CN101642565B - 血红蛋白类氧载体冻干制剂的制备方法 - Google Patents
血红蛋白类氧载体冻干制剂的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101642565B CN101642565B CN200810150561A CN200810150561A CN101642565B CN 101642565 B CN101642565 B CN 101642565B CN 200810150561 A CN200810150561 A CN 200810150561A CN 200810150561 A CN200810150561 A CN 200810150561A CN 101642565 B CN101642565 B CN 101642565B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- freeze
- oxygen
- protein
- protective agent
- haemoglobin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 72
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 71
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 title claims abstract description 71
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 71
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 57
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 claims abstract description 48
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 37
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 37
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 16
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims description 51
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims description 51
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 40
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 40
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 35
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 35
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 claims description 13
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 claims description 13
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 12
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 10
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 8
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 claims description 8
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 32
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 18
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 71
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 71
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 66
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 36
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 30
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 26
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- -1 ice carbohydrate Chemical class 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 16
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 14
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 10
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 10
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 10
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 9
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 7
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 4
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 4
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 4
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 4
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 230000005496 eutectics Effects 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 4
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 4
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 108010061951 Methemoglobin Proteins 0.000 description 3
- 108010064719 Oxyhemoglobins Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 3
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-M Aminoacetate Chemical compound NCC([O-])=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001237 Raman spectrum Methods 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 2
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 2
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 2
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 2
- 230000002633 protecting effect Effects 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 2
- 108010022579 ATP dependent 26S protease Proteins 0.000 description 1
- 238000004483 ATR-FTIR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108010001394 Disaccharidases Proteins 0.000 description 1
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001157 Fourier transform infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 229940088382 Nitric oxide scavenger Drugs 0.000 description 1
- 241001597008 Nomeidae Species 0.000 description 1
- 229940123973 Oxygen scavenger Drugs 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 238000005102 attenuated total reflection Methods 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 239000003633 blood substitute Substances 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940105305 carbon monoxide Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 229920005556 chlorobutyl Polymers 0.000 description 1
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000003360 curve fit method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 229940056582 human hair preparation Drugs 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWNIBLMWSKIRAT-VFUOTHLCSA-N levoglucosan Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2CO[C@@H]1O2 TWNIBLMWSKIRAT-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229960005337 lysine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- JVBXVOWTABLYPX-UHFFFAOYSA-L sodium dithionite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])=O JVBXVOWTABLYPX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 229960004532 somatropin Drugs 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007811 spectroscopic assay Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000002910 structure generation Methods 0.000 description 1
- 238000009923 sugaring Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
一种血红蛋白类氧载体冻干制剂的制备方法，该方法包括预冷前处理，预冷，预冻，升华干燥以及保存五个步骤，其中预冷前处理阶段加入了特殊的单一保护剂或复合保护剂，制备得到的血红蛋白类氧载体冻干制剂稳定性高，可常温储存，运输方便，且复溶于水后可基本保持其正常的生理活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种冻干制剂的制备方法，具体涉及一种血红蛋白类氧载体冻干制剂的制备方法。
背景技术
获得较稳定且易于运输的蛋白质药品的方法通常将其制备成固体制剂，最常用的方法是真空冷冻干燥(vacuum freeze drying)法，但在冷冻干燥过程中存在着引起蛋白质不同程度变性的不利因素，如该过程存在着各种各样的应力，通常包括低温应力、冻结应力(包括枝状冰晶的形成、离子强度的增加、pH值的改变、相分离等)、干燥应力(移去蛋白质表面单层水分子)等，这些应力常常直接或间接导致蛋白质药物变性。因此，分析在冷冻干燥过程中导致蛋白质变性的因素并在此基础上采取相应的措施，如加入适当的保护剂，优化冷冻干燥过程等，有利于生产出高质量的蛋白质药品。
冷冻干燥就是将需干燥的物料在低温下先行冻结至其共晶点以下，使物料中的水分变成冰，然后在适当的真空环境下，使冰升华为水蒸汽，再用真空系统的冷阱将水蒸汽冷凝，从而获得干燥制品的技术。
整个冷冻干燥过程大致可以分为三个步骤，即预冻结阶段，升华干燥阶段和解析干燥阶段。
(1)预冻结阶段
在此阶段，物料中的自由水分被固化，使干燥后的产品和干燥前的形状大致相同，同时防止在抽真空、干燥时起泡、浓缩、收缩等不可逆变化的产生，并减少因温度下降引起的物质可溶性降低和活性特征的变化。
(2)升华干燥阶段
将冻结后的产品置于冷冻干燥仪内，在真空下冰晶就会升华成水蒸汽逸出而使产品脱水干燥。干燥时干燥面是从外表面开始逐步向内部推移的，冰晶升华后残留下来的空隙变成后续升华的水蒸汽的逸出通道。当全部冰晶除去时，升华干燥阶段完成，此时除去样品中大约90％左右的水分。
(3)解析干燥阶段
解析干燥阶段主要是去除部分结合水，这部分水主要通过范德华力、氢键等弱分子相互作用吸附在样品上，除去它们需要更多的能量，因此此阶段需要的温度和真空度都要足够高。升华干燥阶段后样品残留水分通常在10％左右，解析干燥阶段后残余水分一般应低于2％。冻干样品中的残留水分对其质量影响很大，残留水分过多，药物容易失活，稳定性差，无法长期保存。为控制冻干样品中残留水分，该干燥阶段应在能够保持样品活性的条件下选择能允许的最高温度，真空度也应该尽可能提高。
因冷冻干燥引起的蛋白质药物变性，可以应用x-射线衍射、圆二色谱(Circular Dichroism，CD)、核磁共振(NMR)、红外光谱(IR)、拉曼光谱(Raman)以及荧光和紫外光谱等技术来研究，以得到蛋白质构象变化的信息。这些技术各有其优势和局限性。
X-射线衍射技术是最准确和最可靠的，但它需要制备合格的晶体，因而此项技术的工作量大，成功率低，而且无法测定不同生理条件对蛋白质结构的影响。核磁共振技术能给出丰富的蛋白质分子结构信息，但一般只能测定分子量15～25KD的蛋白质的结构。测定溶液状态下蛋白质的结构多用圆二色谱法，但由于圆二色谱法是建立在已知三维结构的聚多肽和蛋白质光谱为参考的基础上的，仅在含α-螺旋成份较多的二级结构测定中较为准确，而且只能应用在很窄浓度范围的澄清溶液中。荧光和紫外光谱只能测定蛋白质分子中少数带有发色团的氨基酸残基(如Trp，Tyr等)。拉曼光谱与红外光谱是没有任何遮蔽效应的不破坏样品的技术，可提供丰富的蛋白质结构信息。适用于不同状态、不同浓度及不同蛋白质和多肽的测定。
傅立叶变换红外光谱(FTIR)是近年来发展起来的一种新的分析测试技术，与传统的光栅型红外光谱仪相比，它具有操作简便、波长精度高、分辨率好，扫描速度快、灵敏度高等优点。FTIR还具有样品用量较少，蛋白质分子的大小几乎无影响，没有光散射和荧光的影响及使动力学性质的研究成为可能等优点。
一般蛋白质的红外光谱的谱带主要有3大类：①所有蛋白质谱中均有氢键化的氨基或羧基等活性基团的特征吸收带(3300cm-1附近)；②位于1700~1500cm-1的酰胺I带和酰胺II带；③由组成蛋白质的氨基酸性质所决定的各类吸收。其中，在1700-1600cm-1的酰胺I带(Amide I)及1600-1500cm-1处的酰胺II带(Amide II)可用于归属蛋白质的二级结构并探讨其内部氢键结合的情况，所以对它研究得也最多。
FTIR的再造性强，随着变性条件的改变，利用FTIR谱可以观测到蛋白质结构中的微小变化，并可将这些变化归属为其二级结构的改变。FTIR适合于多种物相的测定，无论是气体、液体，还是固体，或者薄膜都可以进行测定。FTIR作为调制光谱，还有其独特的优越性：高的分辨率，高的灵敏度，高的信噪比，准确的频率精度。这些特点使得二阶导数，去卷积技术可以应用于FTIR上，因而可以把原来酰胺I带中未能分辨的峰进一步分解为多个子峰，并指出各个子峰的峰位，通过曲线拟合的方法，可以定量的分析蛋白质中各二级结构的含量。
常见的FTIR分析方法有：因数分析法(Factor Analysis，FA)，奇值分解法(Singular Value Decomposition，SVD)，傅立叶自去卷积法(FourierSelf-Deconvolution，FSD)，二阶导数法(Second Derivative，SD)和曲线拟和法(Curve Fitting)等。后来出现了偏最小二乘法(Partial Least SquaresMethod，PLS)。随着傅立叶红外光谱仪及其联用技术的发展和计算机辅助解析方法的出现，使得红外光谱在研究蛋白质二级结构变化方面也取得了很大的进展。
冷冻干燥可能会使蛋白质红外光谱发生变化。Prestrelski等人发现在冷冻干燥过程中，蛋白质伸展会使酰胺I带峰向高波数移动，并且峰变宽。Costantino等人还发现冷冻干燥会使β-折叠增加，伴随α-螺旋结构减少。而α-螺旋结构转变成β-折叠，表明了蛋白质聚集或是分子间相互作用增强。所以冷冻干燥前后蛋白质红外光谱变化程度能反映蛋白质变性程度。从国内外的研究成果来看，FTIR是一种研究蛋白质变性过程中二级结构变化的有效、简捷的方法。随着光谱技术的发展，如衰减全反射红外谱(ATR-FTIR)，二维相关红外谱(2D-FTIR)等的应用，使得研究的广度和深度有了进一步的拓展。但因蛋白质的二级结构很复杂，且进行光谱测定时的影响因素较多，所以在酰胺I带子峰的准确归属上还存在着一定的争议，尚待进一步的研究和探讨。
综上所述，冷冻与干燥都会使蛋白质药物产生不同程度的变性。因此，在冷冻干燥蛋白质药物的过程中，一般要加入保护剂。根据保护剂对抗应力的不同，可把蛋白质保护剂初步分为冷冻保护剂和冻干保护剂。一个优良的蛋白质保护剂不仅能够在整个冻干过程中对蛋白质药物起到良好的保护作用，而且能够对成品贮藏期内蛋白质药物的变性起到抑制作用，因为蛋白质药物在贮藏期的变性率往往比在整个冻干过程中的变性率要大。多数在溶液中很有效的蛋白质冷冻保护剂对干燥态的蛋白质并无保护作用，甚至还会加速蛋白质药物的不稳定化。而在干燥过程中对蛋白质起保护作用的保护剂也可能对冷冻状态下的蛋白质起不到任何保护效果，为了增强保护作用，常常需要在冻干制品中使用两种类型以上的保护剂。常用的保护剂种类有多羟基化合物、糖、蛋白质、聚合物、氨基酸、胺、表面活性剂等。
糖和多羟基化合物：许多糖和多羟基化合物可被用来作为药品冻干时的保护剂，如海藻糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇等，它们共同的特点是分子中都具有多个自由羟基，这些自由羟基可以与蛋白质形成氢键以取代水，保证了蛋白质的稳定性；在溶液中它们易结合水分子，发生水合作用，减少了游离水的含量并增加了溶液的粘性，从而减缓晶核的生长过程，使形成的球晶较细小，从而起到保护的作用。
聚合物：血清白蛋白是应用最普遍的聚合物之一，它同时具有冷冻保护和干燥保护的双重作用，但因其为血液制品，可能具有潜在的污染，因而应用受到限制。右旋糖酐等聚合物可提高蛋白质玻璃化温度、抑制赋形剂(如蔗糖)结晶，从而起到保护作用。
氨基酸：是常见的蛋白质保护剂之一，它同时具有冷冻保护和干燥保护的双重作用。低浓度的甘氨酸可通过抑制10或100mmol/l磷酸缓冲盐结晶所致pH值的改变而阻止蛋白质药物变性。无定型甘氨酸可阻止冻干过程中重组人生长激素的聚集；结晶型甘氨酸能升高成品的塌陷温度，阻止因塌陷而引起的蛋白质药物的破坏。常用的氨基酸类蛋白质保护剂有脯氨酸、L-色氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、L-酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等。
表面活性剂：冷冻时冰-水界面的形成可引起蛋白质表面诱导变性，表面活性剂可使蛋白质溶液表面张力下降，减少冰-水界面蛋白质吸收和聚集的驱动力。聚乙二醇(PEG)和吐温80是药品冻干过程中应用最多的表面活性剂。
蛋白质保护剂的作用机制分为冷冻保护机制和干燥保护机制两种。前者中优先交互作用是公认的一个蛋白质稳定机制，该作用是指在水溶液中蛋白质优先与水产生相互作用或是优先与辅料产生相互作用。当水溶液中存在对蛋白质有稳定作用的辅料时，蛋白质则优先与水结合(优先水合作用)，而具有稳定作用的辅料则优先从蛋白质域内排除出来。这样使得蛋白质表面稳定剂浓度比溶液中稳定剂的总体浓度低，表面张力增加，蛋白质的化学势升高而提高了结构上的稳定性。
干燥保护机制主要有两种假说：“玻璃态”假说及“水替代”假说。“玻璃态”假说认为，单糖、双糖、多羟基化合物以及结构蛋白质等均能形成玻璃态，玻璃态物质兼有固体和流体的特性，其黏度可达到1012Pa·s。当干燥蛋白质药物时，保护剂紧密地包裹相邻近的蛋白质分子，形成一种在结构上与冰相似的碳水化合物玻璃体，由于黏度很高，其扩散系数很低，蛋白质分子运动能力减弱，蛋白质亚稳态的构象互变及构象松弛减慢，蛋白质的伸展和聚集受到抑制，分子空间结构得到维持；此外，高黏度使干燥速率变慢，产品的水含量增加，有利于再水化。“水替代”假说则认为，蛋白质被一层水膜包围，这是维持其结构和功能必不可少的物质基础；干燥时脱去水膜将导致蛋白质结构发生不可逆变化，为了补偿蛋白质表面极性基团必要的氢键结合，在蛋白质的失水部位，辅料与蛋白质药物形成氢键，使其在缺水条件下仍能保持原有结构，而不丧失活性。在“水替代”假说中，保护剂的结晶状态及与蛋白质形成氢键的能力是影响保护能力的重要因素。一种保护剂往往不会同时兼有所有的保护性能，如分子量大的碳水化合物比分子量小的碳水化合物更易形成玻璃态，但是其与干燥态蛋白质形成稳固氢键的空间位阻更大。因此选择保护剂时需要综合考虑其玻璃化温度、玻璃态的形成及其与蛋白质形成氢键的能力等因素。
影响冻干制剂贮藏期间稳定性的因素不仅仅是保护剂的种类，贮存温度、晶体转化温度、pH、残留水分，辅料浓度、无定形辅料的晶体化等也会影响其稳定性。贮存温度可能是影响冻干药品稳定性的最重要因素之一。冻干制剂贮存过程中，温度必须低于其玻璃转化温度，如环境温度超过其玻璃转化温度，药品的玻璃化状态被破坏，分子运动加快，无定形成分结晶增加，会出现塌陷、表面萎缩、结块、变硬、变色等，同时制剂的多孔网状结构被破坏，复溶能力减弱。但有时贮存温度不稳定比单纯高温对药物活性影响更大。残留水分是另一重要因素。总的来说，冻干制品越干燥，含水量越低，其晶体转化温度就越高，越容易长期稳定地保存，但过度的干燥会使某些药品表面的氢键或极性基团因暴露而变性。干燥后的药品必须封口保存，以防止污染及回潮。不同药品对封口的要求也不一致，一般对活的微生物、毒株、菌种要求真空封口，对易氧化变质的药品可以采用充氮封口，一般药品可采用普通封口。冻干药品长期贮藏时，封口胶塞对药品稳定性也有影响，是由于水分经胶塞进入瓶内使药品中残留水分增加所致。高压蒸气灭菌时水分也可经胶塞进入药品中。试验证明，氯丁基橡胶塞对水分的透过率比溴丁基橡胶塞高。另外，配方中赋形剂的类型和浓度、pH值等均对冻干药品贮藏期间的稳定性有不同程度影响。
冷冻干燥技术因其独特的生产工艺条件，为许多药物特别是对温度敏感的大分子药物和水溶液中不稳定的药物提供了一个稳定的制备方法，但它是一个非常复杂的物理化学变化过程，可产生多种应力，对药品结构稳定性产生不同程度的影响，同时药物的含水量及加入辅料的不同也会对其稳定性产生一定影响。为提高冻干制剂的稳定性，不同的药物需要选择不同类型和浓度的保护剂，这需要在实践中不断去摸索。
血红蛋白类氧载体(Hemoglobin-based oxygen carriers，HBOCs)是一类血红蛋白衍生物，是通过对血红蛋白表面修饰或聚合而得到的一种生物制品。可参考西大北美一种血液代用品及其制备方法的专利(申请号200310102023.5)。由于其溶液具有携氧能力，因此HBOCs可代替红细胞，发挥其组织供氧的功能。HBOCs通常是液体剂型，而液体剂型比固体剂型重量重，不利于运输。另外，液体剂型中的蛋白质对温度很敏感，无法在常温下保存。故目前保存的方法多数是采用4℃保存，这需要特殊的设备来实现，成本较高，且此无法满足特殊条件下的输血要求，如战地急救，大规模自然灾害等。因此迫切需要找到一种不依赖于专门设备，可在常温下保存血红蛋白类氧载体的方法。
一种可行的办法就是将血红蛋白类氧载体制备成固体制剂，通过这种方法处理的血红蛋白类氧载体可以在常温保存一定时间，并且复溶于水后能保持其原有的大部分生理活性。在本发明之前的许多研究表明，在对天然的64KD血红蛋白进行冷冻干燥时，50％氧合血红蛋白被氧化成高铁血红蛋白，从而丧失了载氧的功能。为解决此问题，Farr等在冷冻干燥血红蛋白之前给其中添加一定量的葡萄糖，结果发现这种做法能有效地防止血红蛋白由氧合型向高铁氧化型转化。此后，很多科研者对于血红蛋白的冷冻保护剂或干燥保护剂进行了广泛研究，发现了很多不同种类的保护剂，这其中效果比较好的包括糖或多元醇，如海藻糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇；聚合物，如血清白蛋白；氨基酸盐，如脯氨酸、L-色氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸；表面活性剂如PEG和吐温80等。
此外，现有专利技术表明，构象上稳定化血红素四聚物可经处理以避免二价铁氧化成三价铁，如在一氧化碳或一氧化氮等氧置换剂，或连二亚硫酸钠等氧清除剂存在下进行处理，然后再经巴氏消毒以破坏所有污染的病毒。例如以上述方式形成一氧化碳-血红素衍生物(CO-hemosafe)足以经受温度达60℃、时间至少10小时的巴氏消毒法消毒，而没有蛋白质的变性或产物的分解。同时，该专利也表明对构象上稳定化血红素四聚物进行冷冻干燥时，如果不加适当的保护剂，则可使之沉淀和变性。用CO来保护血红蛋白中血红素，不用加入任何保护剂，便可成功完成CO-hemosafe的冷冻干燥。这种产品可以在任何合理温度下长期地存储(如于56℃存储60天)。虽说CO-hemosafe是稳定的，但却没有载氧功能。如果将其用于输血时，必须首先在氧气存在下光照处理，将CO-hemosafe转化成氧合血红蛋白。这种方法的局限在于一是需要特殊设备完成O2与CO的交换；二是CO-hemosafe转化成氧合血红蛋白过程中，虽然可以通过实验证明CO完全除尽，但在此过程中是无法避免高铁血红蛋白生成。(中国专利88103596.3)
发明内容
本发明提供了一种血红蛋白类氧载体冻干制剂的制备方法，其解决了背景技术中稳定性差，常温不易储存的技术问题。
本发明的技术解决方案是：
一种血红蛋白类氧载体冻干制剂的制备方法，其特殊之处在于，该方法包括以下步骤：
1)预冷前处理
(1)配液
将血红蛋白类氧载体用保护剂溶液稀释，使其终浓度为40mg/ml；
所述保护剂溶液包括单一保护剂或复合保护剂；
所述单一保护剂为单糖或二糖或氨基酸盐，单糖或二糖的浓度是0.5％-35％；氨基酸盐的终浓度为0.05mol/L-1mol/L；
所述复合保护剂为单糖与多糖复合保护剂、氨基酸盐与多糖复合保护剂或单糖与氨基酸盐复合保护剂，其中单糖浓度是0.5％-20％，多糖浓度是0.5％-20％，氨基酸盐浓度是0.05mol/L-1mol/L；
(2)分装
将上述配制好的溶液制品分装于5ml离心管，每管2.5ml；
2)预冷
用真空冷冻干燥机按冻干常规进行操作，使冷阱温度降至-60℃～-80℃；
3)预冻
将制品放入-30℃～-40℃冰箱冷冻1～4h；
4)升华干燥
抽真空，升华干燥，真空度低于20Pa；所述升华干燥过程分为2个阶段；
(1)初次干燥
搁板温度-40～-10℃，持续5h～14h；冻干过程真空度10pa～20pa
(2)二次干燥
搁板温度10～30℃，持续6h～12h，冻干过程真空度低于1Pa；
5)保存
冻干过程结束后，将样品封口，常温中保存，备用；
上述复合保护剂为葡萄糖与右旋糖酐、氨基酸盐与右旋糖酐以及葡萄糖与氨基酸盐；其中单糖浓度是0.5％-20％，多糖浓度是0.5％-20％，氨基酸盐浓度是0.05mol/L-1mol/L；
上述单糖或二糖的浓度是4％；氨基酸盐的终浓度为0.2mol/L为宜；
上述复合保护剂是3％葡萄糖和1％葡聚糖40或2％葡萄糖和2％葡聚糖40。
上述3)预冻步骤时，预冻的温度为-40℃为佳。
上述3)预冻步骤时，预冻的时间为2h为佳。
上述步骤2)冷阱温度为-80℃为佳。
上述初次干燥时搁板温度-10℃，持续18h为佳。
上述二次干燥时搁板温度20℃，持续2h为佳。
上述氨基酸盐是酸性氨基酸与碱性氨基酸的组合，酸性氨基酸是谷氨酸与天冬氨酸，碱性氨基酸是精氨酸与赖氨酸；
具体包括赖氨酸与天冬氨酸，赖氨酸与谷氨酸，精氨酸与天冬氨酸，精氨酸与谷氨酸的组合。
本发明优选的实际制备过程可总结为：
1、保护剂的选择：
(1)保护剂的初步筛选：糖类作为保护剂，其保护作用不仅与它们的化学结构有密切关系，而且与保护剂和蛋白质摩尔比有关。氨基酸盐作为抗冷冻剂或是抗干燥剂，可通过减少缓冲盐结晶化的速度和程度来保护冻干药品，降低其活性丢失。聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明胶、聚乙烯亚胺等聚合物也常用作为蛋白质的冷冻保护剂。在此基础上，本发明对葡萄糖，半乳糖，海藻糖，蔗糖，葡聚糖40，羟基淀粉40，甘油，BSA，PEG4000，Lys-Asp，甘氨酸盐等保护剂进行初步筛选，其结果如图一所示。由图可见，冷冻干燥过程不加保护剂时血红蛋白类氧载体中高铁血红蛋白从冻干前的2.16％上升到冻干后的27.60％，且直接冷冻干燥得到的冻干品很难再复溶于水。但是在冷冻干燥过程中加糖或多元醇作为保护剂时所得到冻干制品的高铁血红蛋白最高是16％，且复溶速度快，即糖与多元醇对血红蛋白类氧载体的变性具有抑制作用，防止其由氧合型向高铁氧化型转化。其中5％葡萄糖，5％海藻糖，5％蔗糖或0.2mol/LLys-Asp都有很好的保护效果。结论：5％葡萄糖，5％海藻糖，5％蔗糖或0.2mol/LLys-Asp都有很好的保护效果。
操作过程：将血红蛋白类氧载体用各种保护剂稀释，血红蛋白类氧载体蛋白浓度调至40mg/ml。保护剂包括葡萄糖，半乳糖，海藻糖，蔗糖，葡聚糖40，羟基淀粉40，甘油，BSA，PEG4000，Lys-Asp，甘氨酸盐。图中各个保护剂的浓度为终浓度。将配制好的制品分装于5ml离心管，每管装2.5ml。它所用的对照是冷冻干燥中不加保护剂的血红蛋白类氧载体。冷冻干燥条件：-40℃冰箱，一直到其冷冻完全，冷冻时间为1-4h，冷阱温度为-60～-80℃；真空度为0.1-0.01mbar；干燥时间为7-24h，所得样品中残余水量应低于5％。测其冷冻干燥前后metHb含量变化。
(2)冻干制剂的红外研究：在初步筛选的基础上，本发明中还进一步研究加葡萄糖与不加葡萄糖的冻干制剂之间红外光谱的差异。其结果如图二所示。没有加保护剂，其峰为1683cm-1，它是β-折叠特征吸收峰。而加保护剂进行冷冻干燥得到的冻干制剂其峰为1655cm-1，而1655cm-1是蛋白中以a-螺旋结构为主的标志。天然的血红蛋白二级结构主要是以a-螺旋结构为主。因此加葡萄糖，可以使其能够维持蛋白质二级结构。
(实线表示没有加保护剂，直接冷冻干燥；虚线表示加保护剂。)
操作过程：将血红蛋白类氧载体用各种保护剂稀释，血红蛋白类氧载体蛋白浓度调至40mg/ml。葡萄糖的终浓度是4％。将配制好的制品分装于5ml离心管，每管装2.5ml。它所用的对照是冷冻干燥中不加保护剂的血红蛋白类氧载体。冷冻干燥条件：-40℃冰箱，一直到其冷冻完全，冷冻时间为1-4h，冷阱温度为-60～-80℃；真空度为0.1-0.01mbar；干燥时间为7-24h，所得样品中残余水量应低于5％。得到冻干制剂后，取1-2mg冻干产品在玛瑙研钵中研磨成细粉末，与干燥的溴化钾粉末(约100mg)混合均匀，装入模具内，在压片机上压制成片，然后在傅立叶红外光谱仪测试。
(3)保护剂的进一步筛选：在初步筛选的基础上，本发明中还进一步研究保护剂浓度(葡萄糖，海藻糖，蔗糖)与保护效果的关系。其结果如图二所示。由图可见，在一定的浓度范围内，保护剂的保护效果与其浓度是相关的，即随着保护剂浓度的增加，保护效果得到不断改善。但当葡萄糖、海藻糖或蔗糖浓度大于3％时，其保护效果基本不随浓度的变化而再有所改善。结论：浓度为40mg/ml的血红蛋白类氧载体在进行冷冻干燥时，其保护剂的最适合浓度为4％。
操作过程：将血红蛋白类氧载体用各种保护剂稀释，血红蛋白类氧载体蛋白浓度调至40mg/ml。保护剂包括葡萄糖，海藻糖，蔗糖。每种保护剂的终浓度依次是0.5％，1％，2％，3％，4％，5％。将配制好的制品分装于5ml离心管，每管装2.5ml。该实验所用的对照是冷冻干燥中不加保护剂的血红蛋白类氧载体。冷冻干燥条件：-40℃冰箱，一直到其冷冻完全，冷冻时间为1-4h，冷阱温度为-60～-80℃；真空度为0.1-0.01mbar；干燥时间为7-24h，所得样品中残余水量应低于5％。测其冷冻干燥前后metHb含量变化。
(4)复合保护剂的筛选：在筛选单一保护剂的同时，本发明中还进一步研究了复合保护剂的保护效果。其结果如图三所示。由图可见，在3％葡萄糖和1％葡聚糖40或2％葡萄糖和2％葡聚糖40保护下，冷冻干燥前后血红蛋白类氧载体的metHb含量变化很小。而且40℃下存放4h，metHb的含量从冷冻干燥之前的7.4％只上升到8.3％。并且3％葡萄糖和1％葡聚糖40或2％葡萄糖和2％葡聚糖40配方保护效果都优于0.15mol/l Lys-Asp和1％葡聚糖40，0.1mol/l Lys-Asp和2％葡聚糖40，0.15mol/l Lys-Asp和1％葡萄糖。
结论：在所选择5种复合保护剂中，3％葡萄糖和1％葡聚糖40或2％葡萄糖和2％葡聚糖40配方保护效果都优于0.15mol/l Lys-Asp1％葡聚糖40，0.1mol/lLys-Asp和2％葡聚糖40，0.15mol/l Lys-Asp和1％葡萄糖。
操作过程：将血红蛋白类氧载体用各种保护剂稀释，血红蛋白类氧载体蛋白浓度调至35mg/ml。复合保护剂包括葡萄糖与葡聚糖40组合，葡萄糖与氨基酸盐组合，氨基酸盐与葡聚糖组合。图中各个保护剂的浓度为终浓度。冷冻干燥条件：-40℃冰箱，一直到其冷冻完全，冷冻时间为1-4h，冷阱温度为-60～-80℃；真空度为0.1-0.01mbar；干燥时间为7-24h，所得样品中残余水量应低于5％。
制备成的血红蛋白类氧载体冻干制剂，取一部分样品直接加水复溶，测其metHb，然后将另一部分冻干制剂置于40℃水浴加热4h，每2个小时取冻干制剂样品，加水复溶，测其metHb含量。
综上所述，本发明中选定的制备血红蛋白类氧载体固体制剂的优选保护剂为：
单一保护剂：单糖或二糖，其终浓度是4％；氨基酸盐其终浓度为0.2mol/L。
复合保护剂组合：葡萄糖与右旋糖酐复合保护剂，氨基酸盐与右旋糖酐复合保护剂，葡萄糖与氨基酸盐复合保护剂。其中优选的复合保护剂是3％葡萄糖和1％葡聚糖40或2％葡萄糖和2％葡聚糖40
2、冷冻条件的确定：
预冻过程不仅是为了保护物质的主要性能不变，而且要获得冻结后药品有合理的结构，以利于水分的升华，还要有恰当的装量，以便日后的应用。预冻效果主要由3个方面决定：预冻速度、预冻最低温度、预冻时间。
1)预冻最低温度一般应低于溶液共熔点温度，即在共熔点温度以下5-10℃。共熔点与药品的品种、保护剂的种类和浓度有关。
2)适宜的预冻时间应可确保抽真空之前所有的药品均已冻实，不致于因抽真空而引起喷瓶。
3)预冻速度可分为快速冻结与慢速冻结。快速冻结形成的冰晶细，而且没有冻结浓缩现象，防止了溶质浓缩引起的药物活性丢失.加水复溶时溶解快，药品内的成分均匀一致；而慢速冻结则形成较大的冰晶，有冻结浓缩现象。实际上一般冻干药品的预冻速度介于快冻与慢冻之间。
在此基础上，本发明对液氮，-74℃，-40℃三种冷冻方式进行选择。其结果如图四所示。由图可见，这三种冷冻方法对于冷冻干燥前后样品中血红蛋白浓度(CtHb)，剩余碱(BE)，pH，氧饱和度(p50)含量变化差异不是很明显。而从metHb的变化来看，液氮、-74℃剧烈快速的冷冻方式比-40℃对血红蛋白类氧载体影响大。结论：-40℃是优先考虑的冷冻方式。
本方明选用的冷冻条件：
把上述溶液放入-40℃冰箱，一直到其冷冻完全，冷冻时间为1-4h；
操作过程：将血红蛋白类氧载体90mg/ml，不加保护剂直接进行冷冻干燥。将配制好的制品分装于5ml离心管，每管装2.5ml。该实验所用的对照是冷冻干燥之前的血红蛋白类氧载体。冷冻干燥条件：(1)冷冻方法，液氮5分钟，-74℃1小时，-40℃2小时，(2)冷阱温度为-60～-80℃；真空度为0.1mbar；干燥时间为20h，(3)干燥结束后，测其冷冻干燥前后CtHb，metHb，pH，BE，p50含量变化。
3、储存条件的确定：
冻干制剂在储存过程中，当环境温度超过冻干制剂的玻璃转化温度时，药品的玻璃化状态被破坏，制剂外观会出现塌陷、表面萎缩、结块、变硬、变色等问题，同时制剂的多孔结构被破坏，吸水性变差。
本发明选择4℃(保存一个月)，室温(25℃，保存一个月)，40℃(保存4h)三种储存条件。结果显示：在4℃保存一个月的过程中，metHb变化很小，只从冷冻干燥之前的6.5％上升到了7.7％；而在室温(25℃)保存一个月的过程中，metHb变化比较明显，从7.5％上升到17％(见图六)。在40℃水浴保存4h的过程中，metHb变化比较明显，从7.5％迅速上升到16.5％(见图七)。本发明优选的储存条件：血红蛋白类氧载体冻干制剂可在常温保存1个月。
操作过程：将血红蛋白类氧载体用20％葡萄糖稀释，血红蛋白类氧载体蛋白浓度调至35mg/ml。保护剂终浓度为4％。冷冻干燥条件：-40℃冰箱，一直到其冷冻完全，冷冻时间为1-4h，冷阱温度为-60～-80℃；真空度为0.1-0.01mbar18h；0.01mbar 2h，干燥时间为20h，所得样品中残余水量应低于5％。制备成的血红蛋白类氧载体冻干制剂，取一部分样品直接加水复溶，测其metHb；然后将剩余样品分三部分，一部分置于4℃放置，间隔一定时间取样，加水复溶，测其metHb含量直至满一个月；另一部分置于室温，间隔一段时间取样，加水复溶，测其metHb含量直至满一个月；第三部分直接置于40℃水浴加热，每隔一小时取样，加水复溶，测其metHb含量至4小时。
本发明是通过将血红蛋白类氧载体进行冷冻干燥来制备一种固体蛋白制剂，其主要特点在于：①重量轻；②运输方便；③可常温保存，且复溶于水后可基本保持其正常的生理活性。基于以上特点，本发明中制备的这种固体蛋白制剂具有便于储存、便于运输、便于使用等优点，可用于特殊条件下的输血，如战地急救，大规模自然灾害等。下面结合附图和非限制性实例进一步说明本发明所提供的不同配方的保护剂可以有效地防止血红蛋白类氧载体由氧合型向高铁氧化型转化；同时也进一步说明用该法所获得的血红蛋白类氧载体冻干制剂在复溶于水后，能基本保持其正常的生理功能。
附图说明
图1为保护剂的初步筛选效果图；
图2为加葡萄糖与不加葡萄糖的冻干制剂的红外光谱图；
图3为保护剂浓度与保护效果图；
图4为复合保护剂加速实验图；
图5为不同冷冻条件与保护效果图；
图6为冻干制剂室温保存一个月实验图；
图7为冻干制剂40℃保存4h实验图。
具体实施方式
实例1
血红蛋白类氧载体由西安北美药业有限公司提供。将血红蛋白类氧载体用20％葡萄糖溶液稀释，使其终浓度为40mg/ml，葡萄糖的终浓度为4％。
(1)血红蛋白类氧载体分装：将配制好的制品分装于5ml离心管，每管2.5ml；
(2)冻干机预冷：真空冷冻干燥机按冻干常规进行操作，使冷阱温度降至-80℃左右；
(3)预冻：将制品放入-40℃冰箱冷冻2h；
(4)升华、干燥：开启真空泵，抽真空。升华干燥过程分为2个阶段：
初次干燥：搁板温度-10℃，持续18h；
二次干燥：搁板温度20℃，持续2h。冻干过程真空度低于1Pa；
(5)冻干过程结束后，将样品封口，常温中保存；
(6)复溶：用生理盐水或纯水溶解样品；
(7)测定冻干前后各参数。参数包括高铁血红蛋白含量测定，pH值，BE值，p50等；
(8)常温保存：制备好的血红蛋白类氧载体冻干制剂置室温保存1个月。实例1所得样品的测定结果：
表1中列出所测定冻干前后的参数，同时还列出冻干样品在室温保存一个月后的参数。
表1
表1是按照实例1制备的血红蛋白类氧载体冻干制剂，其立即复溶后metHb、pH、BE和p50的变化，所用的对照是冷冻干燥中不加保护剂的血红蛋白类氧载体。
实例2
血红蛋白类氧载体由西安北美药业有限公司提供。将血红蛋白类氧载体用1mol/LLys-Asp稀释，血红蛋白类氧载体浓度调至40mg/ml，氨基酸盐Lys-Asp的终浓度为0.2mol/L。
(1)血红蛋白类氧载体分装：将配制好的制品分装于5ml离心管，每管装2.5ml。
(2)冻干机预冷：真空冷冻干燥机按冻干常规进行操作，使冷阱温度降至-80℃左右；
(3)预冻：将制品放入-40℃冰箱冷冻2h。
(4)升华、干燥：开启真空泵，抽真空。升华干燥过程分为2个阶段，初次干燥：搁板温度-10℃，持续18h；二次干燥：搁板温度20℃，持续2h。冻干过程真空度低于1Pa。
(5)冻干过程结束后，将盖子盖上，并置入柜橱常温中保存。
(6)复溶：用生理盐水或纯水溶解样品。
(7)测定冻干前后各参数。参数包括高铁血红蛋白含量测定，pH，BE，p50等。
实例2所得样品的测定结果：
表2中列出所测定冻干前后的参数，同时还列出冻干样品在室温保存一个月后的参数。
表2
表2是按照实例2制备的血红蛋白类氧载体冻干制剂，其立即复水后metHb、pH、BE和p50的变化，所用的对照是冷冻干燥中不加保护剂的血红蛋白类氧载体。
实例3
血红蛋白类氧载体由西安北美药业有限公司提供。将血红蛋白类氧载体用20％海藻糖溶液稀释，血红蛋白类氧载体浓度调至40mg/ml，海藻糖的终浓度为4％。
(1)血红蛋白类氧载体分装：将配制好的制品分装于5ml离心管，每管装2.5ml。
(2)冻干机预冷：真空冷冻干燥机按冻干常规进行操作，使冷阱温度降至-80℃左右；
(3)预冻：将制品放入-40℃冰箱冷冻2h。
(4)升华、干燥：开启真空泵，抽真空。升华干燥过程分为2个阶段，初次干燥：搁板温度-10℃，持续18h；二次干燥：搁板温度20℃，持续2h。冻干过程真空度低于1Pa。
(5)冻干过程结束后，将盖子盖上，并置入柜橱常温中保存。
(6)复溶：用生理盐水或纯水溶解样品。
(7)测定冻干前后各参数。参数包括高铁血红蛋白含量测定，pH，BE，p50等。
(8)常温保存：制备成的血红蛋白类氧载体冻干制剂，放于橱柜室温保存1个月。
实例3所得样品的测定结果：
表3中列出所测定冻干前后的参数，同时还列出冻干样品在室温保存一个月后的参数。
表3
表3是按照实例3制备的血红蛋白类氧载体冻干制剂，其立即复水后metHb、pH、BE和p50的变化，所用的对照是冷冻干燥中不加保护剂的血红蛋白类氧载体。
Claims (4)
1.一种血红蛋白类氧载体冻干制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)预冷前处理
(1)配液
将血红蛋白类氧载体用保护剂溶液稀释，使其终浓度为40mg/ml；
所述保护剂溶液包括单一保护剂或复合保护剂；
所述单一保护剂是4％的葡萄糖或0.2％的氨基酸盐Lys-Asp或4％的海藻糖；
所述复合保护剂是3％葡萄糖和1％葡聚糖40或2％葡萄糖和2％葡聚糖40；
(2)分装
将上述配制好的溶液制品分装于5ml离心管，每管2.5ml；
2)预冷
用真空冷冻干燥机按冻干常规进行操作，使冷阱温度降至-60℃～-80℃；
3)预冻
将制品放入-30℃～-40℃冰箱冷冻1～4h；
4)升华干燥
抽真空，升华干燥，真空度低于20Pa；所述升华干燥过程分为2个阶段；
(1)初次干燥
搁板温度-10℃，持续18h；冻干过程真空度10pa～20pa
(2)二次干燥
搁板温度20℃，持续2h，冻干过程真空度低于1Pa；
5)保存
冻干过程结束后，将样品封口，常温中保存，备用。
2.根据权利要求1所述血红蛋白类氧载体冻干制剂的制备方法，其特征在于：所述3)预冻步骤时，预冻的温度为-40℃。
3.根据权利要求2所述血红蛋白类氧载体冻干制剂的制备方法，其特征在于：所述3)预冻步骤时，预冻的时间为2h。
4.根据权利要求3所述血红蛋白类氧载体冻干制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤2)冷阱温度为-80℃。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200810150561A CN101642565B (zh) | 2008-08-07 | 2008-08-07 | 血红蛋白类氧载体冻干制剂的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200810150561A CN101642565B (zh) | 2008-08-07 | 2008-08-07 | 血红蛋白类氧载体冻干制剂的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101642565A CN101642565A (zh) | 2010-02-10 |
| CN101642565B true CN101642565B (zh) | 2012-10-03 |
Family
ID=41654725
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200810150561A Active CN101642565B (zh) | 2008-08-07 | 2008-08-07 | 血红蛋白类氧载体冻干制剂的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101642565B (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2991327B1 (fr) * | 2012-06-05 | 2018-04-13 | Hemarina | Procede de lyophilisation d'hemoglobine d'annelides |
| CN102841033A (zh) * | 2012-09-21 | 2012-12-26 | 贵州省烟草科学研究所 | 一种鲜烟叶含水率测定方法 |
| KR20220129088A (ko) * | 2020-02-04 | 2022-09-22 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 동결건조 의약품의 목표 잔류 수분 함량 |
| CN111437443A (zh) * | 2020-04-20 | 2020-07-24 | 百澳瑞派（天津）生物科技有限公司 | 一种新型真皮基质脱细胞方法 |
| CN112057603B (zh) * | 2020-07-25 | 2023-07-14 | 艾美卫信生物药业（浙江）有限公司 | 一种白喉毒素无毒突变体crm197蛋白的冻干方法 |
| CN112279910B (zh) * | 2020-08-31 | 2024-06-21 | 广州沣润生物科技有限公司 | 一种血红蛋白保存液、应用、检测方法及粪便保存装置 |
| CN112646027B (zh) * | 2020-12-22 | 2023-05-09 | 广州沣润生物科技有限公司 | 一种血红蛋白质控品冻干品的制备方法 |
-
2008
- 2008-08-07 CN CN200810150561A patent/CN101642565B/zh active Active
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 于志江等.冷冻干燥技术在基因工程药物中的应用.《生物加工过程》.2005,第3卷(第2期),58-63. * |
| 孙东坡,胡一桥.蛋白质冷冻干燥制品中的保护剂及其保护机制.《药学进展》.2003,第27卷(第4期),201-205. * |
| 张敬如等.蛋白质药品的真空冷冻干燥技术及研究进展.《中国药业》.2006,第15卷(第13期),25-27. * |
| 王智等.载氧药物的冷冻干燥和冻干制品的保存稳定性.《生物医学工程学杂志》.2008,第25卷(第3期),678-693. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101642565A (zh) | 2010-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101642565B (zh) | 血红蛋白类氧载体冻干制剂的制备方法 | |
| Mutukuri et al. | Effects of drying method and excipient on the structure and physical stability of protein solids: Freeze drying vs. spray freeze drying | |
| Hsu et al. | Surface denaturation at solid-void interface—a possible pathway by which opalescent participates form during the storage of lyophilized tissue-type plasminogen activator at high temperatures | |
| Park et al. | Effect of pH and excipients on structure, dynamics, and long-term stability of a model IgG1 monoclonal antibody upon freeze-drying | |
| EP2373293B2 (en) | Compositions with reduced dimer formation | |
| US12016956B2 (en) | Annelid haemoglobin lyophilisation process | |
| Izutsu et al. | Effect of counterions on the physical properties of l-arginine in frozen solutions and freeze-dried solids | |
| Malferrari et al. | Structural and dynamical characteristics of trehalose and sucrose matrices at different hydration levels as probed by FTIR and high-field EPR | |
| PL205982B1 (pl) | Liofilizowany preparat zawierający przeciwciała przeciw receptorowi EGF oraz sposób jego otrzymywania | |
| Avanti et al. | A new strategy to stabilize oxytocin in aqueous solutions: I. The effects of divalent metal ions and citrate buffer | |
| AU2015346485B2 (en) | Carmustine pharmaceutical composition | |
| EP4512389A2 (en) | Degarelix drug product | |
| Lam et al. | A solid-state NMR study of protein mobility in lyophilized protein–sugar powders | |
| Sharma et al. | Steady-state tryptophan fluorescence spectroscopy study to probe tertiary structure of proteins in solid powders | |
| BRPI0920973B1 (pt) | composição aquosa contendo hormônio estimulanete de folículos | |
| US10293048B2 (en) | Pharmaceutical compositions comprising boronic acid compounds | |
| Ambrosio et al. | A novel combined strategy for the physical PEGylation of polypeptides | |
| CN115024310A (zh) | 一种细胞冻干保存剂及其制备方法 | |
| CN102670522A (zh) | 含有重组人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的药物制剂及其制备 | |
| CN103417499A (zh) | 生长抑素冻干粉针的制备方法 | |
| SU978715A3 (ru) | Способ получени водного раствора простациклина или его соли | |
| Santana et al. | Stabilization of a recombinant human epidermal growth factor parenteral formulation through freeze-drying | |
| CN101904862B (zh) | 注射用水溶性维生素组合物冻干制剂 | |
| CN103830189A (zh) | 一种重组甘精胰岛素制剂及其制备方法 | |
| Arsiccio et al. | Impact of controlled vacuum induced surface freezing on the freeze drying of human plasma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: SHAANXI BAIMEI GENE CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: SHAANXI LIFEGEN CO., LTD. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 386 box 710069, Northwestern University, 229 Taibai Road, Shaanxi, Xi'an Patentee after: Shaanxi Baimei Gene Co., Ltd. Address before: 386 box 710069, Northwestern University, 229 Taibai Road, Shaanxi, Xi'an Patentee before: Shaanxi Beimei Gene Co., Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200508 Address after: 710086 4-2-4620, floor 2, building 4, Free Trade Industrial Park, No. 2168, Zhenghe Fourth Road, Fengdong new town, Xi'an City, Shaanxi Province Patentee after: Xi'an blood oxygen Biotechnology Co., Ltd Address before: 386 box 710069, Northwestern University, 229 Taibai Road, Shaanxi, Xi'an Patentee before: Shaan Xi Lifegen Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |