0.05)，血清磷含量变化不大，但用药组大鼠股骨密度都比模型组增加(P＜0.05、P＜0.01)，血清钙及磷的含量均较模型组升高，但样品I中、高剂量组无明显差异。阳性药羟乙基膦酸钠的大鼠股骨骨密度及血清钙血清磷含量也比模型组有明显的差异(P＜0.05、P＜0.01)。

样品I对维甲酸诱导大鼠骨质疏松症预防作用的骨指数影响如下：

与对照组比较，模型组的W、L、d、W/L、W/Ld均明显下降，相对于模型组样品I中、高剂量组及羟乙基膦酸钠组的W、W/Ld均明显提高

与对照组比较，模型组的骨灰重及灰分中骨Ca及骨P含量均降低，但用药后样品I中、高剂量组及羟乙基膦酸钠组骨灰重、骨Ca、骨P含量均相对增加

实施例7

片剂制备方法：活性成分、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，活性成分含量10mg。

实施例8

胶囊制备方法：将活性成分与助剂混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量50mg。

实施例9

注射制备方法：将活性成分与氯化钠9mg溶解于适量注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓶中，活性成分含量10mg。

实施例10

鼻喷雾剂制备方法：活性成分1mg，氯化钠8mg，EDTA1mg，磷酸钠缓冲液(pH6-7)10mg，多乙氧基醚10mg，重蒸镏水加至2ml，搅拌下于适当体积的重蒸镏水中每次加入一种成分，加水至2ml.后，将该溶液在无菌过滤器上过滤，装入瓶中并按照适当的剂量分隔。

Claims (9)

1.作为唯一活性成分的红车轴草素在制备预防或治疗骨质疏松症或降低血脂药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的骨质疏松症为绝经期骨质疏松症。

3.一种药物组合物，其特征是该药物组合物包括作为唯一活性成分的红车轴草素。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物为固体剂型或液体剂型。

5.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物为口服、鼻吸入、直肠或胃肠外，或局部用药的药物剂型。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：

所述的口服的药物剂型为片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂、水性悬浮剂、油性悬浮剂或糖浆；

所述的鼻吸入的药物剂型为鼻喷雾剂；

所述的胃肠外的药物剂型为注射用的溶液、水性悬浮剂或油性悬浮剂；

所述的局部给药的药物剂型为霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂或皮下植入剂。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述的片剂为缓释片剂。

8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述的片剂为包衣片剂。

9.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物的剂型为在肠道的特定部位缓释的制剂。