CN101659946B - 果胶酶的工业化生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶活力高的果胶酶的工业化生产方法，它包括菌株选育、菌种培养、摇瓶发酵、酶液制备，其特征是通过自然采集菌样分离筛选、细胞水平下菌种诱变获得，即蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、实验室编号为MAPLE21，保藏号：CCTCC NO：M 209147，其生物学特性为：菌体呈杆状，染色均匀，G+、兼性需氧，形成芽胞，芽胞不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列，本发明具有酶活力高，成本低，发酵周期短等特点；用于韧皮纤维脱胶时，脱胶时间短(2-4小时)且稳定，残胶率1.5％以下，对纤维强度破坏小，纤维分散率100％，制成率达65％以上，脱胶废水产生量降低80％以上。
Description
技术领域：
本发明涉及一种酶及其生产，具体地说是一种果胶酶的工业化生产方法。
背景技术：
目前苎麻、大麻、亚麻、构树皮、桑树皮等韧皮纤维的脱胶工艺基本上是以烧碱为主的化学脱胶工艺，虽然此生产工艺生产的植物纤维产品能满足梳纺的要求，但还存在脱胶流程长，工序繁锁、劳动强度大、能耗大、环境污染大等缺点，同时由于使用强酸、强碱、高温高压煮练等苛性条件，致使部分纤维素纤维分子链断裂、结晶度增高，造成产品制成率低、刚性强、织物手感粗糙等问题。植物细胞中的果胶质主要分为果胶酸和果胶两类基本多糖成分，另外还有不溶于水的原果胶。果胶酸是由D-半乳糖醛酸脱水缩合，以2-1，4糖苷键连接的直链聚合物；果胶是由半乳糖醛酸分子与甲醇酯化而成；原果胶以长链存在，是一种多聚半乳糖醛酸。天然果胶是多分支分子，其主链是鼠李糖-半乳糖醛酸、侧链是D-半乳糖、L-阿糖及木糖。大多数果胶类物质在细胞壁中以共价键和非共价键的形式与细胞壁中的其它大分子缔合粘结，一旦果胶质破坏，便会导致植物细胞离散，这就是已被学术界公认的果胶酶能脱胶的理论基础。依据此理论，脱胶酶的制作就是制作一套酶体系，分别水解；原果胶酶——将原果胶裂解为水溶性果胶，水解糖苷键、水解果胶上的甲氧基团，三种水解形式或共存或分步进行，最终达到离析韧皮纤维的目的。也就是说制造一套复合酶体系，该体系由下列酶构成；聚甲基半乳糖醛酸酶，聚甲基半乳糖酸裂解酶，聚半乳糖醛酸酶，聚半乳糖酸裂解酶，果胶酯酶等，该体系内的酶协同作用达到水解果胶的目的。虽然近年来对韧皮纤维采用生物酶脱胶已有大批专家学者进行了深入研究，如专利号为ZL01106844.2，申请日为2001年1月15日，发明名称为苎麻脱胶果胶酶的生产及其在苎麻脱胶工艺中的应用的专利公开了一种由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、实验室编号为No.13，保藏号CCTCCNO：M200038的菌种制备的酶液应用于苎麻脱胶工艺，但存在酶活力低(3000u/ml-4000u/ml)，发酵周期长达30多个小时、酶制作成本高，难以实现工业化生产及难以推广应用等难题。
发明内容：
本发明的目的是提供一种酶活力高的果胶酶的工业化生产方法。本发明是按照DNS比色法测得果胶酶的活力，测定条件：pH9.0、温度60℃、波长550nm，一个酶活力单位定义为，由底物(浓度1％)每小时释放1mg半乳糖醛酸所需的酶量。
本发明是采用如下技术方案实现其发明目的的：
其技术方案包括：菌株选育、菌种培养、摇瓶发酵、酶液制备。
所述的菌株选育是按照本领域已知的方法，在湖南、四川、河南等麻类植物的主产地土壤中通过自然采集菌样，从近百株菌株中经摇瓶筛选得到一株出发菌株，并在细胞水平下采用亚硝基胍和紫外线辐射诱变得到近万株菌株，经过摇瓶筛选得到一株实验室编号为MAPLE21的菌株，即蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，其生物学特性为：菌体呈杆状，染色均匀，G+、兼性需氧，形成芽胞，芽胞不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列。该菌种已于2009年7月14日提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M209147，并于2009年7月16日提交了保藏存活证明。
本发明所述的菌种培养为CCTCC NO：M 209147菌种在如下配制的斜面上生长良好，斜面培养基配方为：1000mL蒸馏水中，加入牛肉膏5g-10g，酵母膏5g-10g，蛋白胨10g-15g，葡萄糖5g-10g，氯化钠5g-10g，调pH值6.9-7.1，0.1MPa灭菌20分钟-30分钟，制成试管斜面，接种该菌种，33℃-35℃，培养18小时-24小时，备用。
本发明所述的摇瓶发酵为CCTCC NO：M 209147菌种在规定的培养条件下可产生高活力的果胶酶，这种培养条件是：培养基配方(％)麦麸6-8、玉米粉0.5-1、玉米浆(氮含量40％)1-2、氯化钠0.5-0.8、微晶纤维素1-2、水86.5-91，其中所述各组分之和为100％，灭菌前，调pH值为8.0-8.5，0.1MPa灭菌25分钟-35分钟，培养条件：33℃-35℃，转速260r/min-280r/min，培养18小时-22小时。
本发明所述的酶液制备为由茄瓶斜面到种子罐到发酵罐，二级发酵，其培养基配方为(％)麦麸6-8、玉米粉0.5-1、玉米浆(氮含量40％)1-2、氯化钠0.5-0.8、微晶纤维素1-2、水86.5-91，其中所述各组分之和为100％，灭菌前，调pH值为8.0-8.5，0.1MPa灭菌25分钟-35分钟，装罐总体积不超过70％；培养条件：温度(℃)：33-38，搅拌转速(r/min)：180-220，通气量(v/v)：1∶0.25-0.55，罐压0.06MPa-0.08MPa，培养周期：种子罐为7小时-8小时，发酵罐为12小时-16小时。
本发明为利于菌体的生长和酶液的产生，种子罐的培养条件：温度(℃)：36℃-38℃，搅拌转速(r/min)：220，通气量(v/v)0时-5时，1∶0.40-0.46、5时以后1∶0.50-0.56；发酵罐的培养条件：温度(℃)：0小时-4小时，36-38，4小时以后33-35，搅拌转速(r/min)：0小时-4小时，180，4小时-6小时，200，6小时以后220，通气量(v/v)：0小时-4小时，1∶0.25-0.27，4小时-6小时，1∶0.33-0.36，6小时以后1∶0.5-0.55。
本发明为制备标准果胶酶液，在酶液制备后，将发酵醪液经过板框过滤、硅藻土除菌，经防腐处理得到酶活力保持率(15℃三个月)为95％以上的标准果胶酶液。
由于采用上述技术方案，本发明较好的实现了发明目的，其酶活力高，标准果胶酶液≥8000u/ml，单位成本低，发酵周期短，工业化程度高，产品指标符合相关国家或行业标准；用于韧皮纤维脱胶时，脱胶时间短(2-4小时)且稳定，残胶率1.5％以下，对纤维强度破坏小，纤维分散率100％，制成率达65％以上，脱胶废水产生量降低80％以上。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明其技术方案包括：菌株选育、菌种培养、摇瓶发酵、酶液制备。
所述的菌株选育是按照本领域已知的方法，在湖南、四川、河南等麻类植物的主产地土壤中通过自然采集菌样，从近百株菌株中经摇瓶筛选得到一株出发菌株，并在细胞水平下采用亚硝基胍和紫外线辐射诱变得到近万株菌株，经过摇瓶筛选得到一株实验室编号为MAPLE21的菌株，即蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，其生物学特性为：菌体呈杆状，染色均匀，G+、兼性需氧，形成芽胞，芽胞不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列。该菌种已于2009年7月14日提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M209147，并于2009年7月16日提交了保藏存活证明。
CCTCC NO：M 209147菌种在含如下斜面(包括试管斜面和茄瓶斜面)培养基上，能保持高产酶能力，菌种经该斜面培养基传代6代以上产酶能力稳定，本发明所述的菌种培养为CCTCC N0：M 209147菌种在如下配制的斜面上生长良好，斜面培养基配方为：1000mL蒸馏水中，加入牛肉膏5g-10g，酵母膏5g-10g，蛋白胨10g-15g，葡萄糖5g-10g，氯化钠5g-10g，用氢氧化钠调pH值6.9-7.1，0.1MPa灭菌20分钟-30分钟，制成试管斜面，接种该菌种，33℃-35℃，培养18小时-24小时，备用。本实施例斜面培养基配方为：1000mL蒸馏水中，加入牛肉膏5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖5g，氯化钠5g，用氢氧化钠调pH值7.0，0.1MPa灭菌30分钟，制成试管斜面，接种该菌种，34℃，培养24小时。
CCTCC NO：M 209147菌种通过摇瓶试验，分别对不同碳源(葡萄糖、淀粉、蔗糖、玉米粉、纤维质粉、麦麸、橘皮粉、甜菜渣、苹果渣等)、氮源(硫酸铵、玉米浆、硝酸铵、氯化铵、尿素、蛋白胨、酵母膏、豆饼粉、花生饼粉等)、无机盐(氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾、硝酸钠等)、装液量、摇床转速、起始pH值、培养温度、培养周期进行了试验，得到高产果胶酶的最适培养基和摇瓶培养条件。本发明所述的摇瓶发酵为CCTCC NO：M 209147菌种在规定的培养条件下可产生高活力的果胶酶，这种培养条件是：培养基配方(％)麦麸6-8、玉米粉0.5-1、玉米浆(氮含量40％)1-2、氯化钠0.5-0.8、微晶纤维素1-2、水86.5-91，其中所述各组分之和为100％，灭菌前，用碳酸钠调pH值为8.0-8.5，0.1MPa灭菌25分钟-35分钟，培养条件：33℃-35℃，转速260r/min-280r/min，培养18小时-22小时。本实施例培养基配方(％)为：麦麸8、玉米粉1、玉米浆(氮含量40％)2、氯化钠0.5、微晶纤维素2、水86.5，其中所述各组分之和为100％，灭菌前，用碳酸钠调pH值为8.5，0.1MPa灭菌30分钟，培养条件：34℃，转速270r/min，培养20小时。其果胶酶活力最高达到15000u/ml，平均水平可达13500u/ml。
本发明所述的酶液制备为由茄瓶斜面到种子罐到发酵罐，二级发酵，其培养基配方为(％)麦麸6-8、玉米粉0.5-1、玉米浆(氮含量40％)1-2、氯化钠0.5-0.8、微晶纤维素1-2、水86.5-91，其中所述各组分之和为100％。本实施例培养基配方为(％)麦麸8、玉米粉1、玉米浆(氮含量40％)2、氯化钠0.5、微晶纤维素2、水86.5。灭菌前，用碳酸钠调pH值为8.0-8.5，0.1MPa灭菌25-35分钟，装罐总体积不超过70％；培养条件：温度(℃)：33-38，搅拌转速(r/min)：180-220，通气量(v/v)：1∶0.25-0.55，罐压0.06MPa-0.08MPa，培养周期：种子罐为7小时-8小时，种子成熟标准为菌体90％以上呈单体，染色均匀，果胶酶系酶活力不高于600u/ml，pH值6.3-6.7；发酵罐为12小时-16小时，放罐条件：pH值上升至7.0+，酶活力不再增加、菌体90％以上形成芽孢并有部分发生自溶现象。
本发明为利于菌体的生长和酶液的产生，种子罐的培养条件：温度(℃)：36℃-38℃(本实施例为37)，搅拌转速(r/min)：220，通气量(v/v)0时-5时，1∶0.40-0.46(本实施例为0.44)、5时以后1∶0.50-0.56(本实施例为0.52)，罐压0.07Mpa，发酵周期7小时-8小时(本实施例为7小时)；发酵罐的培养条件：温度(℃)：0小时-4小时，36-38(本实施例为37)，4小时以后33-35(本实施例为34)，搅拌转速(r/min)：0小时-4小时，180，4小时-6小时，200，6小时以后220，通气量(v/v)：0小时-4小时，1∶0.25-0.27(本实施例为0.27)，4小时-6小时，1∶0.33-0.36(本实施例为0.36)，6小时以后1∶0.5-0.55(本实施例为0.5)，罐压0.06MPa。发酵周期12小时-16小时(本实施例为16小时)，前8时每隔4小时、后期每隔2小时检测pH值、菌体形态、酶活力一次，其果胶酶活力最高达到12350u/ml，平均水平可达10000u/ml以上。
本发明为制备标准果胶酶液，在酶液制备后，即将发酵醪液经过板框过滤、硅藻土除菌、标准化制备成果胶酶活力≥8000u/ml，经防腐处理得到酶活力保持率(15℃三个月)为95％以上的标准高活力果胶酶。
本发明其酶活力高，标准果胶酶液≥8000u/ml，单位成本低，发酵周期短，工业化程度高，产品指标符合相关国家或行业标准；用于韧皮纤维脱胶时，脱胶时间短(2-4小时)且稳定，残胶率1.5％以下，对纤维强度破坏小，纤维分散率100％，制成率达65％以上，脱胶废水产生量降低80％以上。
Claims (6)
1.一种果胶酶的工业化生产方法，其特征是它包括菌种培养、摇瓶发酵、酶液制备等步骤，所述菌种即蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、实验室编号为MAPLE21，保藏号：CCTCC NO：M 209147，其生物学特性为：菌体呈杆状，染色均匀，G+、兼性需氧，形成芽胞，芽胞不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列。
2.根据权利要求1所述的果胶酶的工业化生产方法，其特征是所述的菌种培养为CCTCC NO：M 209147菌种在如下配制的斜面上生长良好，斜面培养基配方为：1000mL蒸馏水中，加入牛肉膏5g-10g，酵母膏5g-10g ，蛋白胨10g-15g，葡萄糖5g-10g ，氯化钠5g-10g ,调pH值6.9－7.1，0.1MPa灭菌20分钟－30分钟，制成试管斜面，接种该菌种，33℃－35℃，培养18小时－24小时，备用。
3.根据权利要求1所述的果胶酶的工业化生产方法，其特征是所述的摇瓶发酵为CCTCC NO：M 209147菌种在规定的培养条件下可产生高活力的果胶酶，这种培养条件是：培养基配方为麦麸6﹪－8﹪、玉米粉0.5﹪－1﹪、氮含量40﹪的玉米浆1﹪－2﹪、氯化钠0.5﹪－0.8﹪、微晶纤维素1﹪－2﹪、水86.5﹪－91﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为8.0-8.5，0.1MPa灭菌25分钟－35分钟，培养条件：33℃－35℃，转速260 r/min -280r/min，培养18小时-22小时。
4.根据权利要求1所述的果胶酶的工业化生产方法，其特征是所述的酶液制备为由茄瓶斜面到种子罐到发酵罐，二级发酵，其培养基配方为麦麸6﹪－8﹪、玉米粉0.5﹪－1﹪、氮含量40﹪的玉米浆1﹪－2﹪、氯化钠0.5﹪－0.8﹪、微晶纤维素1﹪－2﹪、水86.5﹪－91﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为8.0-8.5，0.1MPa灭菌25分钟－35分钟，装罐总体积不超过70％；培养条件：温度33℃－38℃，搅拌转速180 r/min－220 r/min，通气量以v/v 计：1：0.25 －0.55 ，罐压0.06 MPa－0.08MPa，培养周期：种子罐为7小时-8小时，发酵罐为12小时-16小时。
5.根据权利要求4所述的果胶酶的工业化生产方法，其特征是种子罐的培养条件：温度36℃－38℃，搅拌转速220 r/min，通气量以v/v 计： 0小时－5小时，1 ：0.40－0.46 、5小时以后1：0.50－0.55 ；发酵罐的培养条件：温度0小时－4小时，36℃－38℃，4小时以后33℃－35℃，搅拌转速：0小时－4小时，180 r/min，4小时－6小时，200 r/min，6小时以后220 r/min，通气量以v/v 计：0小时－4小时，1：0.25 －0.27，4小时－6小时，1 ：0.33－0.36，6小时以后1：0.5－0.55 。
6.根据权利要求4所述的果胶酶的工业化生产方法，其特征是在酶液制备后，制备标准果胶酶液，将发酵醪液经过板框过滤、硅藻土除菌，经防腐处理得到在15℃、密封存放三个月条件下，酶活力保持率为95%以上的标准果胶酶液。
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