CN101643744A

CN101643744A - 一种快速筛选高效表达抗菌肽酵母工程菌的新方法

Info

Publication number: CN101643744A
Application number: CN200910062860A
Authority: CN
Inventors: 马向东; 胡凡
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2009-06-30
Filing date: 2009-06-30
Publication date: 2010-02-10
Anticipated expiration: 2029-06-30
Also published as: CN101643744B

Abstract

本发明提出了一种快速筛选高效表达抗菌肽酵母工程菌的新方法，其方法为：1.构建抗菌肽基因和伴侣蛋白基因进行融合的质粒，2.酶切使质粒线性化，3.电穿孔转化到毕赤酵母感受态菌体，利用营养缺陷筛选，28℃培养36－48小时，4.直接从初筛平板上获得水解圈大的转化子，也就是初步获得表达抗菌肽高的酵母工程菌。然后经过复筛可以从大量的转化子中获得高效表达抗菌肽的工程菌。本发明实验过程简单，易操作。可把整个筛选过程缩短5－6天。大大减少人力、物力和财力的支出。本发明适合于不易于或者不能采用功能法进行筛选的抗菌肽、酶、抗体、多肽等蛋白质在酵母中表达的工程菌。

Description

一种快速筛选高效表达抗菌肽酵母工程菌的新方法

技术领域

本发明涉及的是生物工程菌高效表达筛选技术，特别适用于不能直接利用功能筛选的多肽、蛋白质等表达产物，或者筛选非常复杂，需要消耗大量时间的表达产物。特别适合用于大规模、短时间内、大量地筛选高效表达抗菌肽的酵母工程菌。

背景技术

抗菌肽是宿主防御系统产生的一类抵抗外界病原体感染的肽类物质，是宿主免疫防御系统的重要组成部分。抗菌肽不仅具有广泛的抗菌谱，而且有抑制癌细胞生长的作用及不易产生耐药性的特点，这使得抗菌肽开发利用成为近来的研究热点。但抗菌肽的开发利用并非易事，抗菌肽天然资源有限，提取非常复杂；化学合成，不但成本很高，还对环境造成严重污染；因此迫切需要一种廉价安全的生产技术来生产抗菌肽。基因工程生产方法是满足这种需要的一种合适途径。

目前抗菌肽基因工程表达主要在大肠杆菌和酵母菌系统中进行。酵母菌表达体系具有直接分泌抗菌肽的能力，易于直接从发酵液中分离抗菌肽，相比大肠杆菌表达体系更易于大规模工业化生产；但是由于抗菌肽分子量小(一般小于5kDa)，表达效率并不高；如何筛选高效表达抗菌肽的酵母工程菌成为了抗菌肽事业发展的瓶颈。

在酵母菌中表达基因工程产物，筛选高表达的工程菌是个必不可少的实验环节，对于筛选抗菌肽的高效表达工程菌，通常有两个方法，一，由于抗菌肽有特殊的抗菌活性，故可以采用管蝶法筛选。如果利用管蝶法，那么每次就要对成千上万的转化子进行鉴定，先对每个转化子进行初步筛选，即先将每个转化子都进行摇瓶(一般为5-6天)，然后再取发酵液，利用管蝶法对发酵液的抗菌能力进行鉴定，最后将每次筛选得到抗菌活性相对较高工程菌，再来进行复筛，这样要消耗大量的人力和物力。另外一个方法就是利用遗传霉素或者玉米素等抗生素方法来筛选多拷贝的酵母菌。酵母分泌载体上一般都有编码可以分解这些抗生素的基因，由于酵母分泌载体是整合到染色体上的，理论上如果酵母菌能够分解高浓度的抗生素，那么染色体上就存在多个拷贝的分泌表达载体，也就有可能是高产菌，但研究表明能够在高浓度抗生素上生长的酵母菌并不直接与高表达酵母菌对应，也就是说虽然拷贝数很高，能够分解高浓度的抗生素，也不一定是目的产物的高产菌；我们的研究也证实了这个结论，我们在实验中筛选到一株抗性提高了10倍的酵母工程菌，但抗菌肽的效价却没有提高。拷贝数的多少虽然在理论上与分解抗生素的能力有线性关系，但是，由于抗生素的表达和目的蛋白的表达并不属于同一顺反子，所以目的蛋白表达量的高低和拷贝数并不成线性关系。本研究采用甘露聚糖酶基因和抗菌肽构建成融合蛋白，使其属于同一顺反子中，一分子的甘露聚糖酶就对应一分子的融合抗菌肽，这样就可以利用甘露聚糖酶的活性来指示抗菌肽的表达量，酵母菌在分泌表达融合基因的同时，将融合基因切割成甘露聚糖酶和抗菌肽，这样用显色法直接观察甘露聚糖酶活的大小，从而直接判断抗菌肽产生量的多少，这样就可以初步快速筛选到产生抗菌肽的高产酵母菌株。

发明内容

本发明的目的是提出一种快速高效筛选高产抗菌肽的酵母工程菌的方法，该法可直接通过伴侣蛋白酶活力的大小来判断抗菌肽产量的高低，为抗菌肽高产酵母菌的筛选提供了一个好方法。

本发明的步骤为：

1.质粒的构建，将抗菌肽基因和伴侣蛋白基因进行融合，中间添加一个酵母自生可识别的切割位点，将融合基因克隆至酵母分泌表达载体pHBM905多克隆位点。

2.酶切使质粒线性化。

3.电穿孔转化，利用营养缺陷筛选，28℃培养36-48h。

4.根据酶水解圈的大小，筛选水解圈大的菌落。也就是此次产生抗菌肽产量高的菌落。

5.将每批筛选到的可能高产菌株集中进行复筛，并验证产生抗菌肽的高产菌株。

本发明的基本原理和特点：

本发明打破了常规筛选的方法必须经过测定抗菌肽活性的思路，采取直接观察伴侣蛋白对底物水解的可观察特征对抗菌肽产生高产菌株进行筛选，节省了大量初筛时间，极大地提高了筛选效益。

本发明实验过程简单，易操作；可把一轮的筛选过程缩短5-6天。极大减少人力、物力和财力的支出。本发明适合于任何利用功能，就可直接简单的进行酶或者蛋白质的分辨，用来指示不易于或者不能采用功能法进行直接筛选的抗菌肽、酶、抗体、多肽等蛋白质在酵母中的表达。

本发明和常规的方法如管碟法初筛相比，减少了工程菌的培养和抗菌肽产生的测定操作，最少节约时间5-6天；同时极大地减少了庞大的初筛选工作量；对于利用抗生素筛选，可以极大的减少抗生素的用量，弥补了由于抗生素浓度提高带来的样本量不足的缺点。

附图说明：

图1：酵母分泌载体pHBM306的图谱，

图2：重组子酶活大小图，通过甘露聚糖酶的酶活初步筛选表达量大小不同的重组酵母菌，

图3：发酵液甘露聚糖酶酶活测定图，挑取水解圈大小不同的4个酵母菌(a、b、c、d)，进行小规模摇瓶后，测定其甘露聚糖酶酶活。

具体实施方式

A材料

1.菌种和质粒

毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115购自Invitrogen公司，质粒pHBM905-man、pET23a-9elp-hal18、pHBM905-man-hal18和pHBM306由实验构建。

2.试剂

限制性内切酶、One-step ligation kit，LA Taq酶，四种dNTP购自TaKaRa公司，YNB购自Diffco公司，DNA gel extraction kit购自AXYGEN公司，甘露聚糖，曲利苯蓝购置sigma，其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。

B：实施筛选高效表达抗菌肽的工程菌

1.酵母分泌性表达载体pHBM306的构建：

将9elp-hal18中抗菌肽基因克隆到pHBM905-man的下游，使其与man融合，重组酵母分泌表达质粒命名为pHBM306

2.毕赤酵母感受态细胞制备

1.接种单菌落GS115于5mL YPD液体培养基中，30℃，200rpm培养过夜；

2.将0.2mL过夜培养物接种到含有50mL新鲜YPD培养基的500mL三角瓶中，30℃、200rpm过夜培养至OD600为1-2；

3.将细胞培养物于4℃，5000rpm离心10min收集菌体，弃上清；

4.将菌体重悬于50mL预冷的无菌水中，4℃，5000rpm离心10min，弃上清；

5.菌体重悬于25mL预冷的无菌水中，4℃，5000rpm离心10min，弃上清；

6.将菌体重悬于20mL预冷的1mol/L山梨醇中，4℃，5000rpm离心10min，弃上清；

7.将沉淀重悬于10mL预冷的1mol/L山梨醇中，4℃、5000rpm离心10min，弃上清；

8.最后重悬于1mL预冷的1mol/L山梨醇中，细胞的最终浓度为10¹⁰细胞/mL，最体积约为1.3mL；

注：制好的备转化菌株可以分装80ul/管，于-70℃保存。但电转化的效果会有所下降。

3.质粒线性化

利用Scl I对pHBM306进行线性化酶切，利用DNA gel extraction kit对酶切产物进行回收

4.毕赤酵母的电击转化

1)将构建好的表达载体用相应的限制性内切酶线性化，回收后备用。

2)将5～20μg的线性化DNA溶解在5-10μlTE溶液中，与80μl的新鲜毕赤酵母感受态菌体混匀，转至预冷的电转化杯中。

3)将电转化杯冰浴5min。

4)根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，(一般是1.5KV，25μF，200欧姆，放电时间在4.5-4.9ms)，按优化的参数，进行电击。

5)电击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的离心管中。

6)将菌体悬液涂布于MD平板上，每200μl涂布一块平板。将平板置于30℃培养，直至单菌落出现。

5.转化子的初筛

挑取转化子至含甘露聚糖和曲利苯蓝的平板，甲醇诱导30℃培养24小时，观察水解圈的大小。见图2，选取大小不同的a、b、c、d水解圈，甘露聚糖酶酶活测量见图3、检测数据见表一。

表一：四株酵母发酵后纯化所得融合蛋白抗菌肽的含量

编号	a	b	c	D
编号	a	b	c	D	融合抗菌肽	448.5mg/L	336.7mg/	275.3mg/L	0.23mg/L

表一的结果是图三的直接说明，证明了圈的大小与分泌表达融合抗菌肽的线性关系，及圈的大小可以直接用来衡量融合抗菌肽产量的高低，圈大产量高，圈小表达量低

6.复筛验证获得高效表达目的产物的工程菌

选取不同批次获得的大水解圈的菌株进行水解圈大小检测，获得水解圈最大的一组菌株，然后进行验证。

选取一批大水解圈的菌株接种于50mL BMGY液体培养基中(按≤10％装瓶)，28℃，250rpm培养至OD₆₀₀＝20。收集菌体，去上清，细胞沉淀全部转移至25mL BMMY液体培养基中，250rpm，28℃培养。每隔24小时补加甲醇至终浓度1％进行诱导。

1)挑取单克隆，接种至含50ml BMGY的500ml摇瓶中，28-30℃，250-300rpm培养36小时；

2)用灭菌离心管，室温5000rpm离心10min收集细胞。用25mlBMMY重悬细胞，加入1％甲醇进行诱导；

3)每24小时，加甲醇至1％浓度；

4)144小时后，5000rpm离心10min收集细胞。保留上清，置于4℃预冷，

如需要可进行浓缩。接下来进行蛋白纯化或将上清存于-80℃备用。测定抗菌肽的效价，最后筛选到抗菌肽高产菌株。

Claims

1、一种快速筛选高效表达抗菌肽酵母工程菌的新方法，其特征步骤为：

1).质粒的构建，将抗菌肽基因和伴侣蛋白基因进行融合，中间添加一个酵母自生可识别切割位点，将融合基因克隆至酵母分泌表达载体pHBM905多克隆位点，构建的表达载体为pHBM306，

2).酶切使质粒线性化，

3).电穿孔转化，利用营养缺陷筛选，28℃培养36-48小时，

4).根据酶水解圈的大小，初步筛选水解圈大的菌落。也就是此次产生抗菌肽产量高的菌落，

5).将每批筛选到的可能高产菌株集中进行复筛，获得水解圈最大的菌落，最后经过验证获得抗菌肽表达高产工程菌。