CN101641600A - 用于生殖医学和生物学的生物标记 - Google Patents

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France National Medical Association Of Health And Research
Public Utilities Relief - Marseille Hospital
Universite Paris 5 Rene Descartes
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Abstract

本发明涉及生殖医学和生物学，特别是体外受精(IVF)结果的新生物标记。本发明涉及预测IVF结果和选择IVF对象的方法。

Description

用于生殖医学和生物学的生物标记
发明领域
本发明涉及生殖医学和生物学。本发明涉及着床失败和成功足月妊娠的预测性标记，特别是在体外受精之后。
发明背景
在年轻成年人中，不育的诊断和处理是一种普遍的健康问题。对于不育夫妇来说，正在发展中的体外受精(IVF)技术是大有希望的生育替代方案。然而，体外受精伴有临床并发症增加的风险，所述风险对于它们在女性中的表现，代表的是缺点，包括多胎生产，异位妊娠自发流产和早产的风险。考虑到这些临床风险，以及这些高端技术的高经济成本，IVF治疗仍然难以用于大多数不育夫妇。虽然对影响受精和着床机制的更好了解已经提供了与体外受精成功有关参数的更为精准的观察，但是搜寻在IVF后，治疗开始之前可以预测妊娠结果(issue)的生物标记，仍然是一个重大的挑战。大多数预测胚胎着床或流产的标记(Tong等，2004)是在开始IVF治疗后出现的，因而限制了预测与妊娠失败有关的压力和临床问题的心理咨询(counselling)。因此，在优化对不育夫妇增加的需求的医疗响应中，预测不育女性在IVF治疗后娩出活婴的几率是一个主要问题。
因此，强烈需要可以改善对不育夫妇的心理咨询的标记，其在决定开始IVF治疗并牵涉到相关的临床并发症之前的阶段，作为与IVF有关的流产和着床失败的预报物。
成功胚胎的着床是通过将具有质量合格的胚胎移植至着床来实施的。胚胎的能力主要是由胚胎形态学和分裂动力学来得到认识的。将胚胎培养到胚泡阶段具有几个潜在的优点，其中包括选择最有活力的胚胎并具有最好的着床机会，使胚胎-子宫同步化，在多次着床失败的情况下评价能够胚胎发育的可能性。人们可以希望在移植具有良好质量的胚胎时(质量限定为形态学方面和发育速度)，胚胎将会着床并使得妊娠。对于胚胎释放出一组支持其在子宫内膜内着床的信号的这种内在能力的评价，尚难以评价。
因此，对于能够帮助评估胚胎质量，其存活性及其着床能力的标记，有着强烈的需求。
发明概述
本发明首次提供了允许非侵入性评价和预测IVF结果的生物标记。除了它的诊断价值之外，该生物标记的重要价值是在女性开始激素调节治疗之前，对其定剂量的可能性。使用这种生物标记将改善心理咨询或管理IVF相关的风险，进而为不育女性的健康护理提供结果的益处。另外，本发明将MICA(MHC I类链相关蛋白A)鉴定为不育和妊娠并发症的标记。因此，本发明涉及MICA在生殖医学和生物学中作为生物标记。
在第一实施方案中，本发明涉及确定体外受精(IVF)结果的方法，包括体外分析样品中的MICA，MICA水平是IVF结果的指示，特别是着床失败率，IVF失败和/或流产的指示。优选，样品选自：
-接受移植胚胎的女性的血液，血浆，血清，子宫内膜活检物，子宫液，阴道和宫颈分泌物，宫颈粘液，道格拉斯陷凹(Douglas’pouch)和腹腔镜探查情况下(子宫内膜异位，盆腔粘连，感染性后遗症)的腹膜液样品；
-提供精子的男性的血液，血浆，血清和精液样品；
-提供卵母细胞的女性的血液，血浆，血清，子宫内膜活检物，子宫液，阴道和宫颈分泌物，宫颈粘液，道格拉斯陷凹，卵泡液和腹腔镜探查情况下的腹膜液(子宫内膜异位，盆腔粘连，感染性后遗症)样品；和
-胚胎上清液或胚胎培养基样品。
在第二实施方案中，本发明涉及选择IVF对象的方法，包括体外分析样品中的MICA，并选择MICA水平指示IVF成功概率的对象。优选，样品选自血液，血浆，血清，子宫内膜活检物，子宫液，阴道和宫颈分泌物，宫颈粘液，道格拉斯陷凹，和腹腔镜探查情况下的腹膜液(子宫内膜异位，盆腔粘连，感染性后遗症)样品。
在第三实施方案中，本发明涉及在对象中确定精液或游动精子质量或者确定男性不育概率的方法，包括体外分析来自对象的血液，血清，血浆或精液样品中的MICA，MICA水平是精液或游动精子质量或者男性不育的指示。
在第四实施方案中，本发明涉及确定胚胎质量或选择适合胚胎移植，体外受精或着床的胚胎的方法，包括体外分析胚胎培养基或上清液中的MICA，MICA水平是胚胎质量或胚胎适合胚胎移植，体外受精或着床的指示。
在第五实施方案中，本发明涉及不育症预后以及在对象中确定妊娠并发症概率的方法，所述妊娠并发症包括流产，血管型妊娠病(VPD)，先兆子痫(PE)，合并或不合并先兆子痫的宫内发育迟缓(IUGR)，HELLP综合征，妊娠期脂肪变性，妊娠期肾病或胎死宫内，与自身免疫病相关的妊娠疾病或不育症，包括体外分析样品中的MICA，MICA水平指示妊娠并发症的概率。
在优选的实施方案中，分析样品中MICA的步骤包括选自下面的步骤：
-分析样品中可溶性MICA蛋白；
-分析编码MICA的无细胞核酸；和
-分析样品中存在的抗-MICA抗体。
在最优选的实施方案中，分析样品中MICA的步骤包括将样品与抗-MICA抗体相接触，优选单克隆抗体，更优选选自SR99，SR104和SR116。任选，分析样品中可溶性MICA的步骤能够通过ELISA分析进行，优选通过夹心ELISA分析。
在第六实施方案中，本发明涉及在生殖医学和生物学中体外使用的试剂盒，所述试剂盒包含选自下列的至少一种成分：抗-MICA抗体，编码MICA的核酸特异性的引物组，编码MICA的核酸的特异性探针和MIC蛋白，优选MICA蛋白。优选，试剂盒用于选择适合IVF的对象，确定体外受精(IVF)结果，确定精液或游动精子质量，选择适合IVF的精液或游动精子，确定对象中男性不育的概率，确定胚胎质量，选择适合胚胎移植，体外受精或着床的胚胎，或鉴别在妊娠期间有高并发症风险的对象，特别是流产，血管型妊娠病，先兆子痫，合并或不合并先兆子痫的宫内发育迟缓(IUGR)，HELLP综合征，妊娠期脂肪变性，妊娠期肾病或胎死宫内的易感对象。
优选，抗-MICA是抗体单克隆抗体，优选自SR99，SR104和SR116。任选，试剂盒还可包含可溶性MICA蛋白。
附图说明
图1：平均sMIC血清水平在患者中根据着床成功性和IVF结果而不同。sMIC血清水平评价是在170名不育女性IVF候选者的血清中，于IVF开始之前周期的卵泡期期间得到的。sMIC是ng/ml的水平。散点图呈现了sMIC阳性血样中的中值和中位的25-75四分位范围的误差棒。使用第4版GraphPad Prism软件获得图。分组代表的是IVF后着床失败的女性(IMP-)，IVF后出现着床成功的女性(IMP+)，IMP+组进一步细分为2组：IVF后生下新生儿的女性(BBaby)或成功着床后经历流产的女性(MIS)。产子失败(或因着床失败或因流产)的女性的中位sMIC值还以IMP-或MIS表示。生育女性对照捐赠组是收集的没有妊娠的血样，所述女性之前已经历过至少2次成功的妊娠，对所述样品也进行MIC评价(Fert Ctl)。
图2：参照经历正常妊娠并与孕期相匹配的女性(NP)，发现患有血管型妊娠病(VPD)女性的MIC+阳性样品中MIC水平高。血管型妊娠病进一步细分为宫内发育迟缓(IUGR)，先兆子痫(PE)和胎死宫内(IUFD)。
图3：(图3A)先兆子痫组中每天蛋白尿的中位和四分位范围取决于sMIC状况。使用非参数曼-惠特尼检验(non-parametric Mann-withneytest)，对sMIC阳性和sMIC阴性血浆之间进行比较。(图3B)在先兆子痫患者的先兆子痫sMIC阳性组和sMIC阴性血浆中，子宫双侧舒张早期切迹的频率。
发明详述
本发明是基于鉴别生殖医学和生物学领域中的生物标记。实际上，他们发现MICA水平能够用于预测IVF结果，特别是用于确定IVF成功或失败，胚胎着床的成功或失败以及流产的概率。另外，该标记可用于评价精液的生育能力，并可用于选择最有活力并具有最佳着床概率的胚胎。该标记也与妊娠并发症有关。特别是它能够用于定义宫内发育迟缓(IUGR)，胎死宫内，与自身免疫病有关的妊娠病，不育，妊娠期血管病和先兆子痫的概率。
MICA已在专利申请WO 98/19167和WO 03/089616中被深入描述，所述申请的公开内容合并在此作为参考。MICA的Unigene Cluster是Hs.549053，代表性序列在Embl Q9UDZ9中。可溶性MICA是截短的蛋白。可溶性MICA缺乏跨膜结构域和胞质尾，并包含三个细胞外结构域。
因此，本发明涉及确定体外受精(IVF)结果的方法，包括体外分析样品中的MICA，MICA的水平指示IVF结果。该方法可包括提供样品的先期步骤。
IVF结果可以是产子，着床失败或流产。
在优选的实施方案中，本方法包括分析样品中的可溶性MICA蛋白。在另一个优选的实施方案中，方法包括分析编码MICA的无细胞的核酸。“无细胞”是指不是包含在细胞中的核酸。在另一个优选的实施方案中，方法包括间接分析MICA，并包括分析样品中存在的抗-MICA抗体。
样品可由对象提供。
在第一实施方案中，对象是接受移植胚胎的女性。对象也可以是卵母细胞提供者。在优选的实施方案中，样品选自血液，血浆，血清，子宫内膜活检物，子宫液，阴道和宫颈分泌物，宫颈粘液，道格拉斯陷凹，和腹腔镜探查情况下的腹膜液(子宫内膜异位，盆腔粘连，感染性后遗症)样品。在优选的实施方案中，样品是血液，血浆或血清样品，更优选血清样品。
优选，在激素调节治疗开始之前，测定可溶性MICA水平。在第一具体实施方案中，激素调节治疗开始之前，血清样品中MICA水平大于2.45ng/ml指示着床失败率较高。因此，本发明涉及一种方法，其中对象是准备接受移植胚胎的女性，在激素调节治疗开始之前测定可溶性MICA水平，血清样品中MICA水平大于2.45ng/ml指示着床失败率较高。在第二具体实施方案中，激素调节治疗开始之前，血清样品中MICA水平大于28ng/ml指示IVF失败概率高。因此，本发明涉及一种方法，其中对象是准备接受移植胚胎的女性，在激素调节治疗开始之前测定可溶性MICA水平，血清样品中MICA水平大于28ng/ml指示IVF失败概率高。在第三具体实施方案中，激素调节治疗开始之前，血清样品中MICA水平大于6ng/ml指示流产概率高。因此，本发明涉及一种方法，其中对象是准备接受移植胚胎的女性，在激素调节治疗开始之前测定可溶性MICA水平，血清样品中MICA水平大于6ng/ml指示流产概率高。
可溶性MICA蛋白水平也可在着床后测定。因此，在第四具体实施方案中，着床后血清样品中MICA水平大于3.2ng/ml指示流产概率高。因此，本发明涉及一种方法，其中对象是接受了胚胎移植的女性，可溶性MICA水平也可在着床后测定，血清样品中MICA水平大于3.2ng/ml指示流产概率高。
在第五具体实施方案中，低水平的MICA指示IVF成功概率高。尤其是，激素调节治疗开始之前，血清样品中MICA水平低于28ng/ml，优选低于6ng/ml并更优选低于2.45ng/ml，是IVF成功，优选IVF成功概率高的指示。
因此，本发明涉及一种选择适合IVF的对象的方法，包括体外分析对象样品中的MICA和选择MICA水平指示IVF成功概率的对象。所述方法可包含提供对象样品的先期步骤。对象特别是作为IVF候选者的女性。样品可选自血液，血浆，血清，子宫内膜活检物，子宫液，阴道和宫颈分泌物，宫颈粘液，道格拉斯陷凹，和腹腔镜探查情况下的腹膜液(子宫内膜异位，盆腔粘连，感染性后遗症)样品。在优选的实施方案中，样品是血液，血浆或血清样品，优选血清样品。样品可直接使用或经过预处理。
选择适合IVF对象的方法的优选实施方案中，方法包括分析样品中的可溶性MICA蛋白。可溶性MICA水平优选在激素调节治疗开始之前测定。例如，血清样品中可溶性MICA水平低于28ng/ml，优选低于6ng/ml，并更优选低于2.45ng/ml是IVF成功概率的指示。在另一种优选的实施方案中，该方法包括分析编码MICA的无细胞核酸。“无细胞”是指不是包含在细胞中的核酸。在另一个优选的实施方案中，方法包括间接MICA分析，并包括分析样品中存在的抗-MICA抗体。样品中MICA水平优选在激素调节治疗开始之前测定。
在第二实施方案中，对象是提供精液的男性。在该实施方案中，样品可选自血液，血浆，血清和精液样品。精液可选自新鲜射出的精液，准备好游动精子获能后的新鲜精液，冷冻之前或之后的附睾精液和冷冻之前或之后的睾丸精液。样品中存在的MICA的确指示生育能力较低。在优选的实施方案中，方法包括分析样品中的可溶性MICA蛋白。在另一个优选的实施方案中，方法包括分析编码MICA的无细胞核酸.
因此，本发明还涉及提供测量提供精液的男性的血液，血浆，血清或精液样品中的MICA水平，确定精液或游动精子质量的方法。该方法可包含提供对象样品的先期步骤。在优选的实施方案中，方法包括分析样品中的可溶性MICA蛋白。在另一个优选的实施方案中，方法包括分析编码MICA的无细胞核酸。特别是，精液或游动精子质量用于确定生育能力。优选，样品中的MICA水平指示精液或游动精子的质量，因而指示IVF成功的概率。优选MICA水平越高，精液或游动精子的质量越低，因而IVF成功的概率越低。
本发明还涉及选择适合卵母细胞的IVF的精液或游动精子的方法，包括测量提供精液的男性的血液，血浆，血清或精液样品中的MICA水平。该方法可包括提供对象样品的先期步骤。MICA的存在确实与着床失败有关。优选，显示MICA水平最低的样品被选择用于IVF。在优选的实施方案中，方法包括分析样品中的可溶性MICA蛋白。在另一个优选的实施方案中，方法包括分析编码MICA的无细胞核酸。
另外，本发明涉及确定对象中男性不育概率的方法，包括测量对象的血液，血浆，血清或精液样品中的MICA水平。该方法包括提供对象血液，血浆，血清或精液样品的先期步骤。MICA的存在的确与男性不育有关。在优选的实施方案中，方法包括分析样品中的可溶性MICA蛋白。在另一个优选的实施方案中，方法包括分析编码MICA的无细胞核酸。
在第三实施方案中，对象是提供卵母细胞的女性。对象也可以是接受的女性。MICA的存在的确能够用于评估卵母细胞的质量，因而评估胚胎的质量，MICA的存在是存活力和/或着床概率较低的指示。在优选的实施方案中，样品选自血液，血浆，血清，子宫内膜活检物，子宫液，阴道和宫颈分泌物，宫颈粘液，道格拉斯陷凹，卵泡液，和腹腔镜探查情况下的腹膜液(子宫内膜异位，盆腔粘连，感染性后遗症)样品。具体是，样品可以是卵泡液，例如在收获卵母细胞后，通过卵泡穿刺得到的卵泡液。这种液体可以在HCG诱导排卵后，通过阴道穿刺而提供。
样品也可以由上清液或胚胎培养基提供。在具体实施方案中，上清液或培养基来自目标在于移植或冷冻的胚胎。
样品能够直接使用或进行预处理，例如冷冻，提纯，加热，浓缩，稀释等...
因此，本发明还涉及一种通过测量胚胎培养基或上清液中的MICA水平而确定胚胎质量的方法。MICA水平在受精后至少44-46小时测量，优选受精后60，70，80或90小时。在优选的实施方案中，方法包括分析样品中的可溶性MICA蛋白。在另一个优选的实施方案中，方法包括分析编码MICA的无细胞核酸。具体是，胚胎质量用于确定胚胎成功着床的潜力。优选，胚胎培养基或上清液中的MICA水平指示胚胎质量，并因此指示胚胎成功着床的概率。优选MICA水平越高，胚胎质量越低，因此胚胎成功着床的概率越低。
本发明还涉及一种选择适合胚胎移植，体外受精或着床的胚胎的方法，该方法包括测量胚胎培养基或上清液中的MICA水平。具体是，MICA水平指示胚胎对胚胎移植，体外受精或着床的合适性。优选，选择培养基中显示的MICA水平最低的胚胎用于胚胎移植，体外受精或着床。MICA的存在的确与着床失败相关。在优选的实施方案中，方法包括分析样品中的可溶性MICA蛋白。在另一个优选的实施方案中，方法包括分析编码MICA的无细胞核酸。
本发明还涉及一种IVF方法，包括用本发明的方法选择胚胎和将胚胎移植到相容的人类子宫中。
另一方面，本发明涉及在对象中确定妊娠并发症概率的方法，妊娠并发症包括流产，血管型妊娠病，先兆子痫，合并或不合并先兆子痫的血管或非血管型宫内发育迟缓(IUGR)，HELLP综合征，妊娠期脂肪变性，妊娠期肾病或胎死宫内，方法包括体外分析样品中的MICA，MICA水平是妊娠并发症概率的指示，妊娠并发症包括流产，血管型妊娠病，先兆子痫，合并或不合并先兆子痫的血管或非血管型宫内发育迟缓(IUGR)，HELLP综合征，妊娠期脂肪变性，妊娠期肾病或胎死宫内。具体是，本方法用于确定先兆子痫的严重性。因此，本发明涉及在对象中确定严重先兆子痫的概率的方法，包括，体外分析样品中的MICA，MICA水平是严重先兆子痫概率的指示。
该方法可包括提供样品的先期步骤。
用于本方法的样品可选自血液，血浆，血清，胎盘，脐带血，内皮细胞和羊膜液样品。在优选的实施方案中，样品是血液，血浆或血清样品，优选血清样品。样品可直接使用或可经过预处理。
对象优选妊娠女性或希望妊娠的女性。
在优选的实施方案中，方法包括分析样品中的可溶性MICA蛋白。在另一个优选的实施方案中，方法包括分析编码MICA的无细胞核酸。在另一种优选的实施方案中，方法包括间接MICA分析并包括分析样品中存在的抗-MICA抗体。
优选，在胚胎着床后测定可溶性MICA水平。优选，测得血清样品中可溶性MICA例如至少为0.3ng/ml，0.5ng/ml，0.75ng/ml或1ng/ml，是病理妊娠概率较高的指示，病理妊娠包括流产，血管型妊娠病，先兆子痫，合并或不合并先兆子痫的血管或非血管型宫内发育迟缓(IUGR)，HELLP综合征，妊娠期脂肪变性，妊娠期肾病或胎死宫内，更具体而言，病理选自VPD，先兆子痫，血管型IUGR，IUFD及其组合。优选，测得血清样品中可溶性MICA例如至少为0.3ng/ml，0.5ng/ml，0.75ng/ml或1ng/ml，也是严重先兆子痫概率较高的指示，特别是先兆子痫合并反映肾衰的蛋白尿和/或反映胎盘功能不全的子宫双侧舒张早期切迹。在具体实施方案中，血清样品中可溶性MICA蛋白水平大于2.5或10ng/ml是病理妊娠概率高的指示，病理妊娠包括流产，血管型妊娠病，先兆子痫，合并或不合并先兆子痫的宫内发育迟缓(IUGR)，HELLP综合征，妊娠期脂肪变性，妊娠期肾病或胎死宫内。
本发明还涉及在对象中区分血管型与非血管型宫内发育迟缓(IUGR)的方法，包括体外分析样品中的MICA，MICA水平是血管型IUGR概率的指示。优选，样品是血液，血浆或血清样品，优选血清样品。更优选，测得样品中的可溶性MICA优选至少0.3ng/ml，0.5ng/ml，0.75ng/ml或1ng/ml，是血管型IUGR的指示。优选，在胚胎着床后测定可溶性MICA水平。
如上所述，分析MICA的步骤包括分析样品中的可溶性MICA蛋白。在优选的实施方案中，分析液体样品中可溶性MICA蛋白的步骤包括将样品与抗-MICA抗体接触。在优选的实施方案中，分析样品中可溶性MICA的步骤通过ELISA分析，优选夹心ELISA分析进行。分析和定量蛋白，特别是可溶性蛋白的ELISA技术是本领域技术人员公知的。在备选的实施方案中，分析样品中可溶性MICA的步骤通过将抗体与微珠偶联(Luminex技术)，Western印迹，点印迹，放射免疫分析(RIA)，FACS分析和本领域技术人员公知的其它免疫分析技术来进行。
例如，可以如下进行ELISA分析：将待测样品固定在聚苯乙烯微量滴定板的孔上；孔中加入抗-MICA抗体；结合和清洗除去非特异性结合之后，检测结合的抗-MICA抗体。检测经常通过加入抗-MICA抗体的可检测特异性抗体来实现。例如，可以通过针对二抗(例如，山羊的抗小鼠IgG抗体)的Fc部分的三抗来检测。或者，可以标记抗-MICA抗体。
优选，如下进行夹心ELISA分析：将抗-MICA抗体固定在聚苯乙烯微量滴定板的孔上；孔中加入待测样品；结合和清洗除去非特异性结合之后，通过抗-MICA二抗检测结合的MICA。检测经常通过加入抗-MICA抗体的可检测特异性抗体来实现。例如，可以通过针对二抗(例如，山羊的抗小鼠IgG抗体)的Fc部分的三抗来检测。或者，可以标记抗-MICA二抗。
本发明中有用的抗-MICA抗体可以是多克隆或单克隆的。抗体可以是任何类别，优选IgGl或IgG2a。它们可以是MICA，特别是可溶性MICA特异性的。这些抗体能够结合MICA的细胞外部分。或者，它们能够结合MICA和MICB。
制备和表征抗体的方法是本领域公知的(Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室指南)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1988))。更具体的抗体例子如下：WO 03/089616中的2C10，6D4，6G6和3H5，和Hue等(2003)中的SR99，SR104和SR116。优选，抗-MICA抗体是单克隆抗体，优选自SR99，SR104和SR116。
抗-MICA抗体可是被标记的。标记可以是放射性标记，荧光标记，化学发光标记，酶或配体。抗-MICA抗体也可不标记并可以与标记了的检测剂一起使用。例如，它们可以由针对抗-MICA抗体的Fc部分的二抗(例如，山羊的抗小鼠IgG抗体)来检测。
如上所述，分析MICA的步骤可以包括分析编码MICA的无细胞核酸。编码MICA的核酸可以是RNA或DNA。编码智人(Homo sapiens)MICA的mRNA的Genbank登录号是NM 000247。智人MICA的GeneID是4276。所述编码MICA的无细胞核酸在液体样品中可以没有和/或包含在循环微粒中，特别是血液或血清样品中存在的微粒中。编码MICA的核酸可由本领域技术人员公知的任何手段进行分析。例如，可经使用合适的引物和探针，通过实时定量PCR——RT-PCR，通过Southern或Northern印迹或其组合进行分析。在优选的实施方案中，通过定量PCR或RT-PCR分析。本领域技术人员能够容易地设计合适的引物对。例如，适合用sybergreen通过定量RT-PCR分析MIC A RNA的引物对可以为下列引物对：MICA 970F和MICA 1127R。
引物   距ATG的位置 Sens 位置 序列 Tm引物表达 Tm引物3 Etor E3′ 产物长度 产物Tm E anyltot E anyl 3 PCR条件
  MICA 970F   931   F  外显子5 SEQ ID No 1   60,6   62,8   4   2   158   87,4   3   1   62°7″
  MICA 1127R   1088   R  外显子7 SEQ ID No 2   61,3   63,7   4   1
在应用这些技术之前，可以纯化或富集样品的核酸。编码MICA的核酸的检测已经全面描述于专利申请WO 98/19167中，其公开内容合并在此作为参考。
如上所述，分析MICA的步骤可以包括样品中存在的抗-MICA抗体。例如，抗-MICA抗体可使用MICA蛋白，优选重组MICA蛋白，通过ELISA分析检测。制备所述MICA蛋白的方法已经全面描述于专利申请WO 98/19167和WO 03/089616中，其公开内容合并在此作为参考。或者，分析样品中抗-MICA抗体的步骤可通过将MIC，优选MIC A与微珠偶联(Luminex技术)来进行。可商购的试剂盒Labscreen(OneLambda，参考号LSMICA001)可用于通过Luminex分析血清样品中的抗MIC抗体。这类针对抗MIC抗体的分析对于与不育有关的自身免疫病(乳糜泻，APS，...)中自身抗体的分析是有效的。在女性患有免疫病因的妊娠期病(先兆子痫，习惯性流产)的情况下，这种分析也是有价值的。
另外，本发明涉及在罹患自身免疫疾病或紊乱的对象中确定不育概率的方法，包括测量对象的样品中的MICA水平，MICA水平是对象不育概率的指示。任选，该方法包括提供对象样品的先期步骤。样品可选自血液，血浆，血清，子宫内膜活检物，子宫液，阴道和宫颈分泌物，宫颈粘液，道格拉斯陷凹，卵泡液，腹腔镜探查情况下的腹膜液和精液。在优选的实施方案中，方法包括分析样品中的可溶性MICA蛋白。在另一种优选的实施方案中，方法包括分析编码MICA的无细胞核酸。在另一种优选的实施方案中，方法包括分析样品中存在的抗-MICA抗体。
本发明还涉及试剂盒在生殖医学和生物学中的应用，所述试剂盒包含选自下列的至少一种成分：抗-MICA抗体，编码MICA的核酸特异性的引物组，编码MICA的核酸的特异性探针和MICA蛋白。还涉及生殖医学和生物学用试剂盒，所述试剂盒包含选自下列的至少一种成分：抗-MICA抗体，编码MICA的核酸特异性的引物组，编码MICA的核酸的特异性探针和MICA蛋白。MICA蛋白可以是可溶性MICA。试剂盒还可包含说明单，任何适当的阴性和阳性对照，标准蛋白和/或检测试剂。
在优选的实施方案中，试剂盒包括抗-MICA抗体。试剂盒还可包含可溶性MIC蛋白，优选MICA蛋白。可溶性MICA能够通过重组表达截短的MICA而生产。可溶性MICA能够由合适的宿主细胞表达，例如细菌，酵母，哺乳动物和昆虫细胞。为了便于纯化，编码序列中可以包括标签，例如Myc或His标签。这样的可溶性MICA能够用于阳性对照。重组的可溶性MICA分子可按照Hue等，2003(p.1910)中所述进行制备，其公开内容合并在此作为参考。试剂盒还可包含微量滴定板，任选具有固定在微量滴定板孔上的抗-MICA抗体。最后，试剂盒可包含任何适当的免疫检测试剂或溶剂。本发明还特别涉及试剂盒在体外受精(IVF)失败，胚胎着床失败，流产，宫内发育迟缓和先兆子痫的概率中的应用。优选，抗-MICA抗体是单克隆抗体，优选自SR99，SR104和SR116。在具体实施方案中，试剂盒还包含可溶性MICA蛋白。
本发明还涉及本发明的试剂盒在下述中的用途：选择适合IVF的对象，确定体外受精(IVF)结果，确定精液或游动精子质量，选择适合IVF的精液或游动精子，确定对象中男性不育的概率，确定胚胎质量，选择适合胚胎移植，体外受精或着床的胚胎，鉴别在妊娠期间有高并发症风险的对象，特别是流产，血管型妊娠病，先兆子痫，合并或不合并先兆子痫的宫内发育迟缓(IUGR)，HELLP综合征，妊娠期脂肪变性，妊娠期肾病或胎死宫内的易感对象，确定先兆子痫的严重性，区分血管型与非血管型宫内发育迟缓(IUGR)，以及确定患有自身免疫病，特别是乳糜泻或抗磷脂抗体综合征(APS)的对象的不育概率。
本发明还涉及分析可溶性MICA的试剂盒，其包含至少一种选自SR99，SR104和SR116的抗-MICA抗体。优选，试剂盒包含两种抗-MICA抗体，特别是SR99和SR104。任选，两种抗体之一被标记(例如，生物素化的抗体)。在优选的实施方案中，试剂盒适合夹心ELISA分析。本发明还涉及该试剂盒在本发明的方法中的用途。
此外，本发明方法和用途中的任何一种中的MICA分析都可以与本领域已知的其它标记的分析相组合。数种标记的组合还可增加可预测性。例如，这些其它标记可选自HLA-G和生血管标记，例如内皮糖蛋白(endoglin)，PIGF和sFLT1。为了分析这些其它标记，试剂盒可包含一种或数种选自下列的其它成分：对一种或多种其它标记例如HLA-G，内皮糖蛋白，PIGF和/或sFLT1抗体具有特异性的抗体，引物和探针，对编码HLA-G，内皮糖蛋白，PIGF或sFLT1的核酸具有特异性的引物组，和/或对编码HLA-G，内皮糖蛋白，PIGF或sFLT1的核酸具有特异性的探针。
本发明的其它方面和优势将公开在下面的实验部分，其应被视为说明而不是限制本发明的范围。本说明书和实施例中引用的所有参考文献包括论文，专利和专利申请的内容，都合并在此作为参考。
实施例
实施例1：可溶性MIC的血清水平是体外受精之后着床失败和成功的足月妊娠的预测性标记。
子宫NK(uNK)是在胚胎着床位置处发现的主要淋巴细胞群并在怀孕中期之后日渐消失。因而，在母亲体内发挥作用的内在免疫机制被认为在接纳半异体胎儿中具有强大的影响。特别是，uNK受体识别亲体/滋养层配体，其阻止胎儿受到母体免疫系统的攻击。
在胚胎上清液中存在可溶性HLA-G，一种已知的NK抑制配体，通常在胎母界面处表达，其与体外受精(IVF)后胚胎着床率较高相关(Fuzzi等，2002；Warner等，2004)。母体uNK上的杀伤细胞免疫球蛋白受体(KIR)和胎儿HLA-C之间的相互作用也影响生育成功性(Hiby等，2004；Parham，2004；Wu等，2004)。另外，uNK细胞分泌有利于着床和胎盘形成的生血管因子和细胞因子(Ashkar等，2003；Coulam等，2003；Hanna等，2006；Ledee-Bataille等，2004；Moffett-King，2002)。
因此，发明人推断uNK细胞的任何功能障碍将进而表现为成功着床和妊娠的障碍。
在肿瘤学(Carbone等，2005；Groh等，2005；Groh等，1998)和自身免疫学(Hue等，2004；Meresse等，2004)中已经广泛探查了sMIC胁迫诱导的MHC I类相关分子的表达的所牵涉的功能。异体或自体细胞上胁迫诱导的NKG2D配体表达已经显示出靶向NK细胞的细胞毒性和细胞因子/趋化因子的产生(Andre等，2004；Lanier，2005；Meresse等，2004；Raulet等，2003；Sutherland等，2002)。双重的活化和刺激机制与可溶性MIC被NKG2D受体接合有关。在一些癌症患者的血清中可溶形式的MIC(sMIC)释放，的确已经显示出诱导效应子NK和T淋巴细胞中刺激性NKG2D受体的内化，进而削弱内在的和适应性的抗肿瘤免疫应答以及利于肿瘤生长的逃逸机制(Groh等，2002；Wu等，2004)。NKG2D被胎盘来源的SMIC的这种下调近来也已经被提出作为免疫逃逸机制，可以下调妊娠期间的母体免疫应答(Mincheva-Nilsson等，2006)。
但是，sMIC胁迫诱导的MHC I类相关分子在生育失败方面从未得到研究。本发明人首次研究了血清sMICA是否能够成为体外受精(IVF)后女性不能怀孕或娩出活婴的证明依据。
材料和方法
受试者和方法
本前瞻性研究由当地伦理委员会批准，于马赛(Marseilles)的Center of Assisted Reproductive Medicine，La Conception Hospital，在进行过IVF或ICSI的连贯的系列不育患者中进行(2004年1月-2005年10月)。在给出知情同意书之后，本研究征集了一群170名不育女性，都是IVF的候选者。临床指征是原因不明的不育，男性不育和输卵管原因。所包括的女性无一曾有怀孕史。在IVF之前的周期的卵泡期收集血浆样品。所有患者接受相似的刺激方案。在用Gnrh激动剂类似物进行垂体下调之后，开始使用重组FSH(Gonal
Figure A20088000217700231
Serono Pharma，法国巴黎；
Figure A20088000217700241
Organon France，法国巴黎)进行卵巢刺激。通过低于50pg/ml的低血浆雌二醇和超声检查排除卵巢囊肿并证实子宫内膜厚度低于5mm来证实垂体脱敏完成。当至少三个卵泡直径超过16mm时，施用人绒毛膜促性腺激素10000UI(HCG)。HCG施用后32-34小时，通过经阴道超声引导和全身麻醉来收获卵母细胞。从胚胎移植当天起，用天然孕酮支持黄体期。胚胎移植在收集卵母细胞后第二天或第三天进行。在胚胎移植后15天进行一次血清HCG测量。当通过经阴道超声图探测到具有胎儿心跳的子宫内孕囊时，确定为临床妊娠。
收集的卵母细胞在带有添加了血清替代品补充的
Figure A20088000217700242
培养基的四孔多-皿中培养。每孔含1-4个卵母细胞。采用IVF或ICSI技术进行授精。授精后16-18h在倒置显微镜下观察卵母细胞的受精，并计算受精率。培养48h或72h后检查胚胎，评估分裂率，直至选出四个胚胎用于移植。胚胎根据卵裂球的数目和碎片量分级。所用的级别是：1级(没有碎片)，2级(＜20％)，3级(20-50％碎片)，4级(＞50％碎片)。
ELISA分析血浆中的可溶性MIC水平
可溶性MICA分子的构建，表达和纯化。按照Hue等，2003(p.1910)的记载，制备重组可溶性MICA分子，其公开内容合并在此作为参考。
抗-MICA mAbs的生产。抗-MICA单克隆抗体按照Hue等，2003(p.1910)的记载生产，其公开内容合并在此作为参考.
ELISA检测可溶性MICA：为了检测血清中的可溶性MICA，夹心ELISA中使用了两种不同的抗-MIC mAbs。高结合性聚苯乙烯板(Greiner；Sigma-Aldrich)4℃下用捕获SR99Ab(PBS中5μg/ml，100μl/孔)包被12h，用PBS加0.05％ Tween 20清洗5次，22℃加入100μl的5％BSA 1h进行阻断，并在PBS-0.05％ Tween 20中清洗。然后在室温下加入标准(可溶性rMICA在PBS-0.05％ Tween 20中从100μg/ml至0.1ng/ml的连续稀释液)和血清样品(100μl/孔)2h。清洗5次后，在室温下加入生物素化的SR104检测Ab(PBS中150ng/ml，100μl/孔)1h。将板清洗，并在室温下与链亲和素结合的HRP(1/30,000；AmershamPharmacia Biotech)一起温育20min，清洗，并与四甲基联苯胺底物(Sigma-Aldrich)在37℃反应15min。用0.5M H2SO4(50μl/孔)终止反应。测量450nm处的吸光度。重组可溶性MICA蛋白的检测阈值为0.1ng/ml。
统计分析
使用4.0b版GraphPad Prism软件，根据数据是否正态分布，通过单因素方差分析，student’s t检验或曼-惠特尼(Mann-Whitney)秩和检验评价组间差异的统计学显著性。卡方分析用于比较各个独立组之间的sMIC频率。受试者工作特征曲线分析(ROC)用于分析SMICA浓度截止点和它们的灵敏性/特异性。确定的截止点还用于评价相对风险和比数比。显著性p值设定为＜0.05。
结果
在IVF后经历着床失败的不孕女性中发现较高的sMIC血清水平
在所包括的170名患者中，38名在IVF后经历了成功的胚胎着床，其中30名继续妊娠，足月生育活婴，8名在成功着床后流产。3名患者在8SA，2名患者在9SA，两名患者在6SA和1名患者在7SA发生流产。病理报告(针对＞8SA流产者做出)并不支持遗传性流产。患者的特征总结在表1中。
按照记载(Hue等，2004)，用夹心ELISA测量血清sMIC。64名(38％)进行了IVF的患者具有可检测的sMIC血清水平(均值＝15.28ng/ml，低-高95％范围＝10.7-19.9ng/ml)。
虽然事实上在这些组标准化的情况下，参数与IVF结果相关联(表1)，但是阳性患者中，胚胎成功着床的女性(中值＝2.5，25-75％四分位范围：1.5-9.7)与着床失败组相比，平均sMIC水平有显著的差异(12.0，3-24.2，p＜0.021)。因此，发明人进一步研究了sMIC水平值是否可以帮助预测sMIC阳性妇女的着床失败。他们进而限定了2.45ng/ml的截止值，可以通过ROC分析进行风险评估(灵敏度82，特异性50％)。SMIC高达2.45与着床失败相关(比数比：4.6，95％CI1.08-19.79，p＝0.031)。sMIC血清水平＞27.7ng/ml通常与IVF后胚胎没有着床相关(图1)。
表1：本研究中征集的170名不育女性的特征
Figure A20088000217700261
 HCG日的雌二醇(UI)   2001±939.5   2268±1391   1912±1018.4   0.65
 收集的卵母细胞数量(均值±sd)   9.5±5.41   8.25±3.19   10.2±4.49   0.61
 受精率(％)   77.25±16.92   72.56±31.62   74.13±16.76   无显著性
 可用于移植的胚胎数量(均值±sd)   6.77±3.74   6.12±3.98   7.13±3.53   0.75
 移植胚胎的平均值   2.044±0.41   1.8±0.42   2.0±0   0.25
sMIC血清水平预测IVF后足月娩出活婴的几率
除了预测着床失败之外，发明人还前瞻性地分析了sMIC水平增加是否能够以生育活婴来预测IVF结果。的确，成功着床后(38名女性)，8名女性经历了IVF后流产，而30人生育了活婴。在阳性的情况下，发现IVF之前观察到的可溶性血清MIC值在IVF后生育的女性组中(中值＝2ng/ml，最小-最大范围：1-6ng/ml)较之经历了IVF后流产或着床失败的女性(中值＝11ng/ml，最小-最大：0.1-96ng/ml，图1)要明显地低。进而发明人还评价了可以预测实现成功妊娠而不是流产或着床失败的几率的sMIC值。使用相同的2.45ng/ml截止值(灵敏度＝82％和特异性＝75％)，当通过IVF之前的sMIC血清水平预测时，生育活婴的几率比低于2.45ng/ml阈值的要高(比数比＝13.8，CI 95％＝2.03-118，p＝0.002)。在实现了妊娠发展的女性中观察到的sMIC最高值为6ng/ml(图1)。
高sMIC值与成功着床后流产有关
虽然相对于着床成功度而言，sMIC阳性女性的频率没有显著差异(着床成功组中36％相对于着床失败组中的38％)，但是当着床成功时(38例)，在经历流产的女性组中，sMIC阳性的频率(75％)比成功足月妊娠的女性组高(26％，p＝0.03)。此外，在阳性时，在IVF后经历流产的组中表现出IVF前的中值sMIC血清水平(中值＝9.7，观察到的最小-最大值＝2.5-24ng/ml)，要高于成功完成妊娠的组(中值＝2.1，最小-最大范围1-6ng/ml)。进而发明人还评价了是否能够从sMIC血清水平预测流产的风险。虽然在未进行IVF的妊娠女性总人群中，较高的sMIC血清水平并不与发生流产相关，但是本发明人能够表明，在IVF之后成功着床时，较高的sMIC与IVF之后得到的妊娠期间的流产发生有关。的确，使用sMIC血清水平＞3.2ng/ml的截止值(灵敏度83％和特异性75％)，sMIC能够在与足月妊娠相比较时，预测成功着床后的流产(比数比＝35，p＝0.026，95％CI 1.74-703)。当女性的sMIC血清水平＞6ng/ml时，没有观察到足月生育。
讨论
sMIC影响胚胎着床的机制尚不清楚。自然杀伤细胞在着床的早期发挥着关键作用，因为它们代表了起主要作用的免疫伙伴，控制细胞因子/趋化因子/生血管因子产生和滋养层构建(Sargent等，2006)。sMIC是广泛表达在NK和CD8和γδ T淋巴细胞上的激活性NKG2D受体的众多配体之一。激活性NKG2D受体被NKG2D配体接合，其中可溶性MIC是NK-介导的细胞毒活性，增殖和细胞因子产生的协同刺激信号(Andre等，2004；Bryceson等，2006；Raulet等，2003；Sutherland等，2002；Upshaw等，2006)。另外，sMIC-诱导其NKG2D受体的内化已被描述成下调抗肿瘤NK细胞活性的机制(Wu等，2004)。NKG2D被胎盘来源的可溶性MIC下调，近来已经被提示为是有利于胎儿存活的免疫逃逸机制(Mincheva-Nilsson等，2006)。因此，NKG2D受体及其配体之间相互作用，导致调节uNK-细胞的全部细胞因子或溶胞活性，可能影响着床环境并有损于IVF后的成功妊娠。
因此，发明人的主要发现在于，将会经历着床和妊娠失败的女性在IVF之前，普遍有胁迫诱导的免疫刺激性MHC I类链相关分子。sMIC的血清水平大于2.45ng/ml预测了着床失败率较高的子宫，而sMIC血清水平＞6ng/ml从不产生足月发展的妊娠，而水平＞28ng/ml通常与IVF失败相关。此外，着床成功后，MIC水平＞3.2ng/ml的女性处于IVF后发生流产的高风险。对IVF后没有实现成功妊娠的女性血清中sMIC蛋白水平提高可能有贡献的根源和不育状况相关的机制，尚未揭开。据报告，sMIC从MIC-表达细胞的细胞膜上释放涉及被金属蛋白酶切割(Waldhauer等，2006)。在反复着床失败的患者中，已经报道了金属蛋白酶活性改变(Shibahara等，2005)。对于产生可溶性MIC的机制和sMIC对与IVF后着床失败或妊娠失败有关的免疫功能的影响的进一步研究，现在是要探索的挑战性课题。本研究的共同作者对于乳糜泻的研究(Hue等，2004)认为事实上sMIC也是自身或同种免疫过程的标记，乳糜泻被报告不育的发生率较高(Meloni等，1999)，提示sMIC可能是母亲排斥胚胎的较高自身或同种反应性潜力的信号。
总之，鉴于IVF的经济和心理牵涉高，本研究首先提供了论据，即血清(seric)sMIC定量可以被视为应用于非侵入性评价和预测IVF结果的新参数。除了它的预后价值之外，该生物标记的主要价值是其在女性开始激素调节治疗之前，确定其用量的可能性。因此，这些特征应当改善心理咨询或管理IVF相关的风险，结果进而为不育女性健康的护理提供益处。
实施例2：女性血管型妊娠病的血浆中发现高频率的可溶性MIC
妊娠产生了独特的状态，其中广泛的血管生成和建立母体免疫耐受性使得胎儿和胎盘可以成功发育。滋养层胎儿细胞和母体免疫细胞之间的交谈，调节了早期妊娠的胎盘发育，血管生成和胎儿的免疫耐受性。胎盘形成不充分导致血管型妊娠病(VPD)，包括先兆子痫(PE)，宫内发育迟缓(IUGR)和反复的妊娠失败，这些代表了胎-母发病率和死亡率的主因。先兆子痫的特征是怀孕20周之后的高血压和蛋白尿。尽管近来在了解胎盘血管化不充分(螺旋动脉不完全重构)为何可以导致血管型妊娠病上有进步，但它们的预后仍然严重，并且取出胎盘仍然是管理严重先兆子痫和大部分宫内生长阻滞的唯一治疗方法。
实施例2a
材料和方法
受试者
在49名经历过血管型妊娠病(VPD)的女性中评价可溶性MIC血浆水平，血管型妊娠病包括血管型宫内发育迟缓(IUGR)，先兆子痫(PE)或胎死宫内(IUFD)，并与来自匹配妊娠期限(平均29周)的正常进行妊娠的53名女性的血浆对照组相比较。
方法
PE被定义为动脉舒张血压大于90mm Hg，收缩压大于140mmHg，合并蛋白尿(超过300mg/24h)。另外，报告有针对母体和胎儿的不利后果的风险增加相关的严重母体并发症，特别是与HELLP综合征相关(H＝溶血；EL＝肝脏酶增加；和LP＝低血小板)(Weinstein等，2005)和导致肾衰的少尿。
血管型IUGR被定义为以超声图测量，孕龄＜2.5百分位点，合并有至少一种“胎盘功能不全”的生物或超声标记，如子宫异常，或脐动脉多普勒(Chien等，2000)或血浆纤连蛋白水平升高(Ostlund等，2001)。血管型IUGR组的排除标准是胎儿存在先天畸形或染色体异常，近期巨细胞病毒或弓形体感染，创伤，妊娠期间药物或酒精滥用，以及胎儿对于孕龄而言生来就小。
IUFD通过超声检查的定义是，在12孕周后，根据按孕期的胎儿生长参数，胎儿明显没有心脏活动，发生在严重发育迟缓之后。
结果
表2：VPD组中观察到的频率高于孕期相匹配的对照组。
Figure A20088000217700301
如图2所示，在患有血管型妊娠病的女性的MIC+阳性样品中，发现了较高的MIC水平。
实施例2b
材料和方法
受试者
在知情同意之后，169名女性相继入选到这项经2年(2004-2006)时间施行的研究中。
81名存在血管型妊娠病(VPD)的患者进一步细分为3组：40名PE患者，23名血管型IUGR患者，18名胎死宫内(IUFD)患者。PE，IUGR，IUFD的定义如上面在实施例2a中所述。
25名患者存在孤立的非血管型IUGR，涉及4例胎儿染色体非整倍体，8例胎儿多发畸形综合征，3例是毒性或感染病源，剩下10例是胎儿对于孕龄而言小。非-血管型IUGR的诊断是以超声图测量，相对于孕龄＜2.5个百分位点，但纤连蛋白水平，子宫和脐动脉多普勒速度正常。
对照组由63名进行常规妇产科检查的健康妊娠女性组成，并随访至分娩，以证实正常妊娠(NP)结果。正常妊娠在17-41孕周之间征集，以将正常妊娠与VPD患者的孕期相匹配。
收集血浆
血样在诊断出血管性妊娠病或孤立IUGR时，以及在孕期匹配的正常妊娠对照组进行产科检查时收集。按照标准程序，样品收集到0.129mol/L柠檬酸钠(3.8％)中，离心并在-80°保存。
捕获ELISA测定sMICA/B
使用以前记载的夹心酶联免疫吸附分析(Hue等，2004)，测量血浆中的可溶性MIC浓度。在各实验中用作标准的重组可溶性MICA蛋白的检测阈值为0.1ng/ml，血浆水平高于0.3ng/ml被认为是阳性。
统计
所进行的分析是用Prism软件(GraphPad 4.0b，GraphPad，SanDiego，CA)执行非参数Kruskal-Wallis检验，然后是Dunn事后检验，以比较3个或多个连续变量，曼-惠特尼检验比较2个未配对的组，Wilcoxon配对检验用于NKG2D表达和CD107a脱粒分析结果。数据根据分布表达为中值[范围]和平均值(sd)。范畴变量之间的关联在交叉列表之后通过Pearson卡方检验(和如果n＜5的话，通过fisher确切检验)进行检验。通过spearman检验提供相关性。95％置信区间(p＜0.05)被认为有显著性。
对取样时的产次，孕次，收缩和舒张血压，孕龄；分娩时期和出生时的婴儿体重参数进行多元分析，以鉴定与检测血浆中可溶性MIC有关的独立标记。
结果
患有血管型妊娠病女性中血浆sMIC的频率增加
在3组孕期匹配的NP，VPD或非-血管型IUGR女性中评价sMIC的血浆水平。取样时正常妊娠，VPD和非-血管型IUGR之间的年龄，孕次，体重指数和孕龄没有发现显著性差异。VPD女性的收缩和舒张血压明显较高。正如预期，VPD和非-血管型IUGR组与正常妊娠相比较，分娩时的婴儿出生体重和孕龄的中值均明显较低(p＜0.001)。这些患者的主要临床和生物学特征总结在表3中。
表3：研究人群的特征
正常妊娠 血管型妊娠病   非血管型IUGR p值
  患者人数   63   81   25
  年龄(岁，均值±sd)   29.6±6.6   30.2±6.3   29±6.3   无显著性
  孕次(n)   3[1-9]   2[0-7]   2[0-6]   无显著性
  产次(n)   1[0-5]   0[0-4]   0[0-3]   无显著性
  体重指数(kg/cm2)   23[17-48]   23.1[16.3-37.2]   23[18-37]   无显著性
  收缩血压(mmHg)   12[10-13]]   14[10-22]   12[10-13]   p＜0.001*
  舒张血压(mmHg)   7[5-8.3]   8.7[6-12]   7[5.5-8.5]   p＜0.001*
  宫高(cm)   32[29-38]   26[15-36]   26[15-36]   p＜0.001§
  取样时的孕期(孕周) 31.7[15.3-41] 30[17-41] 30[17-41] 无显著性
  分娩时期(孕周)   40.3[35-42]   32.3[17-41.1]   32[22-41]   p＜0.001§
  出生时婴儿体重(g)   3300[2640-4680]   1330[80-3410]   1745[400-2500]   p＜0.001§
用非参数Kruskal-Wallis检验，然后是Dunn事后检验进行组间比较。值表示为中值[25-75四分位范围]
*p＜0.001血管型妊娠病和其它组之间
§p＜0.001正常妊娠和其它组之间
NP组中，63名女性中只有1人的血浆sMIC水平低(0.5ng/ml)。但是，必须注意到，该患者随访的是全身性红斑狼疮，妊娠发展正常。在25名非-血管型IUGR女性中，1人有检测得到的sMIC血浆水平(1.63ng/ml)。反之，在VPD组的81名患者中，26名(32％)测得sMIC分子(与NP相对照，p＜0.0001)。此外，先兆子痫患者中sMIC水平(中值，25-75四分位范围：7.5ng/ml，1.37-32.69)明显比在IUFD(2.18ng/ml，0.86-7.58，p＜0.01)和血管型IUGR(1.63ng/ml，0.86-5.2，p＜0.05)中高(表4)。
表4：研究人群中sMIC检测和血浆水平的频率
  sMIC阳性血浆频率人数(比例％)   sMIC频率与正常妊娠对照组的比较   阳性样品中的中值sMIC血浆水平(ng/ml)[25-75四分位范围]
 正常妊娠(n＝63) 1(1.6％) - 0.5
 血管型妊娠病(n＝81) 26(32％) p＜0.0001 2.2[1.15-11.47]
 先兆子痫(n＝40)   9(22.5％)   p＜0.0008   7.5[1.37-32.69]
 血管型IUGR(n＝23) 9(39％) p＜0.0001 1.63[0.86-5.2]
 IUFD(n＝18)   8(44％)   p＜0.0001   2.18[0.86-7.58]
 非血管型IUGR(n＝25) 1(4％) 无显著性 1.63
血浆sMIC的存在鉴别严重先兆子痫亚组
然后，根据诊断时的孕期，收缩或舒张血压，蛋白尿定量，尿酸和纤连蛋白血浆水平，脐带和子宫动脉多普勒流速波形分析，分娩时期和婴儿出生体重(表3)，确定母体血浆中存在sMIC是否与表征严重先兆子痫的临床，生物学或声谱标记相关。sMIC-阳性和-阴性患者的收缩或舒张血压，纤连蛋白和尿酸水平之间没有差异。但是，反映肾衰的每日中值蛋白尿，在sMIC-阳性血浆的PE女性中显著高于没有可检测sMIC的PE女性(p＝0.04，图3A)。对取样时的产次，孕次，收缩和舒张血压，孕龄；分娩期限和出生时的婴儿体重进行多元分析，进一步证实了蛋白尿与sMIC存在独立相关。另外，PE时进行声谱分析母体子宫动脉多普勒流速波形显示，反映胎盘功能不全的子宫双侧舒张早期切迹在PE的sMIC-阳性组中更为频繁(p＝0.037，图3B)。然后对与sMIC血浆检测有关的PE患者中的严重母体并发症频率进行了研究。在9名有sMIC-阳性血浆的PE女性中，3人(33％)存在伴有急性肾功能不全的少尿，比较之下，31名检测不到血浆sMIC的PE女性只有1人(3.2％)(p＝0.03)。此外，HELLP综合征的频率，在与sMIC阴性PE组相比较时(31名患者中1人，3.2％，p＝0.1)，在sMIC阳性PE组中倾向于升高(9名患者中2人，22.2％)。
血浆中存在sMIC与血管型IUGR有关
为了研究血浆sMIC的存在是否与IUGR的血管来源相关，发明人比较了血管型和非血管型IUGR女性的sMIC的水平。在血管型IUGR的23名患者中，9名(39％)与25名非血管型IUGR患者只有1名(4％)相比具有可检测的血浆sMIC(OR＝15.43[1.763-135]，p＝0.0038)。因此，虽然年龄，取样时的孕期，婴儿出生体重和分娩期限在2组之间没有差异，但母体血浆中sMIC的存在与血管型IUGR明显相关。此外，阳性sMIC血浆预测IUGR的血管病因具有90％阳性预测值(96％特异性和39％灵敏度)和63％阴性预测值。
讨论
本发明人的结果表明，可溶性MIC分子在血管型妊娠病女性的血浆中的检出频率比孕龄相匹配的正常妊娠者更高。此外，sMIC血浆水平与先兆子痫的严重性相关，并看来是血管型IUGR的特异性标记。
先兆子痫是原因不明的多系统疾病，是人类妊娠独有的。其中，先天易栓性缺陷与VPD的发生有关。已经鉴别了新的炎症和血栓症标记，但没有临床应用(Levine等，2006，Bretelle等，2003和2005)。此外，高蛋白尿与母体和胎儿不良结果的风险增加有关(Chan等，2005)。但是，蛋白尿不能独立预测不良结果，并且没有蛋白分泌的阈值可以预测炎症先兆子痫并发症。在现有技术中，尚未鉴别出PE严重性的临床数据相关标记。
鉴于本发明人的结果，母体血浆中sMIC的存在，提供了PE严重性的新临床相关标记。任选需要的话，该参数也能与其它参数组合，以增加预测先兆子痫的灵敏度水平。
母体血浆中sMIC的存在与多重起源的血管病的另一种亚型——IUGR有关，IUGR的预后取决于起因，严重性和诊断时期。胎盘异常导致的胎盘功能不全构成了称为血管型IUGR的IUGR的主因。大多数血管型IUGR与PE有关，并共有相同的病理生理。反之，孤立的IUGR可能代表了严重胎儿缺陷，非整倍体或与异常神经结果相关的遗传综合征的唯一声谱标记，从而在这样的情况下患者可以请求终止妊娠。在存在有PE，母体血管标记(纤连蛋白，高尿酸水平)或子宫多普勒血流测量波形(waveflow)的情况下，有时易于诊断血管型IUGR。但是，在现有技术中，缺乏可以区分血管型与非血管型IUGR的非侵入性和特异性标记。例如，用于预测IUGR中胎盘缺氧-缺血病变的子宫多普勒流速测量指标显示出对于97％的灵敏度来说，特异性只有63％。在缺乏明显的IUGR病因的情况下，需要侵入性胎儿探查以确定胎儿预后，这具有不可忽视的早产和晚期流产率。
发明人的结果显示在女性血浆中检测sMIC使得可以预测血管病源的IUGR，特异性为96％。因此，IUGR诊断时的sMIC定量构成了有用的非侵入性工具，以改善自发性IUGR的管理。
这些结果显示，对女性血浆中的sMIC分子进行定量是有用的非侵入性工具，用于预测妊娠期间血管型并发症的紧急发作。
实施例3：在着床失败的情况下，在卵泡液，胚胎上清液，精液和用于胚胎移植的导管中发现较高频率的可溶性MIC。
在卵泡液(FF)，移植胚胎的上清液(T胚胎)或未移植胚胎(UT)的上清液，用于IVF(T)或未用于IVF(UT)的精液，和用于胚胎移植(KT)的导管中，评价了可溶性MIC水平。在着床失败的情况下，观察到可溶性MIC的存在频率更高，如表5所示。
表5
  着床是/否   妊娠进展  sMIC FF  MIC T胚胎   MIC UT胚胎  MIC精液T   MIC精液UT   MIC KT
  是   产子  0   0.84  nt   nt   nt
  是   产子  0  0   0  nt   nt   nt
  是   产子   0   0   0   0   0   0
  是   产子   0   0   0   0   0   0
  是   产子   0   0   0   0   0   0
  是   产子   0   0   0   0   0   0
  是   产子   0   0   0   0   0   0
  是   产子   0   0   0   0   0   0
  是   产子   0   0   0   0   0   0
  是   产子   0   0   0   0   0   0
  是   产子   0   0   0   0   0   0
  是   流产   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   7.5   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   nt
  否   0   0   1.5   2.8   1.6   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   17   nt
  否   0   0   3.5   nt   nt   nt
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   1.08   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   90.74   0   0.64   0   0   2.34
  否   0   0   0   0   9.6   nt
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   nt   nt   nt
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   0   0
  否   0   0   0   0   2.4   0
  否   0   0.6   0   nt   nt   nt
  否   0   0.89   0.35   nt   nt   nt
  否   0   1.5   0   0   nt   0
  否   nt   nt   0   0   0   0
  否   0   nt   nt   0   0   nt
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Wu JD，et al(2004)J Clin Invest 114，560-568.
             序列表
<110>地中海大学
     法国国家卫生及研究医学协会
<120>用于生殖医学和生物学的生物标记
<130>SCT092530-90
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer
<400>1
catgtttctg ctgttgctgc tg    22
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>pr imer
<400>2
gtggcatccc tgtggtcact c     21

Claims (35)

1.用于确定体外受精(IVF)结果的方法，包括体外分析样品中的MICA(MHCI类链相关蛋白A)，MICA水平是IVF结果的指示，特别是着床失败率，IVF失败和/或流产的指示。
2.根据权利要求1的方法，其中样品选自：
-接受移植胚胎的女性的血液，血浆，血清，子宫内膜活检物，子宫液，阴道和宫颈分泌物，宫颈粘液，道格拉斯陷凹和腹腔镜探查(子宫内膜异位，盆腔粘连，感染性后遗症)情况下的腹膜液样品；
-提供精液的男性的血液，血浆，血清和精液样品；
-提供卵母细胞的女性的血液，血浆，血清，子宫内膜活检物，子宫液，阴道和宫颈分泌物，宫颈粘液，道格拉斯陷凹，卵泡液和腹腔镜探查(子宫内膜异位，盆腔粘连，感染性后遗症)情况下的腹膜液样品；和
-胚胎上清液或胚胎培养基样品。
3.根据权利要求1或2的方法，其中样品是血液，血浆或血清样品，优选血清样品。
4.根据权利要求3的方法，其中对象是准备接受移植胚胎的女性，在激素调节治疗开始之前测定可溶性MICA水平，并且血清样品中MICA水平大于2.45ng/ml是较高着床失败率的指示。
5.根据权利要求3的方法，其中对象是准备接受移植胚胎的女性，在激素调节治疗开始之前测定可溶性MICA水平，并且血清样品中MICA水平大于28ng/ml是高概率IVF失败的指示。
6.根据权利要求3的方法，其中对象是准备接受移植胚胎的女性，在激素调节治疗开始之前测定可溶性MICA水平，并且血清样品中MICA水平大于6ng/ml是高概率流产的指示。
7.根据权利要求3的方法，其中对象是接受移植胚胎的女性，在着床之后也测定可溶性MICA蛋白的水平，并且血清样品中MICA水平大于3.2ng/ml是高概率流产的指示。
8.选择IVF对象的方法，包括体外分析样品中的MICA，并选择MICA水平指示成功IVF概率的对象。
9.根据权利要求8的方法，其中样品选自血液，血浆，血清，子宫内膜活检物，子宫液，阴道和宫颈分泌物，宫颈粘液，道格拉斯陷凹和腹腔镜探查(子宫内膜异位，盆腔粘连，感染性后遗症)情况下的腹膜液样品。
10.根据权利要求8或9的方法，其中样品是血液，血浆或血清样品，优选血清样品。
11.根据权利要求10的方法，其中在激素调节治疗开始之前测定可溶性MICA水平，并且血清样品中可溶性MICA水平低于28ng/ml，优选低于6ng/ml和更优选低于2.45ng/ml是成功IVF概率的指示。
12.在对象中测定精液或游动精子质量或确定男性不育概率的方法，包括体外分析对象的血液，血清，血浆或精液样品中的MICA，MICA水平是精液或游动精子质量或者男性不育的指示。
13.用于确定胚胎质量或用于选择适合胚胎移植，体外受精或着床的胚胎的方法，包括体外分析胚胎培养基或上清液中的MICA，MICA水平是胚胎质量或胚胎对于胚胎移植，体外受精或着床适合性的指示。
14.用于确定对象妊娠并发症概率的方法，所述妊娠并发症包括流产，血管型妊娠病(VPD)，先兆子痫(PE)，合并或不合并先兆子痫的血管型宫内发育迟缓(IUGR)，HELLP综合征，妊娠期脂肪变性，妊娠期肾病或胎死宫内(IUFD)，与自身免疫病相关的妊娠疾病或不育症，该方法包括体外分析样品中的MICA，MICA水平是妊娠并发症概率的指示。
15.用于确定对象严重先兆子痫概率的方法，包括体外分析样品中的MICA，MICA水平是严重先兆子痫概率的指示。
16.根据权利要求14或15的方法，其中样品选自血液，血浆，血清，胎盘，脐带血，内皮细胞和羊膜液样品。
17.根据权利要求16的方法，其中样品是血液，血浆或血清样品，优选血清样品。
18.根据权利要求17的方法，其中检测样品中可溶性MICA优选至少为0.3ng/ml，是较高概率的VPD，先兆子痫，血管型IUGR和/或IUFD的指示。
19.用于区分对象的血管型与非血管型宫内发育迟缓(IUGR)的方法，包括体外分析样品中的MICA，MICA水平是血管型IUGR概率的指示。
20.根据权利要求19的方法，其中样品是血液，血浆或血清样品，优选血清样品。
21.根据权利要求20的方法，其中检测样品中可溶性MICA优选至少为0.3ng/ml，是血管型IUGR的指示。
22.根据权利要求1-4，8-10，12-17和19-20任一项的方法，其中分析样品中MICA的步骤包括选自下面的步骤：
-分析样品中可溶性MICA蛋白；
-分析编码MICA的无细胞核酸；和
-分析样品中存在的抗-MICA抗体。
23.根据权利要求1-21任一项的方法，其中分析样品中MICA的步骤包括将样品与抗-MICA抗体，优选单克隆抗-MICA抗体相接触。
24.根据权利要求23的方法，其中分析样品中可溶性MICA的步骤通过ELISA分析，优选通过夹心ELISA分析进行。
25.根据权利要求1-24任一项的方法，其中分析MICA与分析一种或多种其它标记相组合。
26.根据权利要求25的方法，其中所述其它标记选自HLA-G和生血管标记。
27.根据权利要求26的方法，其中所述生血管标记选自内皮糖蛋白，PIGF和sFLT1。
28.包含选自下列至少一种成分的试剂盒在生殖医学和生物学中的应用：抗-MICA抗体，编码MICA的核酸的特异性引物组，编码MICA的核酸的特异性探针，和MIC蛋白，优选MICA蛋白。
29.根据权利要求28的应用，用于选择适合IVF的对象，用于确定体外受精(IVF)结果，用于确定精液或游动精子质量，用于选择适合IVF的精液或游动精子，用于确定对象中男性不育的概率，用于确定胚胎质量，用于选择适合胚胎移植，体外受精或着床的胚胎，用于鉴别在妊娠期间有高并发症风险的对象，特别是流产，血管型妊娠病，先兆子痫，合并或不合并先兆子痫的宫内发育迟缓(IUGR)，HELLP综合征，妊娠期脂肪变性，妊娠期肾病或胎死宫内的易感对象，用于确定先兆子痫的严重性，或用于区分血管型与非血管型宫内发育迟缓(IUGR)。
30.根据权利要求28或29的应用，其中抗-MICA抗体是单克隆抗体。
31.权利要求28-30任一项的应用，其中试剂盒还包含可溶性MICA蛋白。
32.权利要求28-31任一项的应用，其中试剂盒还包含一种或多种选自特异性针对一种或多种其它标记的抗体，引物和探针的成分。
33.根据权利要求32的应用，其中所述其它标记选自HLA-G和生血管标记。
34.根据权利要求33的应用，其中所述生血管标记选自内皮糖蛋白，PIGF和sFLT1。
35.权利要求32-34任一项的应用，其中分析一种或多种其它标记的所述成分选自HLA-G，内皮糖蛋白，PIGF或sFLT1抗体，编码HLA-G，内皮糖蛋白，PIGF或sFLT1的核酸的特异性引物组，和编码HLA-G，内皮糖蛋白，PIGF或sFLT1的核酸的特异性探针。
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