CN101652483A - 二酯化合物的化学选择性酶水解以制备单酸单酯化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种合成方法。该方法涉及按照右面示意图A合成分子式(I)的化合物，其中R1，R2和R3可以相同或不同，分别独立表示烷基基团，其特征是一种酶水解反应，包括将分子式(II)的化合物与酶接触，该酶仅化学选择性水解分子式(II)的化合物的两个酯官能团中的一个，以便获得分子式(I)的化合物。本发明允许工业制备分子式(I)的中间体，该中间体可用于制备药物活性成分瑞格列奈。

Description

二酯化合物的化学选择性酶水解以制备单酸单酯化合物的方法

技术领域

本发明涉及从二酯衍生物合成4-羧甲基-2-烷氧基苯甲酸(4-carboxymethyl-2-alkyloxybenzoic acid)烷基酯衍生物的方法。

更特别地，是制备4-羧甲基-2-乙氧基苯甲酸乙酯，

它是工业生产用于治疗糖尿病的药物活性成分瑞格列奈(repaglinide)的关键合成中间体。

瑞格列奈

背景技术

现有技术公开的作者为P.Müller等人发表在J.Med.Chem.，1998，41(26)，P.5219的文章，其描述了合成4-羧甲基-2-乙氧基苯甲酸，乙酯的方法，其特征是相应二酯衍生物的选择性水解反应。

选择性水解反应是在乙醇中在25℃并有强碱，例如氢氧化钠水溶液的条件下进行的。

该方法用于工业应用的限制是形成不可忽略量的副产物，特别是难于除去的二酸化合物，需要几次萃取和洗涤处理，或几次再结晶从而分离产品，且最终目标产品的产量低。

而且，现有技术没有说明用相应二酯化合物的化学选择性酶水解反应制备包括在芳香环上的酯官能团(ester function)的苯乙酸(phenylacetic acid)化合物的任何方法。

特别地，现有技术没有说明化合物上苯乙酸的酯官能团相对苯甲酸的酯官能团在包括这两个功能团的化合物上的化学选择性酶水解方法。

发明内容

发明目的

本发明的主要目的是解决新的技术问题，该技术问题涉及提供用于制备4-羧甲基-2-乙氧基苯甲酸乙酯，同时避免形成副产物并增加产量的新方法。

本发明的另一个主要目的是解决新的技术问题，该新的技术问题涉及以最小化生产成本的方式提供该新方法。

本发明的另一个主要目的是按照一种新方法来解决上述新问题，该新方法能够以与药物生产相称的工业量和质量制备所述合成中间体。

具体实施方式

发明概要

本申请人现在开发了合成如下定义的分子式(I)的化合物的新方法。

更具体地，该方法是按照下面示意图A进行的：

示意图A

其中R1，R2和R3相同或不同，分别并独立地表示烷基基团。

按照一个具体实施例，每个基团R1，R2和R3同时是相同的，有利地是乙基。

在本发明中，分子式(I)的化合物是通过两个酯官能团中的一个酯官能团的化学选择性酶水解反应获得的。

按照本发明方法的特征是酶水解反应，其包括使分子式(II)的化合物与酶接触，从而获得分子式(I)的化合物，该酶仅化学选择性水解分子式(II)的化合物的两个酯官能团中的一个。在本发明中，为了制备瑞格列奈，对中间体的位置4的酯官能团进行化学选择性水解。

按照该方法的另一个有利的实施例，酶水解反应是在存在有机助溶剂或者没有有机助溶剂的情况下在pH值受控制的溶液中进行的。在反应过程中，控制溶液pH值以便酶活性不受该值影响，具体而言，反应过程中，该pH值保持在6和8之间。

按照该方法的又一个有利实施例，为了制备合成瑞格列奈的中间体，酶水解反应是在通过使用缓冲溶液进行控制的受控的pH值下进行的，该缓冲溶液是基于磷酸盐，碳酸盐或硫酸盐的水溶液，pH值控制在6和8之间。更一般地，缓冲溶液的pH值不影响所用酶的活性。

特别地，缓冲溶液是pH值约等于7.2的水溶液。

按照本发明一个具体实施例，该缓冲水溶液可通过使用基于磷酸盐，碳酸盐或硫酸盐的水溶液来获得，其初始pH值调节在6和8之间。这样的缓冲水溶液商业上可获得。

按照一个实施例的变型，使用特别基于磷酸钾的初始pH值约为7.2的缓冲水溶液。

按照本发明另一个特定实施例，该方法特征为通过添加强碱如碱金属的氢氧化物或醇盐的水溶液，在方法过程中控制pH值维持在6和8之间。

强碱溶液的浓度(normalité，当量浓度)要实现pH值的令人满意的调节，使得能够保持酶的活性。

按照一个有利的实施例，为了确保保持酶活性并避免在制备瑞格列奈中具体在位置1的第二酯官能团的显著水解，通过添加强碱，如碱金属的氢氧化物或醇盐实现反应介质pH值的控制。

优选地，pH值的控制是通过添加氢氧化钠溶液，更具体是氢氧化钠水溶液执行的。碱溶液的浓度要实现pH值的令人满意的调节，使得能够保持酶活性。

按照本发明该方法的一个有利实施例，其特征为酶水解反应是在10℃到70℃之间的温度，优选在约45℃进行。

按照本发明另一个有利实施例，起始物质的初始浓度在1kg/l和50g/l之间，并优选在500g/l和50g/l之间，且初始浓度非常优选在约400g/l。

更一般地，起始物质的初始浓度有利地在基本最大值，以便既提供产物在所选溶剂中的溶解性又不削弱酶活性。

在用来实现选择性酶水解的酶中，包括脂肪酶，酯酶，蛋白酶，固定化脂肪酶(chirazymes)，和胰酶。

所用的酶可以是固体形式，在溶液中，在悬浮液中或在惰性载体上固定化。

可以以商业购买的形式直接使用酶，或提纯后使用。

示例性的而非限制性的，本发明中可使用的酶是从脂肪酶中选择的，脂肪酶是从曲霉菌(Aspergillus)(黑曲霉(Aspergillus niger)，蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)，宇佐美曲霉(Aspergillus usamii))获得的，从根霉(Rhizopus)(米根霉(Rhizopus oryzae)，雪白根霉(Rhizopus niveus)，根酶菌(Rhizopus sp.)，爪哇根霉(Rhizopusjavenicus)，Rhizopus delegar，戴尔根霉(Rhizopus delemar))获得的，从青霉菌(娄地青霉(Penicillium roquefortii)，卡门柏青霉(Penicillium camembertii)，圆弧青霉(Penicillium cyclopium))获得的，从毛霉(冻干的或承载的米黑毛霉(Mucor miehei)(固定化脂肪酶L9)，爪哇毛霉(Mucor Javanicus)，Mucor Javenicus)获得的，从假丝酵母(南极假丝酵母(Candida antarctica)，A型冻干的或承载的南极假丝酵母(固定化脂肪酶L5)，B型冻干的或承载的南极假丝酵母(固定化脂肪酶L2)，圆柱念珠菌(Candidacylindraceae)，解脂假丝酵母(Candida lipolytica)，皱褶假丝酵母(Candida rugosa))获得的，从假单胞菌(Pseudomonas)(荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，洋葱假单胞菌(Pseudomonascepacia)，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，假单胞菌物种)获得的，从产碱杆菌(Alkaligenes)(产碱杆菌物种)获得的，从腐质霉(Humicola)(柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)，柔毛腐质霉脂肪酶(Humicola sp.Lipase))获得的，从地丝菌(Geotrichum)(白地霉(Geotrichumcandidum))获得的，从胰腺(山羊胰腺，猪胰腺)获得的，从无色杆菌(Achromobacter)(无色杆菌物种(Achromobacter sp.))获得的，从嗜热真菌(Thermomyces)(棉毛嗜热真菌(Thermomyceslanuginosus))获得的，和从伯克霍尔德菌(Burkholderia)(洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia))获得的。

在其他脂肪酶中，还包括，示例性的而非限制性的，脂肪酶F14，脂肪酶F10，脂肪酶F12，脂肪酶A1，脂肪酶F7，脂肪酶F13，脂肪酶F8，脂肪酶F2，脂肪酶F3，Amano 6，脂肪酶AP15，脂肪酶F，Amano 50，脂肪酶G，脂肪酶F4，脂肪酶F6，脂肪酶B1，脂肪酶PS-D1，脂肪酶PS-C2，脂肪酶1，脂肪酶1，脂肪酶2，Euroform脂肪酶4，脂肪酶4，脂肪酶6，脂肪酶7，脂肪酶10，脂肪酶11，脂肪酶12，脂肪酶13，脂肪酶14，脂肪酶15，脂肪酶18，脂肪酶20，脂肪酶PGE，Ap-6和丽波脂肪酶(Lipolase)。

作为非限制性例子中，本发明也可以使用从酯酶，猪肝酯酶(PLE)，阿魏酸酯酶，帕罗西汀(paroxetine)酯酶和皱褶假丝酵母酯酶中选择的酶。

作为非限制性例子，本发明也可以使用从下列酶中选择的酶，即蛋白酶，从链霉菌(灰色链霉菌(Strepomyces griseus)，嗜热链球菌(Streptomyces serine))、枯草杆菌蛋白酶、(枯草溶菌素(Subtilisin carlsberg))，杆状菌(芽孢杆菌(Bacillus sp.)，豆形杆菌(Bacillus lantus)，脂肪嗜热芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus))和番木瓜属(番木瓜(Carica papaya))的混合物中获得的酶。

作为非限制性例子，按照另一个实施例变型，也可以使用从固定化脂肪酶，固定化脂肪酶L-8，固定化脂肪酶L-2，固定化脂肪酶L-2，固定化脂肪酶L-5，固定化脂肪酶L-10和固定化脂肪酶E1中选择的酶。

作为非限制性例子，按照另一个实施例变型，也可以使用从另一类酶中选择的酶，即Deamizye 50000，胰酶，Depol(Depol 222P，Depol 454P，Depol 39，Depol 112L，Depol 40L，Depol 165L，Depol239P，Depol 260P，Depol 333P，Depol 276P，Depol 39P)，Promod(Promod 215P，Promod 31L，Promod 192P，Promod 144P，Promod194P)，Combizyme(Combizyme 261P，Combizyme 274P，Combizyme108，Combizyme 23，Combizyme 209)，Flavopro(Flavopro 192P，Flavopro 373P，Flavopro 373P(X))，Macer8(Macer8 O，Macer8 R，Macer8 W，Macer8 FJ)，果胶酶(Pectinase)(果胶酶62L，果胶酶444L)，Lipomod 29P，肽酶433P(Peptidase 433P)，脂氧酶(Lipoxygenase)L583P，纤维素酶(Cellulase)13L，氨基酰化酶(Aminoacylase)，漆酶(Laccase)L603P，乳糖酶(Lactase)L017P，半纤维素酶(Hemicellulase)344P，TP599P，SP398，复合多糖酶(Viscozyme L)，木聚糖酶(Shearzyme)500L，Ultrazyme AFP-L，Peelzyme 1，Ultroflo L，Ultroflo L C809，SP525，树脂清除酶(Resinase)A和Validase TR。

这些酶可从下列公司购买，即Sigma，Amano，Europa，Biocatalysts，Boehringer，Novo-Nordisk，Biotal，Enzymatix，Fluka，Genecore，Novozymes等。

作为非限制性例子，按照另一个实施例变型，也可在本发明方法中使用测试的商业酶，固定化圆柱念珠菌(Candida cylindracea)(Sigma)，固定化B型南极假丝酵母(Candida Antarctica B)或Novozyme 435(Novozymes)，固定化米黑毛霉(Mucor miehei)(Fluka)，固定化洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)或PSD1(Amano)，门多萨假单胞菌(Pseudomonas menodicina)或Lumafast(Genecore)，疏毛腐质霉(Humicola lanuginose)或丽波脂肪酶(Lipolase)，黑曲霉或AP6(Amano)，卡门柏青霉(Penicilliumcamembertii)或脂酶G(Lipse G)(Amano)，麦芽(Wheat germ(Fluka))或雪白根霉。

优选，所选的酶是脂肪酶，如具体地，从B型南极假丝酵母获得的酶，例如从Novozymes公司购买的Novozyme 435。

按照本发明另一个实施例，所用的酶的量与底物的量的比(表示为重量/重量值)(E/S比)在1/10000和20/100之间，并优选在1/1000和5/100之间。

按照本发明又一个实施例，酶浓度可以在0.001g/l和100g/l之间，并优选在1g/l和10g/l之间。

按照特定实施例变型，酶温育时间在10分钟到4天之间，并优选在0.5和24小时之间。

按照本发明又一个特定实施例变型，单独或作为混合物可选使用的有机助溶剂可以是，但不限于亚砜，如二甲亚砜(DMSO)，腈，如乙腈，醇，如乙醇，叔丁醇或异丙醇(IPA)，氨基化合物，如二甲基甲酰胺(DMF)，醚，如乙醚，碳氢化合物，如己烷，或芳香族化合物，如甲苯。

助溶剂的浓度可以在0.01％到30％之间。

一旦在反应过程中被除去，酶可再次在本发明方法中使用。

更一般地，酶使用的循环次数可在1次到5次之间，优选在1次到3次之间。

定义

下面的定义可用于本发明的说明书和权利要求。

为了帮助理解，基团、试剂、溶剂或产品的术语是国际术语或本领域技术人员通用术语。

术语“烷基”表示1到10个碳原子构成的线性或支链烷基链。

术语“烷氧基(alkoxide，醇盐)”表示1到10个碳原子形成的线性或支链烷氧基基团。

术语“碱金属”表示钠或钾原子。

本发明的其他目的，特征和优点可从下面参考本发明几个实施例的解释性说明中明显看出，这几个实施例仅示例性给出，而非对本发明范畴做任何限制。

在实施例中，除非另外指出，百分数都是重量百分数，温度是摄氏温度，压力是大气压。

为了帮助理解，所用产品的术语是国际术语，且试剂或溶剂的术语都是本领域技术人员通用的。

本发明实施例1：4-羧甲基-2-乙氧基苯甲酸乙酯的制备

分子式(I)的化合物，其中R是乙基。

脂肪酶：Novozyme 435。

缓冲溶液：0.2M的磷酸钾水溶液，pH值7.2。

酶用量为10mg。

反应是1ml的量在4ml玻璃烧瓶中密封进行的。

通过相对所用起始物质的量调整缓冲溶液容积，反应容积被设定为1ml。

反应是在45℃进行的。

实施例1a)：50mg二酯(浓度50g/l)。

反应1小时50分钟后，获得100％的转化率。

实施例1b)：100mg二酯(浓度100g/l)。

反应2小时50分钟后，获得100％的转化率。

实施例1c)：200mg二酯(浓度200g/l)。

反应3小时50分钟后，获得80％的转化率。

本发明实施例2：4-羧甲基-2-乙氧基苯甲酸乙酯的制备

分子式(I)的化合物，其中R是乙基。

脂肪酶：Novozyme 435。

缓冲溶液：0.1M的磷酸钾水溶液，pH值7.2。

pH值控制：2.5M NaOH水溶液。

反应在100ml玻璃烧瓶中密封进行的。在10ml磷酸盐缓冲液中加入3.86g(13.8mmol)二酯，并加入0.2g酶。

介质被加热到45℃。

通过有规则地加入氢氧化钠溶液把pH值保持在7.2。

反应1小时35分钟后，获得100％的转化率。

过滤除去介质中的酶。温水洗涤沉积物。收集滤液，并且滤液用20％的盐酸(HCl)溶液酸化，直到pH值为3.5。

搅动介质然后在冰浴中冷却1小时。形成的沉淀被滤去，然后在45℃干燥，直到重量恒定。

所获得的产物是白色固体。

产量：定量的

纯度：99.3％。

本发明包括构成上述方法等效手段的所有方法及其不同组合。根据以上包括实施例的描述，相对现有技术新颖的任何技术特征，以其功能并作为一般方法，构成本发明的组成部分。

Claims (22)

1.根据下面示意图A合成分子式(I)的化合物的方法：

示意图A

其中R1，R2和R3相同或不同，分别独立表示烷基基团，其特征在于，一种酶水解反应包括将分子式(II)的化合物与酶接触，所述酶仅对分子式(II)的化合物的两个酯官能团中的一个进行化学选择性水解，以便获得所述分子式(I)的化合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水解反应是在有或没有有机助溶剂的情况下，在pH值受控制具体地通过利用缓冲溶液控制的溶液中进行的。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所使用的酶选自脂肪酶、酯酶、蛋白酶、固定化脂肪酶和胰酶。

4.根据权利要求1、2和3中任一项所述的方法，其特征在于，所使用的酶是脂肪酶。

5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其特征在于，所使用的酶以固体形式、或以溶液、或以悬浮液、或以固定在惰性载体上的形式存在。

6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于，所选的酶可以商业购买的形式直接使用或在提纯后使用。

7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在反应过程中控制所述pH值，以便所述酶的活性不受该pH值影响，具体地，该pH值在反应过程中被保持在6到8之间。

8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所选酶的循环使用的次数在1到5之间。

9.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所使用的酶的量与底物的量的比(E/S比)以重量/重量值表示在1/10000到20/100之间，并优选在1/1000到5/100之间。

10.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述起始物质的初始浓度在1kg/l到50g/l之间。

11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述酶水解是在10℃到70℃之间的温度进行的。

12.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述反应介质的pH值的控制是通过添加强碱，特别是碱金属氢氧化物或醇盐实现的。

13.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，没有有机助溶剂。

14.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，每个基团R1、R2和R3同时是乙基。

15.根据权利要求1到14中任一项所述的方法，其特征在于，所使用的酶是从B型南极假丝酵母获得的脂肪酶。

16.根据权利要求1到15中任一项所述的方法，其特征在于，缓冲溶液是pH值在6到8之间的基于磷酸盐、碳酸盐或硫酸盐的水溶液，特别是基于磷酸钾的水溶液。

17.根据权利要求14、15和16中任一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液的初始pH值为约7.2。

18.根据权利要求14到17中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应温度优选为约45℃。

19.根据权利要求14到18中任一项所述的方法，其特征在于，所述分子式(II)的起始物质的初始浓度为约400g/l。

20.根据权利要求14到19中任一项所述的方法，其特征在于，所述pH是通过添加强碱水溶液，特别是氢氧化钠水溶液来控制的。

21.根据权利要求14到20中任一项所述的方法，其特征在于，酶的量在1g/l到10g/l之间。

22.根据权利要求14到21中任一项所述的方法，其特征在于，所述分子式(I)的化合物用作用于制备瑞格列奈的合成中间体。