JP2005245294A - 体外操作胚の正常性の判定又はスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】動物胚における遺伝的な異常を早い段階で検出するための手段を提供し、動物胚の効率的なスクリーニング技術を提供すること。
【解決手段】
胚の後期発生(胚性ゲノム活性化後)、着床、分化に重要な関わりがある少なくとも1の遺伝子に着目し、これをマーカーにすればより簡便に遺伝子発現の異常を判定することができることを見出し本発明を完成した。本発明によると、胚の正常性を早期に確認する事ができ、動物胚作製技術の優劣の指標とすることができる。また、本発明の方法により、遺伝子レベルにおいて正常であるとスクリーニングされた胚、又はスクリーニングによって正常な核移植胚の作製が保証された技術を用いて作製された再構築胚を胚受容雌に移植すれば、動物胚作製技術の開発における効率の向上、及び実験に供試する卵子や胚受容雌などに用いる雌動物個体自体の削減にもつながる。
【解決手段】
胚の後期発生(胚性ゲノム活性化後)、着床、分化に重要な関わりがある少なくとも1の遺伝子に着目し、これをマーカーにすればより簡便に遺伝子発現の異常を判定することができることを見出し本発明を完成した。本発明によると、胚の正常性を早期に確認する事ができ、動物胚作製技術の優劣の指標とすることができる。また、本発明の方法により、遺伝子レベルにおいて正常であるとスクリーニングされた胚、又はスクリーニングによって正常な核移植胚の作製が保証された技術を用いて作製された再構築胚を胚受容雌に移植すれば、動物胚作製技術の開発における効率の向上、及び実験に供試する卵子や胚受容雌などに用いる雌動物個体自体の削減にもつながる。
Description
本発明は、正常胚の胚性ゲノム活性化前から胚性ゲノム活性化後に発現する遺伝子、特に胚の後期発生(胚性ゲノム活性化後)、着床、及び分化に重要な関わりがある少なくとも1の遺伝子をマーカーにする、体外操作胚の遺伝子レベルでの正常性の判定又はスクリーニング方法、および該スクリーニング法を取り入れた、体外培養下にある動物胚を操作するための方法に関する。また、本発明は、細胞培養環境又は核移植に代表される体外操作プロトコールが動物胚の発生異常を誘発するか否かの検討における該スクリーニング方法の使用に関する。
通常の受精、着床、出産は、受精卵(精子の卵子内への陥入)の卵割(2〜4cell、8〜16cell、桑実胚)から胚盤胞への着床に至り出産となる。体細胞核移植技術では、単離、培養された、又は遺伝子組換えなどがされたドナー細胞核を除核した未受精卵に移植し、適当な培養後に活性化を誘起し、クローン胚を発生させて得られた胚を胚受容雌に移植し、着床、そして出産を経てクローン動物の作出が行われる(特許文献1)。
しかし、これまでのクローン動物の作出における問題点は、個体の作出効率が低い、特に着床以後の発生率、すなわち着床・出産率が低いというようなものであった。これらは胚の遺伝子の発現異常が引き起こす発生異常によるものがほとんどであった。代表的な例として、ウシやマウスで顕著に起こる胎仔の肥大異常(LOS=LargeOffspring Syndrome、巨大子症候群)が挙げられる(特許文献1)。
原因の大きなものとして不完全な初期化が推定される。ドナー細胞の核は、除核未受精卵の卵細胞質内に移植することによって、全ての遺伝子がリセットされた状態に戻る(初期化)。初期化が成功すると、胚の発生が正常に進行し、着床・出産に至るが、初期化が不完全だと、胚の遺伝子の発現異常が起こり、発育・着床不全などを起こして発生を停止して死に至るのである。
核移植技術の開発においては効率向上が望まれているが、これまで核移植技術の優劣の指標である核移植胚(クローン胚)の正常性の判定方法は不十分であった。従来、核移植胚の正常性の指標としては、胚の体外培養成績(分割率、生存率、胚盤胞形成率、胚盤胞の細胞数など)に依存してきた。しかし、核移植胚の発生異常は着床以後に起こることが多く、胚受容雌に移植しなければ、胚の個体への発生能は判定できない。体外培養では着床以前(胚盤胞まで)までしか発生を進めることができないため、体外培養成績による判定は明確な差が現れず、核移植技術の優劣が判定できないことが多い。
特表2002-525618号
本発明の課題は、体外操作胚である動物胚における遺伝的な異常を早い段階で検出するための手段を提供し、動物胚の効率的なスクリーニング技術を提供しようとするものである。
本発明者は、正常胚の胚性ゲノム活性化前から胚性ゲノム活性化後に発現する遺伝子、特に胚の後期発生(胚性ゲノム活性化後)、着床、分化に重要な関わりがある遺伝子に着目し、これをマーカーにすればより簡便に遺伝子発現の異常を判定できることを見出し本発明を完成した。本発明によると、体外操作胚の正常性を早期に確認することができ、動物胚作製技術の優劣の指標とすることができる。
すなわち本発明は、以下からなる;
1.正常胚の胚性ゲノム活性化前から胚性ゲノム活性化後に発現する遺伝子をマーカーにすることを特徴とする体外操作胚の遺伝子レベルでの正常性の判定又はスクリーニング方法。
2.正常胚の胚性ゲノム活性化前から胚性ゲノム活性化後に発現する遺伝子が、胚の後期発生(胚性ゲノム活性化後)、着床、分化に重要な関わりがある少なくとも1の遺伝子である前項1の方法。
3.分析されるマーカー遺伝子が、FGFr(FGFr2IIIc,FGFr72IIIb)、Xist、IL-6、IL-6rを各コードする遺伝子から選ばれる少なくとも一である前項1又は2の方法。
4.スクリーニング指標が、遺伝子の発現(mRNA)又は発現量である前項1〜3の何れか一に記載の方法。
5.体外操作胚が、核移植胚、顕微授精胚、前核注入胚、又は凍結胚である前項1〜4の何れか一に記載の方法。
6.判定時期が、体外操作胚の胚性ゲノム活性化前、又は体外操作胚の胚性ゲノム活性化後である前項1〜5の何れか一に記載の方法。
7.判定時期が、体外培養1日目、又は6〜7日目である前項6に記載の方法。
8.分析が以下のいずれかである前項1〜7の何れか一に記載の方法;
1)動物胚において遺伝子の発現の分析
2)核移植胚と正常受精胚の遺伝子発現を分析し、比較する。
3)核移植胚と正常受精胚の遺伝子発現量を分析し、比較する。
9.対象動物が、哺乳動物又はその遺伝子改変動物から選ばれる前項1〜8の何れか一に記載の方法;
10.核を提供するドナー細胞が以下のいずれかから選ばれる前項1〜9の何れか一に記載の方法;
1)対象動物種の体細胞
2)遺伝子組換えを施した培養体細胞
3)ES細胞
4)EG細胞
11.核を提供するドナー細胞が、胎仔繊維芽細胞、又は遺伝子組換えした胎仔繊維芽細胞である前項10に記載の方法。
12.核移植の受容体となるレシピエント細胞が以下のいずれかから選ばれる前項1〜11の何れか一に記載の方法;
1)未受精卵
2)体外成熟卵
2)ES細胞
3)EG細胞
13.前項1〜12の何れか一に記載の方法を使用する動物胚の最適培養条件の検討方法。
14.以下のような工程を含む動物胚を再構築するためのスクリーニング方法;1)除核未受精卵の同時活性化は行わずに第2減数分裂の分裂中期で停止したレシピエント細胞である除核未受精卵内に二倍体核を移植する段階、
2)胚が出生に至ることが可能となる十分な期間にわたってドナー細胞からの核をレシピエントの細胞質と接触した状態に保つ段階、
3)正しい倍数性を維持しながら再構築した胚を活性化する段階、
4)核移植胚から得た生物試料における胚の後期発生(胚性ゲノム活性化後)、着床、分化に重要な関わりがある少なくとも1の遺伝子の発現を分析することによって動物胚の正常性に関してスクリーニングすることを含む胚の培養を行う段階。
15.配列表1〜21に記載のプライマー及びプローブから選ばれる少なくとも1の配列を利用した前項1〜14の何れか一に記載の方法。
16.前項1〜15の何れか一に記載の方法に使用する試薬キット。
17.配列表1〜21に記載のプライマー及びプローブから選ばれる少なくとも1の配列を試薬として含む前項16の試薬キット。
1.正常胚の胚性ゲノム活性化前から胚性ゲノム活性化後に発現する遺伝子をマーカーにすることを特徴とする体外操作胚の遺伝子レベルでの正常性の判定又はスクリーニング方法。
2.正常胚の胚性ゲノム活性化前から胚性ゲノム活性化後に発現する遺伝子が、胚の後期発生(胚性ゲノム活性化後)、着床、分化に重要な関わりがある少なくとも1の遺伝子である前項1の方法。
3.分析されるマーカー遺伝子が、FGFr(FGFr2IIIc,FGFr72IIIb)、Xist、IL-6、IL-6rを各コードする遺伝子から選ばれる少なくとも一である前項1又は2の方法。
4.スクリーニング指標が、遺伝子の発現(mRNA)又は発現量である前項1〜3の何れか一に記載の方法。
5.体外操作胚が、核移植胚、顕微授精胚、前核注入胚、又は凍結胚である前項1〜4の何れか一に記載の方法。
6.判定時期が、体外操作胚の胚性ゲノム活性化前、又は体外操作胚の胚性ゲノム活性化後である前項1〜5の何れか一に記載の方法。
7.判定時期が、体外培養1日目、又は6〜7日目である前項6に記載の方法。
8.分析が以下のいずれかである前項1〜7の何れか一に記載の方法;
1)動物胚において遺伝子の発現の分析
2)核移植胚と正常受精胚の遺伝子発現を分析し、比較する。
3)核移植胚と正常受精胚の遺伝子発現量を分析し、比較する。
9.対象動物が、哺乳動物又はその遺伝子改変動物から選ばれる前項1〜8の何れか一に記載の方法;
10.核を提供するドナー細胞が以下のいずれかから選ばれる前項1〜9の何れか一に記載の方法;
1)対象動物種の体細胞
2)遺伝子組換えを施した培養体細胞
3)ES細胞
4)EG細胞
11.核を提供するドナー細胞が、胎仔繊維芽細胞、又は遺伝子組換えした胎仔繊維芽細胞である前項10に記載の方法。
12.核移植の受容体となるレシピエント細胞が以下のいずれかから選ばれる前項1〜11の何れか一に記載の方法;
1)未受精卵
2)体外成熟卵
2)ES細胞
3)EG細胞
13.前項1〜12の何れか一に記載の方法を使用する動物胚の最適培養条件の検討方法。
14.以下のような工程を含む動物胚を再構築するためのスクリーニング方法;1)除核未受精卵の同時活性化は行わずに第2減数分裂の分裂中期で停止したレシピエント細胞である除核未受精卵内に二倍体核を移植する段階、
2)胚が出生に至ることが可能となる十分な期間にわたってドナー細胞からの核をレシピエントの細胞質と接触した状態に保つ段階、
3)正しい倍数性を維持しながら再構築した胚を活性化する段階、
4)核移植胚から得た生物試料における胚の後期発生(胚性ゲノム活性化後)、着床、分化に重要な関わりがある少なくとも1の遺伝子の発現を分析することによって動物胚の正常性に関してスクリーニングすることを含む胚の培養を行う段階。
15.配列表1〜21に記載のプライマー及びプローブから選ばれる少なくとも1の配列を利用した前項1〜14の何れか一に記載の方法。
16.前項1〜15の何れか一に記載の方法に使用する試薬キット。
17.配列表1〜21に記載のプライマー及びプローブから選ばれる少なくとも1の配列を試薬として含む前項16の試薬キット。
本発明の方法により、遺伝子レベルにおいて正常であるとスクリーニングされた胚、又はスクリーニングによって正常な核移植胚の作製が保証された技術を用いて作製された再構築胚を胚受容雌に移植すれば、動物胚作製技術の開発における効率の向上、及び実験に供試する卵子や胚受容雌などに用いる雌動物個体自体の削減にもつながる。
本発明の動物胚作製技術において対象とする動物は、広くクローン技術が適用される分野で利用可能な動物、特に哺乳動物又はその遺伝子改変動物である。好適な例としては例えばブタが例示され、その他の好適な動物としては、遺伝子組換えされた、例えばトランスジェニック、ノックアウト、ノックイン等のブタが例示される。その他、有蹄動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ等が例示される。さらに、マウスもしくは上記有蹄動物の遺伝子改変動物、特にトランスジェニック動物等が好適に例示される。
本発明で体外操作胚とは、核移植胚をも含めた広義の意味で、核移植胚、顕微授精胚、前核注入胚、又は凍結胚等を好適に例示する。核移植胚の例示としては、ブタ核移植胚が、好適な例である。また、遺伝子組換えブタ核移植胚も同様に例示される。その他、有蹄動物であるウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ等や、マウス等の哺乳動物の核移植胚、及びこれら哺乳動物の遺伝子組換え核移植胚も例示される。そして、体外培養胚、体外成熟卵に精子細胞を導入して得られる胚、及び他体外成熟卵を使用する胚等も好適に例示される。
本発明で分析対象とされる遺伝子は、正常胚の胚性ゲノム活性化前から胚性ゲノム活性化後に発現する遺伝子である。特に、この期における遺伝子的な異常が、体外操作胚のその後の運命に大きく寄与するものであることを本発明は見出したのである。胚性ゲノム活性化とは、受精後の卵(母性、母方)ゲノムのみが活動している状態から、胚ゲノムとしての活動を開始し、発現様式が切り替わることを意味する。この胚性ゲノムの活性化の時期は、動物種により異なる。例えば、ブタ胚の場合、胚性ゲノム活性化前は体外培養1日目、或いは20〜29時間目程度の期間をいい、胚性ゲノムの活性化後は体外培養6〜7日目、或いは149〜175時間目程度の期間をいう。そして、正常胚の胚性ゲノム活性化前から胚性ゲノム活性化後に発現する遺伝子は、具体的には、胚の後期発生(胚性ゲノム活性化後)、着床、分化に重要な関わりがある遺伝子である。好適に例示される遺伝子は、FGFr(FGFr2IIIc、FGFr72IIIb)、Xist、IL-6、IL-6rを各コードする遺伝子であり、これらから少なくとも一を選んで分析に供される。
FGFはFibroblast Growth Factor(繊維芽細胞増殖因子)を意味し、rはreceptor(受容体)を意味する。FGFrとは、繊維芽細胞増殖因子受容体を意味し、この受容体をコードする遺伝子をマーカーにする。FGFファミリーは細胞の増殖、分化に必須で、多様な生理機能とシグナル伝達の機能を持つ。神経や筋肉の形成、血管内皮細胞の増殖、傷んだ肝臓の再生など、形態や器官の形成において重要な役割を担っている。FGF、FGFrの異常発現は細胞内へのシグナル伝達を過剰に引き起こし、癌化や骨格形成異常など重大な疾患の原因となる。胚では、着床、着床後の分化、特に中胚葉の形成や神経誘導において重要な役割を担い、FGF4、FGFr2のダブルノックアウトマウスは着床後すぐに死亡することが知られている。
ILはInterleukin(インターロイキン)を意味し、IL-6は抗体産生細胞を分化誘導する因子で、炎症性疾患や自己免疫疾患に関与している。IL-6rは、インターロイキン−6受容体を意味し、この受容体をコードする遺伝子をマーカーにする。IL-6は、胚では、胚盤胞の発達によるハッチング(hatching=透明帯脱出、胚の孵化)を促進し、母子間免疫機構および受胎が正常に機能するように働く。
Xistは、X inactive-specific transcript(X染色体不活性化因子)を意味し、X染色体の不活性化に関与する。この因子をコードする遺伝子をマーカーにする。哺乳類において、雄の性染色体はXY、雌の性染色体はXXで、雌は雄に比べて2倍量のX染色体を持つため、初期胚においてX染色体の片方が不活性化され、遺伝子発現が抑制される。XistはX染色体の不活性化に必須の遺伝子の1つで、雌において特異的に機能する。マウス雄胚においてはXist発現量は8cellまでは著しく低く、胚盤胞で非常に低いがRT-PCRによって検出可能である。マウス雌胚においては2cellから発現を開始し、4cellからRT-PCRによって検出可能、8cell以降発現量が増加し、胚盤胞では安定して強い発現を示す。
本発明の系においては、当該選択された遺伝子の発現パターン及び/又は量を指標として、胚の正常性を評価可能とするものである。
ILはInterleukin(インターロイキン)を意味し、IL-6は抗体産生細胞を分化誘導する因子で、炎症性疾患や自己免疫疾患に関与している。IL-6rは、インターロイキン−6受容体を意味し、この受容体をコードする遺伝子をマーカーにする。IL-6は、胚では、胚盤胞の発達によるハッチング(hatching=透明帯脱出、胚の孵化)を促進し、母子間免疫機構および受胎が正常に機能するように働く。
Xistは、X inactive-specific transcript(X染色体不活性化因子)を意味し、X染色体の不活性化に関与する。この因子をコードする遺伝子をマーカーにする。哺乳類において、雄の性染色体はXY、雌の性染色体はXXで、雌は雄に比べて2倍量のX染色体を持つため、初期胚においてX染色体の片方が不活性化され、遺伝子発現が抑制される。XistはX染色体の不活性化に必須の遺伝子の1つで、雌において特異的に機能する。マウス雄胚においてはXist発現量は8cellまでは著しく低く、胚盤胞で非常に低いがRT-PCRによって検出可能である。マウス雌胚においては2cellから発現を開始し、4cellからRT-PCRによって検出可能、8cell以降発現量が増加し、胚盤胞では安定して強い発現を示す。
本発明の系においては、当該選択された遺伝子の発現パターン及び/又は量を指標として、胚の正常性を評価可能とするものである。
本発明において、遺伝子の発現とは、原則として遺伝子からmRNAへの転写を意味し、マーカーとするmRNAの存在の有無、又はマーカーとするmRNAの発現量として、確認される。遺伝子発現の判定時期は、胚性ゲノム活性化前、例えばブタ胚では体外培養1日目(時間的には例えば20〜29時間目、好ましくは27〜29時間目)、又は胚性ゲノム活性化後例えば体外培養6〜7日目(時間的には例えば149時間〜175時間目)に行われる。
本発明において分析操作は以下のような項目についておこなわれる。
1)動物胚において遺伝子の発現の分析
2)核移植胚と正常受精胚の遺伝子発現を分析し、比較する。
3)核移植胚と正常受精胚の遺伝子発現量を分析し、比較する。
「動物胚において遺伝子の発現を分析する。」とは、核移植以外の体外操作例えば卵の体外成熟、体外培養、精子細胞の導入を含む系の動物胚での遺伝子の発現を分析することを意味する。例えば体外成熟卵を電気刺激等の活性化処理をし、その胚を15〜30時間体外培養し、その胚を回収して遺伝子の発現を確認する。
「核移植胚と正常受精胚の遺伝子発現を分析し、比較する。」とは、核移植胚と、正常に受精した胚もしくは同等とみなしうる例えば顕微授精胚について、前記特定の遺伝子をマーカーとして分析することを意味し、遺伝子発現は、通常当該遺伝子をコードするmRNAを測定することによって確認する。その有無について両者を比較することで、当該遺伝子についての発現の正常、異常を確認するのである。
「核移植胚と正常受精胚の遺伝子発現量を分析し、比較する。」とは、核移植胚と、正常に受精した胚もしくは同等とみなしうる例えば顕微授精胚について、前記特定の遺伝子をマーカーとして定量分析することを意味し、遺伝子発現量は、通常当該遺伝子をコードするmRNAを測定することによって確認する。その発現量について両者を比較することで、当該遺伝子についての発現の正常、異常を確認するのである。
1)動物胚において遺伝子の発現の分析
2)核移植胚と正常受精胚の遺伝子発現を分析し、比較する。
3)核移植胚と正常受精胚の遺伝子発現量を分析し、比較する。
「動物胚において遺伝子の発現を分析する。」とは、核移植以外の体外操作例えば卵の体外成熟、体外培養、精子細胞の導入を含む系の動物胚での遺伝子の発現を分析することを意味する。例えば体外成熟卵を電気刺激等の活性化処理をし、その胚を15〜30時間体外培養し、その胚を回収して遺伝子の発現を確認する。
「核移植胚と正常受精胚の遺伝子発現を分析し、比較する。」とは、核移植胚と、正常に受精した胚もしくは同等とみなしうる例えば顕微授精胚について、前記特定の遺伝子をマーカーとして分析することを意味し、遺伝子発現は、通常当該遺伝子をコードするmRNAを測定することによって確認する。その有無について両者を比較することで、当該遺伝子についての発現の正常、異常を確認するのである。
「核移植胚と正常受精胚の遺伝子発現量を分析し、比較する。」とは、核移植胚と、正常に受精した胚もしくは同等とみなしうる例えば顕微授精胚について、前記特定の遺伝子をマーカーとして定量分析することを意味し、遺伝子発現量は、通常当該遺伝子をコードするmRNAを測定することによって確認する。その発現量について両者を比較することで、当該遺伝子についての発現の正常、異常を確認するのである。
mRNAの検出は、RT-PCR方法又はリアルタイムRT-PCR方法により遺伝子を増幅することによって、該当する遺伝子の発現(mRNA)又は発現量が判定される。増幅は、PCRの約30〜50サイクル程度で、十分な発現が検出できる。発現量の定量には、いくつかの方法があるが、代表的な方法として、RT-PCR方法又はリアルタイムRT-PCR方法が公知であり、検量線を設定することによって絶対的定量ができる。
核の供給源となるドナー細胞の好適な例は、卵丘細胞、胎仔繊維芽細胞、及び遺伝子組換えを施した卵丘細胞、胎仔繊維芽細胞などがあげられる。好適には、有蹄動物であるウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ等や、マウス等の哺乳動物種の体細胞、遺伝子組換えを施した培養体細胞、遺伝子組換え個体から採取した体細胞、核移植に使用可能な全ての細胞、ES細胞、EG細胞等が例示される。好適なドナー細胞として、ブタ胎仔繊維芽細胞、又は遺伝子組換えしたブタ胎仔繊維芽細胞が例示される。
核が導入されるレシピエント細胞の好適な例は、除核未受精卵、除核体外成熟卵、「マウス、ウシ、サル、及びブタ」など由来のES細胞、マウス及びブタなど由来のEG細胞が好適に例示される。
本発明において核移植技術は、既にブタ等で十分に確立されている卵細胞質内核注入法及び電気融合法が好適に利用できる。電気融合法では、除核未受精卵(レシピエント細胞)の囲卵腔(透明帯と卵細胞質の間)にドナー細胞を移植し、電気パルスで融合させた後、約2時間後に活性化刺激(電気刺激によるものが多い)を与える。この方法は、従来から、家畜(例えばヒツジ、ウシ、ヤギ等)で広く用いられている技術である。卵細胞質内核注入法は、ピエゾマイクロマニュピレーターという実験装置を使用して、核(細胞)を除核未受精卵の細胞質内に直接注入(マイクロインジェクション)し、約2時間後に電気的活性化刺激を与える方法であり、マウスで開発された技術である。活性化を行っていない未受精卵のようなレシピエント細胞質内には初期化因子が存在しており、このような細胞質にドナー核を一定時間曝すことによって、初期化が達成される。
本発明では、以下のような工程を含む評価系が提供される。
本発明は、動物胚を再構築するためのスクリーニング方法であって、その最初の工程は、除核未受精卵の同時活性化は行わずに第2減数分裂の分裂中期で停止したレシピエント細胞である除核未受精卵内に二倍体核を移植する段階である。この工程では、活性化を行わずに、ドナー細胞からの核を移植することのみが行われる。活性化を行わないことにより細胞周期をMII期のままで維持し、初期化因子の存在する卵細胞質内に核を一定時間さらすことが可能になる。次の工程は、胚が出生に至ることが可能となる十分な期間にわたってドナー細胞からの核をレシピエントの細胞質と接触した状態に保つ段階である。これによって、卵細胞質に曝されたドナー核は、核のリモデリング(核膜崩壊及び早期染色体凝集)を起こし、各遺伝子機能のリセットが達成される(核の初期化)。この時間は、約1〜2時間程度である。次の工程は、正しい倍数性を維持しながら再構築した胚を活性化する段階であり、通常電気刺激によって行われる。次に、核移植胚から得た生物試料における胚の後期発生(胚性ゲノム活性化後)、着床、分化に重要な関わりがある少なくとも1の遺伝子の発現を分析することによって動物胚の正常性に関してスクリーニングすることを含む胚の培養を行う段階である。
本発明の特徴部分はこの工程であり、特に再構築胚からの試料をもとに胚の後期発生(胚性ゲノム活性化後)、着床、分化に重要な関わりがある少なくとも1の遺伝子発現の分析を行うのである。
本発明は、動物胚を再構築するためのスクリーニング方法であって、その最初の工程は、除核未受精卵の同時活性化は行わずに第2減数分裂の分裂中期で停止したレシピエント細胞である除核未受精卵内に二倍体核を移植する段階である。この工程では、活性化を行わずに、ドナー細胞からの核を移植することのみが行われる。活性化を行わないことにより細胞周期をMII期のままで維持し、初期化因子の存在する卵細胞質内に核を一定時間さらすことが可能になる。次の工程は、胚が出生に至ることが可能となる十分な期間にわたってドナー細胞からの核をレシピエントの細胞質と接触した状態に保つ段階である。これによって、卵細胞質に曝されたドナー核は、核のリモデリング(核膜崩壊及び早期染色体凝集)を起こし、各遺伝子機能のリセットが達成される(核の初期化)。この時間は、約1〜2時間程度である。次の工程は、正しい倍数性を維持しながら再構築した胚を活性化する段階であり、通常電気刺激によって行われる。次に、核移植胚から得た生物試料における胚の後期発生(胚性ゲノム活性化後)、着床、分化に重要な関わりがある少なくとも1の遺伝子の発現を分析することによって動物胚の正常性に関してスクリーニングすることを含む胚の培養を行う段階である。
本発明の特徴部分はこの工程であり、特に再構築胚からの試料をもとに胚の後期発生(胚性ゲノム活性化後)、着床、分化に重要な関わりがある少なくとも1の遺伝子発現の分析を行うのである。
本発明の方法によってスクリーニングされた胚、又は本発明のスクリーニング工程を組み入れた方法によって作製された胚は、核ドナー細胞の供給源として用いることができる。胚をさらにES細胞又はES様細胞などの細胞株を作製するための細胞の供給源として利用することもできる。このような胚に由来する動物細胞又は細胞系を細胞移植療法に用いることも可能である。したがって、本発明のさらなる局面においては、動物細胞を患者に投与することを含む治療方法であって、その細胞が上記の方法に従ってスクリーニングされた胚、又はこのようなスクリーニングの段階を組み入れた方法に従って作製された胚から作製されたものである方法が提供される。本発明のこの局面は、細胞移植療法などの医学におけるこの種の細胞の使用、および同じく移植用の細胞又は組織片の作製におけるこの種の胚に由来する細胞の使用にも適用される。細胞を例えば心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、角膜、神経(例えば、脳、中枢神経系、脊髄など)、皮膚などの組織へと組織化させることもでき、又は細胞が血液細胞(例えば、血球すなわち赤血球、白血球など)もしくは造血幹細胞もしくは他の幹細胞(骨髄など)であってもよい。例えば、遺伝子改変の前に患者から細胞を採取してその後に戻すような自家移植片を作製することもできる。しかし、本発明の方法は、同族移植片(同系移植片)、同種移植片および/又は異種移植片の作製における胚のスクリーニングにも有用である。これらの方法には、医学的欠陥を補正するために細胞が遺伝的に改変される状況を含む、患者への治療的移植のための胚性細胞の体外における各種幹細胞、組織細胞への分化誘導が含まれる。この種の用途には、糖尿病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、多発性硬化症、AIDSなどの疾患、又は罹患した個体の細胞もしくは臓器における機能喪失を特徴とする罹病状態の治療が含まれる。
本発明は、動物胚において胚の後期発生(胚性ゲノム活性化後)、着床、分化に重要な関わりがある少なくとも1の遺伝子の発現の分析のために使用する、又は動物胚又は胚から得た試料における胚の後期発生(胚性ゲノム活性化後)、着床、分化に重要な関わりがある少なくとも1の遺伝子の発現の分析のために使用する試薬キットも対象とする。このようなキットは、動物胚又は核移植胚に関して、胚培養環境の検査又は検討のために用いてもよい。
以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、「正常胚の胚性ゲノム活性化前から胚性ゲノム活性化後に発現する遺伝子をマーカーにして遺伝子発現の異常を判定することを含む胚の遺伝子レベルでの正常性の判定又はスクリーニング方法に関する」限り、全て本発明に包含される。
実施例1
(方法)
FGF(fibroblast growth factor)、IL-6(interleukin)、Xist(X-inactive specifictranscript)、未分化マーカーc-kitについてブタ遺伝子配列をジーンバンクで検索し、プライマー、TaqManプローブを設計した。各遺伝子およびβactinのプライマー、TaqManProbeの塩基配列等の情報を表1−1及び1−2に示す。
(方法)
FGF(fibroblast growth factor)、IL-6(interleukin)、Xist(X-inactive specifictranscript)、未分化マーカーc-kitについてブタ遺伝子配列をジーンバンクで検索し、プライマー、TaqManプローブを設計した。各遺伝子およびβactinのプライマー、TaqManProbeの塩基配列等の情報を表1−1及び1−2に示す。
ブタ卵巣由来RNAをサンプルとしてRobocycler(Stratagene)でRT-PCR(One Step RT-PCR:Qiagen)、電気泳動を行い、最適なプライマー、反応条件を決定した〔RT-PCR条件:50℃30分、95℃15分(RT)、94℃5分、{94℃1分、At1分、72℃1分}40サイクル、72℃7分〕。
正常受精胚の対象として、顕微授精胚を使用した。体外成熟卵、凍結精子を用いて顕微授精(ICSI)胚を作製した。胎仔繊維芽細胞(雌)を核ドナーとして、除核した体外成熟卵に挿入、電気融合を行い、核移植胚を作製した。核移植胚は電気融合後1-1.5時間に活性化を行う方法(Pre-Act法)、または卵活性化後2-5時間に核移植を行う方法(Post-Act法)により作製した。胚性ゲノム活性化の前と後、2つの時期で解析を行うため、解析時期を1日目(胚性ゲノム活性化前)、6-7日目(活性化後)とした。ICSIまたは核移植後、1日目(27-29時間)、6-7日目(149〜175時間)の胚を解析した。QiagenRNeasy Mini kit(Qiagen)、グリコーゲン(Invitrogen)を用いて個々の胚からRNAを抽出、FGFr2IIIc、FGFr72IIIb、Xist、IL-6、IL-6rα、c-kitについてABIPRISM 7700 Sequence Detector(Applied Biosystems)でTaqMan Probe(AppliedBiosystems)を用いたreal-time RT-PCR(QuantiTect Probe RT-PCR kit:Qiagen)を行った。卵巣由来RNAを段階希釈したサンプルで標準曲線を作成、βactinを内部標準として遺伝子発現の相対定量を行った。
正常受精胚の対象として、顕微授精胚を使用した。体外成熟卵、凍結精子を用いて顕微授精(ICSI)胚を作製した。胎仔繊維芽細胞(雌)を核ドナーとして、除核した体外成熟卵に挿入、電気融合を行い、核移植胚を作製した。核移植胚は電気融合後1-1.5時間に活性化を行う方法(Pre-Act法)、または卵活性化後2-5時間に核移植を行う方法(Post-Act法)により作製した。胚性ゲノム活性化の前と後、2つの時期で解析を行うため、解析時期を1日目(胚性ゲノム活性化前)、6-7日目(活性化後)とした。ICSIまたは核移植後、1日目(27-29時間)、6-7日目(149〜175時間)の胚を解析した。QiagenRNeasy Mini kit(Qiagen)、グリコーゲン(Invitrogen)を用いて個々の胚からRNAを抽出、FGFr2IIIc、FGFr72IIIb、Xist、IL-6、IL-6rα、c-kitについてABIPRISM 7700 Sequence Detector(Applied Biosystems)でTaqMan Probe(AppliedBiosystems)を用いたreal-time RT-PCR(QuantiTect Probe RT-PCR kit:Qiagen)を行った。卵巣由来RNAを段階希釈したサンプルで標準曲線を作成、βactinを内部標準として遺伝子発現の相対定量を行った。
結果
胚の1/25量に相当する量のRNAから1遺伝子部位の発現解析(RT-PCR、real-time RT-PCR)が可能であった。
ICSI胚、核移植胚の遺伝子発現の検出結果を表2−1(ICSI胚、1日目、6-7日目)及び2−2(Pre-Act法核移植胚、1日目、6-7日目、Post-Act法核移植胚、1日目)に示す。
胚の1/25量に相当する量のRNAから1遺伝子部位の発現解析(RT-PCR、real-time RT-PCR)が可能であった。
ICSI胚、核移植胚の遺伝子発現の検出結果を表2−1(ICSI胚、1日目、6-7日目)及び2−2(Pre-Act法核移植胚、1日目、6-7日目、Post-Act法核移植胚、1日目)に示す。
1日目のPost-Act法核移植胚ではFGFr72IIIb(25/34)、Xist(1/34)を発現する胚の割合がPre-Act法(25/25、11/25)、ICSI胚(30/31、12/31)より有意に低かった(P<0.05)。6-7日目の核移植由来胚盤胞(Pre-act法)のIL-6rαの発現頻度(17/23)はICSI由来胚盤胞(31/35)より低い傾向であった。各遺伝子の発現量を卵巣RNA量に換算し、相対定量、すなわち各遺伝子の発現量の値をβactinの値を1として算出したグラフを図1−1及び図1−2に示した。核移植胚のFGFr2IIIc、IL-6rαの発現量はICSI胚より高い傾向であった。
6-7日目の核移植由来胚盤胞(Pre-Act法)において、FGFr72IIIb、IL-6の発現量は、ICSI由来胚盤胞の発現量より有意に低く、IL-6rαの発現量はICSI由来胚盤胞より有意に高かった。
培養成績は、Pre-Act法核移植胚における1日目(2-4cell)の分割率(53.9%)は、ICSI胚(52.3%)と有意な差がなかった。6-7日目の胚盤胞形成率(8.6%)は、ICSI胚(34.1%)に比べて有意に低かった。Post-Act法核移植胚における1日目(2-4cell)の分割率13.5%(16/118)は、ICSI胚、Pre-Act法核移植胚に比べて有意に低かった(表3)。
6-7日目の核移植由来胚盤胞(Pre-Act法)において、FGFr72IIIb、IL-6の発現量は、ICSI由来胚盤胞の発現量より有意に低く、IL-6rαの発現量はICSI由来胚盤胞より有意に高かった。
培養成績は、Pre-Act法核移植胚における1日目(2-4cell)の分割率(53.9%)は、ICSI胚(52.3%)と有意な差がなかった。6-7日目の胚盤胞形成率(8.6%)は、ICSI胚(34.1%)に比べて有意に低かった。Post-Act法核移植胚における1日目(2-4cell)の分割率13.5%(16/118)は、ICSI胚、Pre-Act法核移植胚に比べて有意に低かった(表3)。
ドナー核を除核未受精卵に核移植すると、全ての遺伝子発現が一度リセット(初期化)され、遺伝子のリプログラミングが起こる。核移植胚の遺伝子の初期化およびリプログラミングは不完全であることが多く、発生、発育異常が頻繁に現れる。
6-7日目の核移植由来胚盤胞(Pre-Act法)では、ICSI由来胚盤胞に比べてIL-6rの発現頻度が低い傾向が現れた。FGFr72IIIb、IL-6、IL-6rαの発現量においても、ICSI由来胚盤胞と比較して有意な差が現れた。Post-Act法核移植では、早期(1日目、2-4cell)から遺伝子発現が異常な胚の出現頻度が増えることが示された。Post-Act法のように不適切な核移植方法によって作製された胚の遺伝子発現異常は早期に現れやすいと考えられる。
6-7日目のPre-Act法核移植由来胚盤胞では、ICSI由来胚盤胞に比べてIL-6rの発現頻度が低い傾向が現れた。Pre-Act法のような現在では一般的に適切と考えられている核移植方法によって作製された胚の遺伝子発現異常は後期(胚盤胞期)(胚性ゲノム活性化後)に現れると考えられる。胚盤胞に達した胚には遺伝子発現が異常な胚も含まれ、これらの胚が着床不全や流産、死産などを起こすと推測される。
6-7日目の核移植由来胚盤胞(Pre-Act法)では、ICSI由来胚盤胞に比べてIL-6rの発現頻度が低い傾向が現れた。FGFr72IIIb、IL-6、IL-6rαの発現量においても、ICSI由来胚盤胞と比較して有意な差が現れた。Post-Act法核移植では、早期(1日目、2-4cell)から遺伝子発現が異常な胚の出現頻度が増えることが示された。Post-Act法のように不適切な核移植方法によって作製された胚の遺伝子発現異常は早期に現れやすいと考えられる。
6-7日目のPre-Act法核移植由来胚盤胞では、ICSI由来胚盤胞に比べてIL-6rの発現頻度が低い傾向が現れた。Pre-Act法のような現在では一般的に適切と考えられている核移植方法によって作製された胚の遺伝子発現異常は後期(胚盤胞期)(胚性ゲノム活性化後)に現れると考えられる。胚盤胞に達した胚には遺伝子発現が異常な胚も含まれ、これらの胚が着床不全や流産、死産などを起こすと推測される。
以上より遺伝子発現パターン・量を指標としてブタ核移植胚の正常性を評価できることが示された。
実施例2
体外培養成績と遺伝子発現の結果の比較
2種類の異なる細胞株(cell line)PFF(Porcine Fetal Fibroblast)1、PFF6をそれぞれドナー細胞に用いてPre-Act法核移植により、胚を作製した。PFF1、PFF6は、人工授精した1頭の雌豚から得た2個体の胎仔から樹立した繊維芽細胞である。PFF1、PFF6は体外培養においては細胞形態、増殖能に差異はなく、両者ともに正常な胎仔繊維芽細胞であると判断される。核移植後、1日目の胚の遺伝子解析を行い、異なるドナー細胞から作製された核移植胚の遺伝子発現について比較を行った。実施例1の1日目の結果で有意な差があり、判定マーカー遺伝子として適していると判断したFGFr72IIIb、Xistのみ、解析を行った。解析方法(リアルタイムRT-PCRによる遺伝子発現の検出、発現量の相対比較)は実施例1と同様である。
体外培養成績と遺伝子発現の結果の比較
2種類の異なる細胞株(cell line)PFF(Porcine Fetal Fibroblast)1、PFF6をそれぞれドナー細胞に用いてPre-Act法核移植により、胚を作製した。PFF1、PFF6は、人工授精した1頭の雌豚から得た2個体の胎仔から樹立した繊維芽細胞である。PFF1、PFF6は体外培養においては細胞形態、増殖能に差異はなく、両者ともに正常な胎仔繊維芽細胞であると判断される。核移植後、1日目の胚の遺伝子解析を行い、異なるドナー細胞から作製された核移植胚の遺伝子発現について比較を行った。実施例1の1日目の結果で有意な差があり、判定マーカー遺伝子として適していると判断したFGFr72IIIb、Xistのみ、解析を行った。解析方法(リアルタイムRT-PCRによる遺伝子発現の検出、発現量の相対比較)は実施例1と同様である。
結果
ICSI胚、Pre-Act法核移植胚(ドナー細胞PFF1、PFF6)1日目の遺伝子発現の検出結果を表4に示す。
PFF1をドナー細胞に用いた胚では、FGFr72IIIbの発現頻度(24/30)が、ICSI(30/31)、PFF6(28/30)に比べて低い傾向が見られた(表4)。遺伝子の発現量には傾向は見られなかった(図2)。
培養成績は、PFF1における1日目の分割率(44.6%)は、PFF6(63.0%)に比べて有意に低かった。6-7日目の胚盤胞形成率(4.1%)は、PFF6(12.3%)に比べて低い傾向が見られた(表5)。
ICSI胚、Pre-Act法核移植胚(ドナー細胞PFF1、PFF6)1日目の遺伝子発現の検出結果を表4に示す。
培養成績は、PFF1における1日目の分割率(44.6%)は、PFF6(63.0%)に比べて有意に低かった。6-7日目の胚盤胞形成率(4.1%)は、PFF6(12.3%)に比べて低い傾向が見られた(表5)。
以上より、遺伝子発現パターンを指標として、異なる細胞株をドナー細胞に用いて作製したブタ核移植胚の正常性を評価できる可能性、さらにドナー細胞として適した細胞株を決定できる可能性が示唆された。
Claims (17)
- 正常胚の胚性ゲノム活性化前から胚性ゲノム活性化後に発現する遺伝子をマーカーにすることを特徴とする体外操作胚の遺伝子レベルでの正常性の判定又はスクリーニング方法。
- 正常胚の胚性ゲノム活性化前から胚性ゲノム活性化後に発現する遺伝子が、胚の後期発生(胚性ゲノム活性化後)、着床、分化に重要な関わりがある少なくとも1の遺伝子である請求項1の方法。
- 分析されるマーカー遺伝子が、FGFr(FGFr2IIIc,FGFr72IIIb)、Xist、IL-6、IL-6rを各コードする遺伝子から選ばれる少なくとも一である請求項1又は2の方法。
- スクリーニング指標が、遺伝子の発現(mRNA)又は発現量である請求項1〜3の何れか一に記載の方法。
- 体外操作胚が、核移植胚、顕微授精胚、前核注入胚、又は凍結胚である請求項1〜4の何れか一に記載の方法。
- 判定時期が、体外操作胚の胚性ゲノム活性化前、又は体外操作胚の胚性ゲノム活性化後である請求項1〜5の何れか一に記載の方法。
- 判定時期が、体外培養1日目、又は6〜7日目である前項6に記載の方法。
- 分析が以下のいずれかである請求項1〜7の何れか一に記載の方法;
1)動物胚において遺伝子の発現の分析
2)核移植胚と正常受精胚の遺伝子発現を分析し、比較する。
3)核移植胚と正常受精胚の遺伝子発現量を分析し、比較する。 - 対象動物が、哺乳動物又はその遺伝子改変動物から選ばれる請求項1〜8の何れか一に記載の方法;
- 核を提供するドナー細胞が以下のいずれかから選ばれる請求項1〜9の何れか一に記載の方法;
1)対象動物種の体細胞
2)遺伝子組換えを施した培養体細胞
3)ES細胞
4)EG細胞 - 核を提供するドナー細胞が、胎仔繊維芽細胞、又は遺伝子組換えした胎仔繊維芽細胞である請求項10に記載の方法。
- 核移植の受容体となるレシピエント細胞が以下のいずれかから選ばれる請求項1〜11の何れか一に記載の方法;
1)未受精卵
2)体外成熟卵
2)ES細胞
3)EG細胞 - 請求項1〜12の何れか一に記載の方法を使用する動物胚の最適培養条件の検討方法。
- 以下のような工程を含む動物胚を再構築するためのスクリーニング方法;1)除核未受精卵の同時活性化は行わずに第2減数分裂の分裂中期で停止したレシピエント細胞である除核未受精卵内に二倍体核を移植する段階、
2)胚が出生に至ることが可能となる十分な期間にわたってドナー細胞からの核をレシピエントの細胞質と接触した状態に保つ段階、
3)正しい倍数性を維持しながら再構築した胚を活性化する段階、
4)核移植胚から得た生物試料における胚の後期発生(胚性ゲノム活性化後)、着床、分化に重要な関わりがある少なくとも1の遺伝子の発現を分析することによって動物胚の正常性に関してスクリーニングすることを含む胚の培養を行う段階。 - 配列表1〜21に記載のプライマー及びプローブから選ばれる少なくとも1の配列を利用した請求項1〜14の何れか一に記載の方法。
- 請求項1〜15の何れか一に記載の方法に使用する試薬キット。
- 配列表1〜21に記載のプライマー及びプローブから選ばれる少なくとも1の配列を試薬として含む請求項16の試薬キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004059803A JP2005245294A (ja) | 2004-03-03 | 2004-03-03 | 体外操作胚の正常性の判定又はスクリーニング方法 |
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Publications (1)
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010075099A (ja) * | 2008-09-26 | 2010-04-08 | Japan Science & Technology Agency | 哺乳動物核移植胚のスクリーニング方法、非ヒト哺乳動物核移植胚、クローン非ヒト哺乳動物、及びスクリーニングキット |
JP2010515909A (ja) * | 2007-01-11 | 2010-05-13 | ユニヴェルシテ・ドゥ・ラ・メディテラネ | 生殖の医学および生物学のためのバイオマーカー |
WO2012029957A1 (ja) * | 2010-09-03 | 2012-03-08 | 独立行政法人理化学研究所 | クローン動物の作出方法 |
-
2004
- 2004-03-03 JP JP2004059803A patent/JP2005245294A/ja not_active Withdrawn
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JP2010075099A (ja) * | 2008-09-26 | 2010-04-08 | Japan Science & Technology Agency | 哺乳動物核移植胚のスクリーニング方法、非ヒト哺乳動物核移植胚、クローン非ヒト哺乳動物、及びスクリーニングキット |
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