BRPI0806302A2 - métodos para determinar resultado de fertilização in vitro, para selecionar um indivìduo para uma fertilização in vitro, para determinar a qualidade do sêmen ou espermatozóide ou para determinar a probabilidade de infertilidade masculina em um indivìduo, para determinar a qualidade do embrião ou para selecionar um embrião adequado para transferência de embrião, fertilização in vitro ou implantação, para determinar a probabilidade de complicações na gravidez, para determinar a probabilidade de pré-eclámpsia severa em um indivìduo, e para diferenciar retardamento do crescimento intr-uterino vascular de não-vascular em um indivìduo, e, uso de um kit - Google Patents

Abstract

MéTODOS PARA DETERMINAR RESULTADO DE FERTILIZAçãO IN VITRO, PARA SELECIONAR UM INDIVìDUO PARA UMA FERTILIZAçãO IN VITRO, PARA DETERMINAR A QUALIDADE DO SêMEN OU ESPERMATOZóIDE OU PARA DETERMINAR A PROBABILIDADE DE INFERTILIDADE MASCULINA EM UM INDIVìDUO, PARA DETERMINAR A QUALIDADE DO EMBRIãO OU PARA SELECIONAR UM EMBRIãO ADEQUADO PARA TRANSFERêNCIA DE EMBRIãO, FERTILIZAçãO IN VITRO OU IMPLANTAçãO, PARA DETERMINAR A PROBABILIDADE DE COMPLICAçõES NA GRAVIDEZ, PARA DETERMINAR A PROBABILIDADE DE PRé-ECLáMPSIA SEVERA EM UM INDIVìDUO, E PARA DIFERENCIAR RETARDAMENTO DO CRESCIMENTO INTRA-UTERINO VASCULAR DE NãO-VASCULAR EM UM INDIVìDUO, E, USO DE UM KIT. A presente invenção refere-se a um novo biomarcador para a medicina e a biologia da reprodução, em particular para resultado da fertilização in vitro (IVF). Ela refere-se a métodos para predizer resultado da IVF e para selecionar o indivíduo para IVF.

Description

"MÉTODOS PARA DETERMINAR RESULTADO DE FERTILIZAÇÃO IN VITRO, PARA SELECIONAR UM INDIVÍDUO PARA UMA FERTILIZAÇÃO IN VITRO, PARA DETERMINAR A QUALIDADE DO SÊMEN OU ESPERMATOZÓIDE OU PARA DETERMINAR A PROBABILIDADE DE INFERTILIDADE MASCULINA EM UM INDIVÍDUO, PARA DETERMINAR A QUALIDADE DO EMBRIÃO OU PARA SELECIONAR UM EMBRIÃO ADEQUADO PARA TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÃO, FERTILIZAÇÃO IN VITRO OU IMPLANTAÇÃO, PARA DETERMINAR A PROBABILIDADE DE COMPLICAÇÕES NA GRAVIDEZ, PARA DETERMINAR A PROBABILIDADE DE PRÉ-ECLÂMPSIA SEVERA EM UM INDIVÍDUO, E PARA DIFERENCIAR RETARDAMENTO DO CRESCIMENTO INTRA-UTERINO VASCULAR DE NÃO-VASCULAR EM Uivi INDIVÍDUO, E, USO DE UM KIT"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à medicina e à biologia da reprodução. A presente invenção refere-se a um marcador preditivo da falha e sucesso da implantação da gravidez a termo, em particular em seguida a fertilização in vitro.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O diagnóstico e controle da infertilidade é uma preocupação de saúde prevalecente em adultos jovens. Progressos contínuos de técnicas de fertilização in vitro (IVF) são alternativas reprodutivas desafiadoras para casais inférteis. A fertilização in vitro é contudo associada com aumentados riscos de complicações clínicas, que representam desvantagens para sua indicação em mulheres, incluindo riscos de múltiplos nascimentos, abordo espontâneo de gravidez ectópica e parto pré-termo. Considerando-se estes riscos clínicos e o elevado custo econômico destas técnicas avançadas, o tratamento de IVF é ainda difícil de acessar para a maior parte dos casais inférteis. Embora melhor compreensão dos mecanismos que influenciam a fertilização e implantação tenha fornecido uma visão mais precisa dos parâmetros associados ao sucesso da fertilização in vitro, a busca por biomarcadores que possam predizer os problemas de gravidez após IVF, antes da iniciação do tratamento, permanece um principal desafio. A maioria dos marcadores que predizem a implantação do embrião ou abortamento (Tong et al., 2004) ocorrem após iniciação do tratamento IVF, assim limitando o aconselhamento de estresse antecipado e problemas clínicos associados com a falha de gravidez. A predição das chances para mulheres inférteis parirem um bebê viável, após tratamento por IVF, é assim um problema principal na otimização da resposta médica, para aumentar as demandas de casais inférteis.

Portanto, há uma forte necessidade de marcadores que podem melhorar o aconselhamento de casais inférteis, como preditorcs de taxas de aborto e fracasso de implantação, associados com IVF em um estágio que precede a decisão para iniciar o tratamento IVF e comprometimento de complicações clínicas associadas.

O sucesso de uma implantação embriônica passa pela transferência do embrião possuindo suficientes qualidades para ser implantado. A capacidade do embrião é avaliada principalmente na morfologia embriônica e na cinética de divisão. A cultura do embrião até o estágio de blastócitos tem diversas vantagens potenciais, entre as quais a seleção dos embriões mais viáveis e tendo as melhores chances de serem implantados, sincronização embrião-útero, a possibilidade de avaliarem-se as capacidades do desenvolvimento embriônico no caso de múltiplos fracassos de implantação. Pode-se esperar, quando a transferência foi realizada com embriões de boa qualidade (qualidade definida no aspecto morfológico e na velocidade de desenvolvimento), que os últimos sejam implantados e permitam uma gravidez. A avaliação da capacidade intrínseca do embrião, para emitir um conjunto de sinais suportando sua implantação dentro do endométrio, é ainda difícil de ser feita.

Portanto, há uma forte necessidade de marcadores que possam ajudar a avalia a qualidade do embrião, sua viabilidade e sua capacidade de ser implantado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção provê pela primeira vez um biomarcador, permitindo a avaliação e predição não-invasiva do resultado de IVF. Além de seu valor de prognóstico, um valor principal deste biomarcador é a possibilidade de sua dosagem antes da iniciação do tratamento de condicionamento hormonal da mulher. O uso deste biomarcador melhora o aconselhamento ou controle dos riscos associados IVF e, assim, provê conseqüente benefícios para cuidados de saúde das mulheres inférteis. Além disso, os inventores identificaram MICA (proteína A relacionada com a cadeia de MHC de classe I) como um marcador das complicações da infertilidade e gravidez. Portanto, a presente invenção diz respeito a MICA como biomarcador na medicina e biologia da reprodução.

Em uma primeira forma de realização, a presente invenção refere-se a um método para determinar o resultado da fertilização in vivo (IVF), compreendendo ensaio in vitro para MICA em uma amostra, o nível de MICA sendo indicativo do resultado da IVF, em particular indicativo das taxas de fracasso da implantação, fracasso da IVF e/ou aborto. Preferivelmente, a amostra é selecionada do grupo consistindo de:

uma amostra de sangue, plasma, soro, biópsia de endométrio, fluido uterino, secreções vaginais e cervicais, muco cervical, bolsa de Douglas e fluido peritoneal no caso de exploração celioscópica (endometriose, pélvis aderente, seqüela infecciosa) de uma mulher que recebe o embrião transferido.

uma amostra de sangue, plasma, soro e sêmen de um homem oferecendo o sêmen; uma amostra de sangue, plasma, soro, biópsia de endométrio, fluido uterino, secreções vaginais e cervicais, muco cervical, bolsa de Douglas, fluido folicular e fluido peritoneal no caso de exploração celioscópica (endometriose, pélvis aderente, seqüela infecciosa) de uma mulher fornecendo o oócito; e

uma amostra de sobrenadante embriônico ou meio de cultura de embrião.

Em uma segunda forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método para selecionar um indivíduo para uma IVF compreendendo ensaio in vitro para MICA em uma amostra e seleção do indivíduo tendo um nível de MICA indicativo de uma probabilidade de IVF bem sucedida. Preferivelmente, a amostra é selecionada do grupo consistindo de uma amostra de sangue, plasma, soro, biópsia do endométrio, fluido uterino, secreções vaginais e cervicais, muco cervical, bolsa de Douglas e fluido peritoneal, no caso de exploração celioscópica (endometriose, pélvis aderente, seqüela infecciosa).

Em uma terceira forma de realização, a presente invenção refere-se a um método para determinar a qualidade do sêmen ou espermatozóide, compreendendo ensaio in vitro de MICA em uma amostra de sangue, soro, plasma ou sêmen do indivíduo, o nível de MICA sendo indicativo da qualidade do sêmen ou espermatozóide ou infertilidade masculina.

Em uma quarta forma de realização, a presente invenção refere-se a um método para determinar a qualidade do embrião ou para selecionar um embrião adequado para transferência de embrião, fertilização in vitro ou implantação, compreendendo ensaio in vitro para MICA no meio ou sobrenadante de cultura de embrião, o nível de MICA sendo indicativo da qualidade do embrião ou da adequabilidade do embrião para transferência de embrião, fertilização in vitro ou implantação. Em uma quinta forma de realização, a presente invenção refere-se a um método para prognóstico de infertilidade e determinação da probabilidade de complicações na gravidez, incluindo aborto, doenças de gravidez vascular (YPD), pré-eclâmpsia (PE), retardamento de crescimento intra-uterino (IUGR), associado ou não com pré-eclâmpsia, síndrome de HELLP, esteatose gravídica, nefropatia gravídica ou morte fetal intra-utrina, doenças da gravidez ou infertilidade associada com patologias autoimunes em um indivíduo compreendendo ensaio in vitro para MICA em uma amostra, o nível de MICA sendo indicativo de uma probabilidade de complicações da gravidez.

Em uma forma de realização preferida, a etapa de ensaiar para MICA na amostra compreende uma etapa selecionada de:

ensaiar para proteína MICA solúvel na amostra;

ensaiar para ácido nucleico livre de célula codificando MICA; e

ensaiar para anticorpos anti-MICA presentes na amostra.

Em uma forma de realização mais preferida, a etapa de ensaiar para MICA na amostra compreende contatar a amostra com um anticorpo anti-MICA, preferivelmente um anticorpo monoclonal, mais preferivelmente selecionado do grupo consistindo de SR99, SRl 04 e SRl 16. Opcionalmente, a etapa de ensaiar para MICA solúvel na amostra pode ser realizada por ensaio ELISA, preferivelmente por ensaio ELISA sanduíche.

Em uma sexta forma de realização, a presente invenção diz respeito ao uso in vitro de um kit compreendendo pelo menos um elemento selecionado do grupo consistindo de um anticorpo anti-MICA, um conjunto de iniciadores específicos de um ácido nucleico codificando MICA, uma sonda específica de um ácido nucleico codificando MICA e uma proteína MIC, preferivelmente, uma proteína de MICA, na medicina e biologia da reprodução. Preferivelmente, o kit é usado para selecionar um indivíduo adequado para uma IVF, para determinar resultado de fertilização in vitro (IVF), para determinar a qualidade do sêmen ou espermatozóide, para selecionar o sêmen ou espermatozóide adequado para IVF, para determinar a probabilidade de infertilidade masculina em um indivíduo, para determinar a qualidade do embrião, para selecionar um embrião adequado para transferência de embrião, fertilização in vitro, ou implantação, ou para identificar um indivíduo tendo um risco de alta complicação durante a gravidez, em particular um indivíduo susceptível de abordo, doenças de gravidez vascular, pré-eclâmpsia, retardamento de crescimento intra-uterino (IUGR), associado ou não com pré-eclâmpsia, síndrome de HELLP, esteatose gravídica, nefropatia gravídica ou morte fetal intra-uterina.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Níveis de soro sMIC médios e«i pacientes diferem de acordo com o sucesso de implantação e problemas de IVF. A avaliação do nível de soro de sMIC foi obtida durante a fase folicular do ciclo precedendo a iniciação de IVF no soro de 170 candidatos mulheres inférteis para IVF. Os níveis de sMIC são em ng/ml. As plotagens em pontos representam valores médios de amostras de sangue positivo de sMIC e as barras de erro faixas médias interquartil de 25-75. Os gráficos foram obtidos usando-se o GraphPad Prism Version 4 Software. Os grupos são representados como mulheres que fracassaram no implante após IVF (IMP-), mulheres que experimentaram implantação bem sucedida após IVF (IMP+). O grupo IMP+ é ainda dividido em 2 grupos: mulheres que parem um bebê nascido após IVF (BBebê) ou mulheres que experimentam aborto após implantação bem sucedida (MIS). Os valores sMIC médios em mulheres que não conseguem parir (por causa de fracasso de implantação ou aborto) são também representados como IMP- ou MIS. Um grupo de doadores de controle de mulheres férteis, não grávidas na coleta de amostra de sangue, que tinham experimentado pelo menos 2 gravidezes bem sucedidas anteriores, foi também avaliado (Fert Ctl) quanto a sMIC.

Figura 2: Níveis mais elevados de MIC são encontrados em amostras positivas MIC+ de mulheres com doenças de gravidez vascular (VPD), com referência a mulheres que sofrem gravidez normal e igualadas quanto ao termo (NP). As doenças de gravidez vascular foram ainda subdivididas em retardamento de crescimento intra-uterino (IUGR), pré- eclâmpsia (PE) e morte fetal intra-uterina (IUFD).

Figura 3: (Fig. 3A) Faixa média e interquartil de proteinúria por dia em grupo de pré-eclâmpsia dependente de status de sMIC. A comparação entre plasma sMIC positivo e sMIC negativo foi realizada usando-se teste de Mann-withney não-paramétrico. Fig. 3B: Freqüência de incisura uterina diastólica prematura bilateral, em grupo de pré-eclâmpsia SMIC positivo e plasma sMIC negativo de pacientes pré-eclâmpticos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção é baseada na identificação de um biomarcador no campo da medicina e biologia da reprodução. Na realidade. Na realidade, eles constataram que o nível de MICA poderia ser usado para predizer o resultado de IVF, em particular para determinar a probabilidade de sucesso ou fracasso de IVF, sucesso ou fracasso de implantação de embrião e aborto. Além disso, este marcador é útil para avaliar a capacidade de fertilização do sêmen e para selecionar os embriões que são os mais viáveis e têm a melhor probabilidade de implantação. Este marcador é também associado a complicações na gravidez. Em particular, ele pode ser usado para definir a probabilidade de retardamento de crescimento intra-uterino (IUGR), morte fetal intra-uterina, doenças da gravidez, infertilidade associada com patologias auto-imunes, doenças vasculares gravídicas e pré-eclâmpsia.

MICA tem sido extensamente descrita em pedidos de patente WO 98/19267 e WO 03/089616, cuja descrição é incorporada aqui por referência. O Agrupamento Unigene para MICA é Hs.549053 e seqüência representativa pode ser em Embl Q9UDZ9. A MICA solúvel é uma proteína truncada. A MICA solúvel não tem o domínio transmembrana e a cauda citoplásmica e inclui os três domínios extra-celulares.

Portanto, a presente invenção refere-se a métodos para determinar o resultado da fertilização in vitro compreendendo o ensaio in vitro para MICA em uma amostra, o nível de MICA sendo indicativo do resultado da IVF. O método pode compreender uma etapa anterior de prover uma amostra.

O resultado IVF pode ser um nascimento de um bebê, um fracasso na implantação ou um aborto.

Em uma forma de realização preferida, o método compreende ensaiar quanto a proteína MICA solúvel na amostra. Em outra forma de realização preferida, o método compreender ensaiar ácido nuclei^u livre de célula codificando MICA. Por "livre-de-célula" pretende-se referir a ácido nucleico que não é contido dentro de uma célula. Em uma forma de realização preferida adicional, o método compreende um ensaio de MICA indireta e compreender ensaiar quanto a anticorpos anti-MICA presentes na amostra.

A amostra pode ser provida de um indivíduo.

Em uma primeira forma de realização, o indivíduo é a mulher que recebe o embrião transferido. O indivíduo pode também ser o fornecedor dos oócitos. Em uma forma de realização preferida, a amostra é selecionada do grupo consistindo de uma amostra de sangue, plasma, soro, biópsia de endométrio, fluido uterino, secreções vaginal e cervical, muco cervical, bolsa de Douglas e fluido peritoneal, no caso de exploração celioscópica (endometriose, pélvis aderente, seqüela infecciosa). Em uma forma de realização preferida, a amostra é uma amostra de sangue, plasma ou soro, mais preferivelmente uma amostra de soro.

Preferivelmente, o nível de MICA solúvel é determinado antes da iniciação do tratamento de condicionamento hormonal. Em uma primeira forma de realização particular, antes da iniciação do tratamento condicionante, um nível de MICA maior do que 2,45 ng/ml na amostra de soro é indicativo de mais elevadas taxas de fracasso de implantação. Portanto, a presente invenção refere-se a um método em que o indivíduo é a mulher que pretende receber o embrião transferido, o nível de MICA solúvel é determinado antes da iniciação do tratamento condicionante hormonal e um nível de MICA maior do que 2,45 ng/ml na amostra de soro é indicativo de mais elevadas taxas de fracasso de implantação. Em uma segunda forma de realização particular, antes da iniciação do tratamento condicionante hormonal, um nível de MICA maior do que 28 ng/ml na amostra de soro é indicativo de uma alta probabilidade de fracasso da IVF. Portanto, a presente invenção refere-se a um método em que o indivíduo é a mulher que pretende receber o embrião transferido, o nível de MICA solúvel sendo determinado antes da iniciação do tratamento de condicionamento hormonal e um nível de MICA maior do que 28 ng/ml na amostra de soro é indicativo de uma alta probabilidade de fracasso de IVF. Em uma terceira forma de realização particular, antes do início do tratamento de condicionamento hormonal, um nível de MICA maior do que 6 ng/ml na amostra de soro é indicativo de uma alta probabilidade de aborto. Portanto, a presente invenção diz respeito a um método em que o indivíduo é a mulher que pretende receber o embrião transferido, o nível de MICA solúvel é determinado antes do início do tratamento de condicionamento hormonal e um nível de MICA maior do que 6 ng/ml na amostra de soro é indicativo de uma alta probabilidade de aborto.

O nível de proteína de MICA solúvel pode também ser determinado após implantação. Portanto, em uma quarta forma de realização particular, após implantação, um nível de MICA maior do que 3,2 ng/ml na amostra de soro é indicativo de uma alta probabilidade de aborto. Portanto, a presente invenção refere-se a um método em que o indivíduo é a mulher que recebe o embrião transferido, o nível de proteína de MICA solúvel pode também ser determinado após implantação e um nível de MICA maior do que 3,2 ng/ml na amostra de soro é indicativo de uma alta probabilidade de aborto.

Em uma quinta forma de realização particular, um baixo nível de MICA é indicativo de uma alta probabilidade de uma IVF bem sucedida. Em particular, antes da iniciação do tratamento de condicionamento hormonal, um nível de MICA na amostra de soro menor do que 28 ng/ml, preferivelmente inferior a 6 n/ml e, mais preferivelmente, menor do que 2,45 ng/ml, é indicativo de uma IVF bem sucedida, preferivelmente uma alta probabilidade de IVF bem sucedida.

Portanto, a presente invenção diz respeito a um método pra selecionar um indivíduo adequado para uma IVF, compreendendo ensaio in vitro para MICA em uma amostra de indivíduo e seleção do indivíduo tendo um nível de MICA indicativo de uma probabilidade IVF bem sucedida. O método pode compreender uma etapa anterior de prover uma amostra do indivíduo. O indivíduo é, em particular, uma mulher que é candidata para IVF. A amostra pode ser selecionada do grupo consistindo de uma amostra de sangue, plasma, soro, biópsia de endométrio, fluido uterino, secreções vaginal e cervical, muco cervical, bolsa de Douglas e fluido peritoneal, no caso de exploração celioscópica (endometriose, pélvis aderente, seqüela infecciosa). Em uma forma de realização preferida, a amostra é uma amostra de sangue, plasma ou soro, preferivelmente uma amostra de soro. A amostra pode ser usada diretamente ou pode ser submetida a tratamentos anteriores.

Em uma forma de realização preferida do método para selecionar um indivíduo adequado par uma IVF, o método compreende ensaiar para proteína de MICA solúvel na amostra. O nível de MICA solúvel é preferivelmente determinado antes do início de um tratamento de condicionamento hormonal. Por exemplo, um nível de MICA solúvel na amostra de soro menor do que 28 ng/ml, preferivelmente menor do que 6 ng/ml e, mais preferivelmente, menor do que 2,45 ng/ml, é indicativo de uma probabilidade de uma IVF bem sucedida. Em outra forma de realização preferida, o método compreende ensaiar para ácido nucleico livre de célula codificando MICA. Por "livre de célula" significa o ácido nucleico que não é contido dentro de uma célula. Em uma forma de realização preferida adicional, o método compreende um ensaio de MICA indireto e compreender ensaiar para anticorpos anti-MICA presentes na amostra. O nível de MICA na amostra é preferivelmente determinado antes do início do tratamento de condicionamento hormonal.

Em uma segunda forma de realização, o indivíduo é o homem oferecendo o sêmen. Nesta forma de realização, a amostra pode ser selecionado do grupo consistindo de uma amostra de sangue, plasma, soro e sêmen. O sêmen pode ser selecionado do grupo consistindo de sêmen ejaculado fresco, sêmen fresco após preparação para capacitação de espermatozóide, sêmen epididimal antes ou após congelamento e sêmen testicular antes ou após congelamento. Na realidade, a presença de MICA na amostra é indicativa de uma mais baixa capacidade de fertilização. Em uma forma de realização preferida, o método compreende ensaiar para proteína de MICA solúvel na amostra. Em outra forma de realização, o método compreende ensaiar para ácido nucleico livre codificando MICA.

Portanto, a presente invenção também diz respeito a um método para determinar a qualidade do sêmen ou espermatozóide, medindo-se o nível de MICA em uma amostra de sangue, plasma, soro ou sêmen de um homem oferecendo o sêmen. O método pode compreender uma etapa anterior de prover uma amostra do indivíduo. Em uma forma de realização preferida, o método compreende ensaiar para proteína de MICA solúvel na amostra. Em outra forma de realização preferida, o método compreende ensaiar para ácido nucleico livre de célula codificando MICA. Em particular, a qualidade do sêmen ou espermatozóide é usada para determinar a capacidade de fertilização. Preferivelmente, o nível de MICA na amostra é indicativo da qualidade do sêmen ou espermatozóide e, desse modo, da probabilidade de IVF bem sucedida. Preferivelmente, quanto mais elevado for o nível de MICA, mais baixo é a qualidade do sêmen ou espermatozóide e, desse modo, a probabilidade de IVP bem sucedida.

A presente invenção refere-se ainda a um método para selecionar sêmen ou espermatozóide adequado para IVF de um oócito, compreendendo medir o nível de MICA em uma amostra de sangue, plasma, soro ou sêmen de um homem oferecendo o sêmen. O método pode compreender uma etapa anterior de prover uma amostra do indivíduo. De fato, a presença de MICA tem estado associada com um fracasso da implantação. Preferivelmente, a amostra mostrando o mais baixo nível de MICA é selecionada para IVF. Em uma forma de realização preferida, o método compreende ensaiar para proteína de MICA solúvel na amostra. Em outra forma de realização preferida, o método compreende ensaiar para ácido nucleico livre de célula codificando MICA.

Além disso, a presente invenção refere-se a um método para determinar a probabilidade de infertilidade masculina em um indivíduo, compreendendo medir o nível de MICA em uma amostra de sangue, plasma, soro ou sêmen do indivíduo. O método compreende uma etapa anterior de prover uma amostra de sangue, plasma, soro ou sêmen do indivíduo. Na realidade, a presença de MICA tem estado associada com a infertilidade masculina. Em uma forma de realização preferida, o método compreende ensaiar para proteína de MICA solúvel na amostra. Em outra forma de realização preferida, o método compreende ensaiar para ácido nucleico livre de célula codificando MICA.

Em uma terceira forma de realização, o indivíduo é a mulher que fornece o oócito. O indivíduo pode também ser a mulher recebendo. Na realidade, a presença de MICA pode ser útil para avaliar a qualidade do oócito e, desse modo, do embrião, a presença de MICA sendo indicativa de uma mais baixa probabilidade de viabilidade e/ou implantação. Em uma forma de realização preferida, a amostra é selecionada do grupo consistindo de uma amostra de sangue, plasma, soro, biópsia de endométrio, fluido uterino, secreções vaginais e cervicais, muco cervical, bolsa de Douglas, fluido folicular e fluido peritoneal, no caso de exploração celioscópica (endometriose, pélvis aderente, seqüela infecciosa). Em particular, a amostra pode ser um fluido folicular, por exemplo, um fluido folicular obtido por uma perfuração do folículo após colheita de oócitos. Este fluido pode ser provido por perfuração vaginal após indução de ovulação por HCG.

A amostra pode também ser provida de sobrenadante embriônico ou meio de cultura de embrião. Em uma forma de realização particular, o sobrenadante ou o meio de cultura vem de embriões com o objetivo de serem transferidos ou serem congelados.

A amostra pode ser usada diretamente ou pode ser submetida a tratamentos anteriores, tais como congelamento, purificação, aquecimento, concentração, diluição etc.

Portanto, a presente invenção também refere-se a um método para determinar a qualidade do embrião, medindo-se o nível de MICA no meio de cultura de embrião ou sobrenadante. O nível de MICA é medido pelo menos 44 - 46 horas pós fertilização, preferivelmente 60, 70, 80 ou 90 horas pós fertilização. Em uma forma de realização preferida, o método compreende ensaiar para proteína MICA solúvel na amostra. Em outra forma de realização preferida, o método compreende ensaiar para ácido nucleico livre de célula codificando MICA. Em particular, a qualidade do embrião é usada para determinar o potencial para implantação bem sucedida de um embrião. Preferivelmente, o nível de MICA no meio de cultura de embrião ou sobrenadante é indicativo da qualidade do embrião e, desse modo, da probabilidade de implantação com sucesso do embrião. Preferivelmente, quanto mais elevado for o nível de MICA, menor é a qualidade do embrião e, desse modo, a probabilidade de implantação bem sucedida do embrião.

A presente invenção também refere-se a um método para selecionar um embrião adequado para transferência de embrião, fertilização in vitro ou implantação, o método compreendendo medir o nível de MICA no meio ou sobrenadante de cultura do embrião. Em particular, o nível de MICA é indicativo da adequabilidade do embrião para transferência de embrião, fertilização ou implantação in vitro. Preferivelmente, o embrião mostrando o mais baixo nível de MICA no meio de cultura é selecionado para transferência de embrião, fertilização ou implantação in vitro. Na realidade, a presença de MICA tem estado associada com um fracasso de implantação. Em uma forma de realização preferida, o método compreende ensaiar por proteína de MICA solúvel na amostra. Em outra forma de realização preferida, o método compreende ensaiar para ácido nucleico livre de célula codificando MICA.

A presente invenção diz respeito ainda a um método de IVF, compreendendo selecionar um embrião com um método da presente invenção e transferir o embrião para dentro de um útero humano compatível.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a métodos para determinar a probabilidade de complicações na gravidez, incluindo aborto, doenças de gravidez vascular, pré-eclâmpsia, retardamento de crescimento vascular ou não-vasclar intra-uterino (IUGR), associado ou não com pré-eclâmpsia, síndrome HELLP, esteatose gravídica, nefropatia gravídica ou morte fetal intra-uterina, em um indivíduo compreendendo ensaio in vitro para MICA em uma amostra, o nível de MICA sendo indicativo de probabilidade de complicações na gravidez, incluindo aborto, doenças de gravidez vascular, pré-eclâmpsia, retardamento de crescimento intra-uterino vascular ou não-vascular (IUGR), associado ou não com pré- eclâmpsia, síndrome de HELLP, esteatose gravídica, nefropatia gravídica ou morte fetal intra-uterina. Em particular, o presente método é útil para determinar a severidade da pré-eclâmpsia. Portanto, a presente invenção diz respeito a um método para determinar a probabilidade de pré-eclâmpsia severa em um indivíduo, compreendendo ensaio in vitro para MICA em uma amostra, o nível de MICA sendo indicativo de uma probabilidade depré- eclâmpsia severa.

O método pode compreender uma etapa anterior de prover uma amostra.

A amostra usada neste método pode ser selecionada do grupo consistindo de sangue, plasma, soro, placenta, sangue do cordão, células endoteliais e amostras do fluido amniótico. Em uma forma de realização preferida, a amostra é uma amostra de sangue, plasma ou soro, preferivelmente uma amostra de soro. A amostra pode ser usada diretamente ou pode ser submetida a tratamentos anteriores.

O indivíduo é preferivelmente uma mulher grávida ou uma mulher desejando ficar grávida.

Em uma forma de realização preferida, o método compreende ensaiar para proteína de MICA solúvel na amostra. Em outra forma de realização preferida, o método compreende ensaiar para ácido nucleico livre de célula codificando MICA. Em uma forma de realização preferida adicional, o método compreende um ensaio de MICA indireto e compreende ensaiar para anticorpos anti-MICA presentes na amostra.

Preferivelmente, o nível de MICA solúvel é determinado após a implantação do embrião. Preferivelmente, a detecção de MICA solúvel em uma amostra de soro, por exemplo, pelo menos 0,3 ng/ml, 0,5 n/ml, 0,75 ng/ml ou 1n/ml, é indicativa de uma mais elevada probabilidade de gravidez patológica, incluindo aborto, doenças da gravidez vascular, pré-eclâmpsia, retardamento do crescimento intra-uterino vascular ou não-vascular (IUGR), associado ou não com pré-eclâmpsia, síndrome de HELLP, esteatose gravídica, nefropatia gravídica ou morte fetal intra-uterina, mais preferivelmente uma patologia selecionada do grupo consistindo de VPD, pré- eclâmpsia, IUGR, IUFD e uma combinação delas. Preferivelmente, a detecção de MICA solúvel em uma amostra de soro, por exemplo, pelo menos 0,3 ng/ml, 0,5 ng/ml, 0,75 ng/ml ou 1 ng/ml, é também indicativa de uma mais elevada probabilidade de severa pré-eclâmpsia, em particular pré- eclâmpsia associada com proteinúria refletindo insuficiência renal e/ou incisura uterina diastólica prematura bilateral, que é uma reflexão da insuficiência placentária. Em uma forma de realização particular, um nível de proteína MICA solúvel de uma amostra de soro maior do que 2,5 a 10 ng/ml, é indicativa de uma alta probabilidade de gravidez patóltica, incluindo aborto, doenças de gravidez vascular, pré-eclâmpsia, retardamento do crescimento intra-uterino (IUGR), associado ou não com pré-eclâmpsia, síndrome de HELLP, esteatose gravídica, nefropatia gravídica ou morte fetal intra-uterina.

A presente invenção também refere-se a um método para diferenciar retardamento do crescimento intra-uterino (IUGR) vascular de não-vascular em um indivíduo compreendendo ensaio in vitro para MICA em uma amostra, o nível de MICA sendo indicativo de uma probabilidade de IUGR vascular. Preferivelmente, a amostra é uma amostra de sangue, plasma ou soro, preferivelmente uma amostra de soro. Mais preferivelmente, a detecção de MICA solúvel na amostra, preferivelmente pelo menos 0,3 ng/ml, 0,5 ng/ml, 0,75 ng/ml ou 1 ng/ml, é indicativa de uma IUGR vascular. Preferivelmente, o nível de MICA solúvel é determinado após implantação do embrião.

Como indicado acima, a etapa de ensaiar MICA pode compreender ensaiar a proteína MICA solúvel na amostra. Em uma forma de realização preferida, a etapa de ensaiar para proteína de MICA solúvel na amostra de fluido compreende contatar a amostra com um anticorpo anti- MICA. Em uma forma de realização preferida, a etapa de ensaiar para MICA solúvel na amostra é realizada por ensaio ELISA, preferivelmente por ensaio ELISA sanduíche. As técnicas ELISA para análise e quantificação de proteínas, especialmente proteínas solúveis, são bem conhecidas pela pessoa hábil na arte. Em uma forma de realização alternativa, a etapa de ensaiar para mica solúvel na amostra é realizada acoplando-se o anticorpo a microcontas (tecnologia Luminex), Western blot, dot blot, radioimunoensaio (RIA), análise FACS e outras técnicas de imunoensaio bem conhecidas da pessoa hábil na arte.

Por exemplo, um ensaio ELISA pode ser realizado como segue: uma amostra de teste é imobilizada em poços de uma placa de microtítulo de poliestireno; anticorpos anti-MICA são adicionados aos poços; após ligação e lavagem para remover ligação não específica, os anticorpos anti-MICA ligados são detectados. A detecção é com freqüência conseguida pela adição de um anticorpo detectável, específico de anticorpos anti-MICA.

Por exemplo, pode ser detectado por um terceiro anticorpo direcionado contra a parte Fc do segundo anticorpo (por exemplo, um anticorpo IgG anti- camundongo de cabra). Alternativamente, o anticorpo anti-MICA pode ser rotulado.

Preferivelmente, um ensaio ELISA sanduíche pode ser realizado como segue: anticorpos anti-MICA são imobilizados em poços de uma placa de microtítulo de poliestireno; uma amostra de teste é adicionada aos poços; após ligação e lavagem par remover ligação não-específica, a MICA ligada é detectada por um segundo anticorpo anti-MICA. A detecção é com freqüência conseguida pela adição de um anticorpo detectável específico de anticorpos anti-MICA. Por exemplo, ele pode ser detectado por um terceiro anticorpo direcionado contra a parte Fc do segundo anticorpo (por exemplo, um anticorpo IgG anticamundongo de cabra). Alternativamente, o segundo anticorpo anti-MICA pode ser rotulado.

Os anticorpos anti-MICA úteis na presente invenção podem ser policlonais ou monoclonais. Os anticorpos podem ser de qualquer classe, preferivelmente IgG1 ou IgG2a. Eles podem ser específicos de MICA, em particular MICA solúvel. Estes anticorpos são capazes de ligarem-se à parte extra-celular de MICA. Alternativamente, eles podem ligar-se tanto a MICA como MICB.

Meios para preparar e caracterizar anticorpos são bem conhecidos na arte (Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)). Exemplos mais específicos de anticorpos são os seguintes: 2C10, 6D4, 6G6 e 3H5 de WO 03/089616 e SR99, SR104 e SR116 de Hue et al. (2003). Preferivelmente, o anticorpo anti-MICA é um anticorpo monoclonal, preferivelmente selecionado do grupo consistindo de SR99, SR104 e SR116.

Os anticorpos anti-MICA podem ser rotulados. O rótulo pode ser radioativo, fluorescente, quimioluminescente, uma enzima ou um ligando. Os anticorpos anti-MICA podem também ser não rotulados e podem ser usados em conjunto com um agente de detecção que é rotulado. Por exemplo, eles podem ser detectados por um segundo anticorpo dirigido contra a parte Fc do anticorpo anti-MICA (por exemplo, um anticorpo IgG anticamundongo de cabra).

Como indicado acima, a etapa de ensaiar MICA pode compreender ensaiar para ácido nucleico livre codificando MICA. O ácido nucleico codificando MICA pode ser RANA ou DNA. A entrada do Genbank para o mRNA codificando MICA Homo sapiens é NM 000247. O GeneID para Homo sapiens MICA é 4276. Tal ácido nucleico livre de célula codificando MICA pode ser livre na amostra de fluido e/ou compreendido dentro de micropartículas circulantes, em particular micropartículas presentes em amostras de sangue ou soro. O ácido nucleico codificando MICA pode ser ensaiado por qualquer meio bem conhecido pela pessoa hábil na arte. Por exemplo, pode ser ensaiado por PCR quantitativo em tempo real, RT-PCR, por PCR, por Southern ou Northern blot ou uma combinação deles, utilizando-se iniciadores e sonda adequados. Em uma forma de realização preferida, é ensaiado por PCR quantitativo ou RT-PCR. A pessoa hábil na arte pode facilmente projetar par de iniciadores adequados. Por exemplo, um par de iniciadores adequado, para ensaiar MIC A RNA por RT-PCR quantitativo por sybergreen, pode ser o seguinte: MICA 970F e MICA 1127R.

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Os ácidos nucleicos da amostra podem ser purificados ou enriquecidos antes de aplicar estas técnicas. A detecção dos ácidos nucleicos codificando MICA foi extensamente descrita no pedido de patente WO 98/19167, cuja descrição é por este meio incorporada por referência.

Como indicado acima, a etapa de ensaiar MICA pode compreender anticorpos anti-MICA presentes na amostra. Por exemplo, os anticorpos anti-MICA podem ser detectados por ensaio ELISA utilizando-se proteínas de MICA, preferivelmente proteína de MICA recombinante. Os métodos para preparar tais proteínas de MICA foram extensamente descritos nos pedidos de patente WO 98/19167 e WO 03/089616, cuja descrição é por este meio incorporada por referência. Alternativamente, a etapa de ensaiar anticorpos anti-MICA na amostra pode ser realizada acoplando-se de MIC, preferivelmente MIC A, a microcontas (tecnologia Luminex). Um kit comercialmente disponível Labscreen (One Lambda, ref LSMICA001) é útil para ensaiar anticorpos MIC em uma amostra de soro por Luminex. Tal ensaio de anticorpos anti-MIC pode ser eficaz para o ensaio de autoanticorpos em patologia autoimune associada com infertilidade (doença celíaca, APS...). Este ensaio pode também ser valioso no caso de mulheres tendo uma patologia gravídica com etiologia imunológica (pré-eclâmpsia, aborto habitual). Além disso, a presente invenção refere-se a um método para determinar a probabilidade de infertilidade em um indivíduo sofrendo de uma doença ou distúrbio autoimune, compreendendo medir o nível de MICA em uma amostra do indivíduo, o nível de MICA sendo indicativo da probabilidade de infertilidade para o indivíduo. Opcionalmente, o método pode compreender uma etapa anterior de prover uma amostra do indivíduo. A amostra pode ser selecionada do grupo consistindo de sangue, plasma, soro, biópsia de endométrio, fluido uterino, secreções vaginal e cervical, muco cervical, bolsa de Douglas, fluido folicular, fluidoperitoneal no caso de exploração celioscópica, e sêmen. Em uma forma de realização preferida, o método compreende ensaiar para proteína MICA solúvel na amostra. Em uma outra forma de realização preferida, o método compreende ensaiar para ácido nucleico livre de célula codificando MICA. Em urna forma de realização preferida adicional, o método compreende ensaiar para anticorpos anti-MICA presentes na amostra.

A presente invenção também diz respeito ao uso de um kit compreendendo pelo menos um elemento selecionado do grupo consistindo de um anticorpo anti-MICA, um conjunto de iniciadores específicos de um ácido nucleico codificando MICA, uma sonda específica de um ácido nucleico codificando MICA e uma proteína MICA na medicina e biologia da reprodução. Ela também ser refere a um kit para a medicina e biologia da reprodução, compreendendo pelo menos um elemento selecionado do grupo consistindo de um anticorpo anti-MICA, um conjunto de iniciadores específico de um ácido nucleico codificando MICA, uma sonda específica de um ácido nucleico codificando MICA e uma proteína MICA, A proteína MICA pode ser uma MICA solúvel. O kit pode ainda compreender um folheto, quaisquer controles negativos e positivos adequados, proteína padrão e/ou reagente de detecção.

Em uma forma de realização preferida, o kit compreende um anticorpo anti-MICA. O kit pode ainda compreender uma proteína MIC solúvel, preferivelmente uma proteína MICA. MICA solúvel pode ser produzida por expressão recombinante de uma MICA truncada. MICA solúvel pode ser expressa de células hospedeiras adequadas, tais como células bacterianas, de levedura, mamífero e inseto. Para facilitar a purificação, uma etiqueta tal como etiqueta Myc ou His pode ser incluída na seqüência de codificação. Tal MICA solúvel pode ser útil para controles positivos. Moléculas MICA solúveis recombinantes podem ser preparadas como descrito em Hue et al., 2003 (p. 1910). cuja descrição é incorporada aqui por referência. O kit pode ainda compreender uma placa de microtítulo, opcionalmente tendo um anticorpo anti-MICA imobilizado nos poços de placa de microtítulo. Finalmente, o kit pode compreender quaisquer reagentes ou solvente de imunodetecção adequados. A presente invenção também refere-se em particular ao uso do kit para a probabilidade de fracasso de fertilização in vitro (IVF), fracasso de implantação de embrião, aborto, retardamento do crescimento intra-uterino e pré-eclâmpsia. Preferivelmente, o anticorpo anti-MICA é um anticorpo monoclonal, preferivelmente selecionado do grupo consistindo de SR99, SRl 04 e SRl 16. Em uma forma de realização particular, o kit compreende ainda uma proteína MICA solúvel.

A presente invenção também diz respeito ao uso de um kit de acordo com a presente invenção, para selecionar um indivíduo adequado para uma IVF, para determinar resultado de fertilização in vitro, para determinar qualidade do sêmen ou espermatozóide, para selecionar o sêmen ou espermatozóide adequado para IVF, para determinar a probabilidade de infertilidade masculina em um indivíduo, para determinar a qualidade do embrião, para selecionar um embrião adequado para transferência de embrião, fertilização in vitro, ou implantação, para identificar um indivíduo tendo um elevado risco de complicação durante a gravidez, em particular um indivíduo susceptível de aborto, doenças de gravidez vascular, pré-eclâmpsia, retardamento do crescimento intra-uterino (IUGR), associado ou não com pré- eclâmpsia, síndrome de HELLP, esteatose gravídica, nefropatia gravídica ou morte fetal intra-uterina, para determinar a severidade da pré-eclâmpsia, para diferenciar retardamento do crescimento intra-uterino (IUGR) vascular de não vascular e para determinar a probabilidade de infertilidade em um indivíduo tendo uma doença auto-imune, em particular uma doença celíaca ou uma síndrome de anticorpo antifosfolipídeo (APS).

A presente invenção também refere-se a um kit para ensaiar MICA solúvel, compreendendo pelo menos um anticorpo anti-MICA. selecionado do grupo consistindo de SR99, SRl04 e SRl 16. Preferivelmente, o kit compreende dois anticorpos anti-MICA, em particular SR99 e SRl 04. Opcionalmente, um dos anticorpos é rotulado (p. ex., anticorpo biotinilado). Em uma forma de realização preferida, o kit é adequado para ensaio ELISA sanduíche. A presente invenção refere-se ainda ao uso deste kit em um método de acordo com a presente invenção.

Além disso, o ensaio de MIC em qualquer um métodos e usos da presente invenção pode ser combinado com o ensaio de outros marcadores conhecidos na arte. A combinação de diversos marcadores pode ainda aumentar a prognosticabilidade. Por exemplo, estes marcadores adicionais podem ser selecionados no grupo consistindo de marcadores HLA-G e angiogênicos, tais como endoglina, PIGF e sFLTl. A fim de ensaiar estes marcadores adicionais, o kit pode compreender um ou diversos elementos adicionais, selecionados do grupo consistindo de um anticorpo, iniciadores e sondas específicas de um ou mais marcadores adicionais, tais como um anticorpo HLA-G, endoglina, PIGF e/ou sFLTl, um conjunto de iniciadores específicos de um ácido nucleico codificando HLA-G, endoglina, PIGF ou sFLTl e/ou uma sonda específica de um ácido nucleico codificando HLA-G, endoglina, PIGF ou sFLTl.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção serão descritos na seguinte seção experimental, que deve ser considerada como ilustrativa e não limitante do escopo da presente invenção. O conteúdo de todas as referências, incluindo artigos, patentes e pedidos de patente citados no presente relatório e nos exemplo e totalmente incorporado ali por referência. Exemplos

Exemplo 1: níveis de soro de MIC solúvel são marcadores preditivos de fracasso de implantação e gravidezes de termo bem sucedidas, em seguida fertilização in vitro.

NK uterino (uNK) são a população de células linfóides predominante, encontrada no sítio de implante de embrião, e progressivamente desaparece após média-gestação. Mecanismos imunes inatos, operando na mãe, pensa-se assim terem uma forte influência na aceitação do feto semi-alogênico. Em particular, os receptores uNK reconhecem os ligandos paternal/trofoblasto, que evitam o ataque fetal pelo sistema imune maternal.

A presença de HLA-G solúvel, um ligando inibidor de NK conhecido, usualmente expresso na interface fetomaternal, em sobrenadantes de embrião, tem sido correlacionada com mais elevadas taxas de embrião, após fertilização in vitro (IVF) (Fuzzi et al., 2002; Warner et al., 2004). A interação entre os receptores da imunoglobulina matadora maternal (KIR) em uNK e HLA-C fetal, também influencia o sucesso reprodutivo (Hiby et al., 2004; Parham, 2004; Wu et al., 2004). Além disso, as células uNK secretam fatores angiogênicos e citocinas que favorecem a implantação e placentação (Ashkar et al., 2003; Coulam et al., 2003; Coulam et al., 2003; Hanna et al., 2006; Ledee-Bataille et al., 2004; Moffett-King, 2002).

Portanto, os inventores deduziram que qualquer disfunção das células uNK deve, assim, representar uma desvantagem para implantação e gravidez bem sucedidas. As implicações funcionais da expressão das moléculas relacionadas com MHC classe I indutíveis por tensão de sMIC tem sido largamente exploradas em oncologia (Carbone et aL, 2005; Groh et al., 2005; Groh et al., 1998) e a autoimunidade (Hue et al., 2004; Meresse et al., 2004).

A expressão de ligandos NKG2D induzida por estresse em células alogênicas ou células autólogas foi mostrada alvejar a citotoxicidade de célula NK e a produção de citocina/quimiocina (André et al., 2004; Lanier, 2005; Meresse et al., 2004; Raulet et al., 2003; Sutherland et al., 2002). Os duplos mecanismos ativadores e estimuladores têm sido associados com a insinuação do MIC solúvel pelo receptor NKG2D. Na realidade, a liberação de uma forma solúvel de MIC (sMIC) no soro de alguns pacientes com câncer mostrou induzir internalização do receptor NKG2D estimulador no efetor NK e linfócitos T, assim prejudicando as respostas imunes anti-tumor tanto inatas como adaptativas e um mecanismo de escape favorecendo o crescimento do tumor (Groh et al, 2002; Wu et al, 2004). Tal regulação descendente de NKG2D por SMIC derivado de placenta foi também recentemente sugerida como um mecanismo de escape imune, que pode regular descendentemente as respostas imunes maternais durante a gravidez (Mincheva-Nilsson et al., 2006).

Entretanto, as moléculas relacionadas com MHC classe I indutível por estresse sMIC não foram nunca investigadas com respeito ao fracasso de reprodução. Pela primeira vez os inventores investigaram se sMICA do soro poderia ser evidenciada em mulheres que deixaram de tornar- se grávidas ou parir a bebê viável após fertilização in vitro (IVF).

Materiais e Métodos

Indivíduos e Métodos

O presente estudo prospectivo, aprovado pelo comitê de ética local, foi realizado em uma série consecutiva de pacientes inférteis, que sofriam de uma IVF ou ICSI, no Center of Assisted Reproductive Medicine, La Conception Hospital in Marseilles (janeiro de 2004 - Outubro de 2005). Um coorte de 170 mulheres inférteis, todas candidatas para IVF, foi recrutado para este estudo após consentimento dado. As indicações clínicas eram infertilidade não explicada, infertilidade masculina e fator tubal. Nenhuma das mulheres incluída tinha uma história de gravidez anterior. As amostras de plasma foram coletadas durante a fase folicular do ciclo precedendo IVF. Todos os pacientes receberam um regime de estimulação similar. A estimulação ovariana foi realizada utilizando-se FSH recombinante (Gonal F®, Serono Pharma5 Paris, França; Puregon®, Organon France, Paris, França) iniciada após regulação descendente pituitária com análogo de agonista Gnrh. Dessensibilização pituitária completa foi confirmada por tanto por estradiol de baixo plasma abaixo de 50 pg/ml e exame ultrassom, para excluir cisto ovariano e confirmou a espessura endometrial abaixo de 5 mm. Gonadotrofma cloriônica humana 1000 UI (HCG) foi administrada quando pelo menos três folículos excederam 16 mm de diâmetro. A recuperação do oócito foi realizada por orientação de ultrassom transvaginal e anestesia geral 32 - 34 horas pós administração HCG. A fase lútea foi suportada com progesterona natural a partir do dia de transferência do embrião. A transferência do embrião foi realizada no 2o. ou 3o. dia pós-coleta do oócito. Uma única medição de HCG no soro foi realizada 15 dias após transferência do embrião. Uma gravidez clínica foi definida quando um saco gestacional intra uterino com batimento cardíaco fetal foi detectado por ultrassonografia transvaginal.

Os oócitos coletados foram cultivados em uma multi-placa de quatro poços com 600 μl de meio de cultura adicionados com suplemento substituto de soro. Cada poço continha de um a quatro oócitos. Técnica IVF ou ICSI foi usada para inseminação. A fertilização dos oócitos foi observada 16 - 18 h após inseminação sob um microscópio invertido e a taxa de fertilização foi calculada. Os embriões foram examinados após 48 h ou 72 h em cultura, a taxa de clivagem foi avaliada e até quatro embriões foram escolhidos para transferência. Os embriões foram graduados de acordo com o número de blastômeros e o grau de fragmentação. As graduações usadas foram: grau 1 (sem fragmentos), grau 2 (<20%), grau 3 (20-50% de fragmentação), grau 4 (>50% fragmentação). Ensaio ELISA de níveis de MIC solúveis em plasma

Construção, expressão e purificação de moléculas MICA solúveis: Moléculas de MICA solúveis recombinantes foram preparadas como descrito em Hue et al, 2003 (p. 1910), cuja descrição é incorporada aqui por referência.

Produção de mAbs anti-MICA: Anticorpos monoclonais anti- MICA foram produzidos como descrito em Hue et al, 2003 (p. 1910), cuja descrição é incorporada aqui por referência.

Detecção de MICA solúvel por ELISA: Para detectar MICA solúvel no soro, dois diferentes mAbs anti-MIC foram usados em um ELISA sanduíche. Placas de poliestireno de elevada ligação (Greiner; Sigma Aldrich) foram revestidas com o SR99 Ab de captura (5 μg/ml em PBS, 100 μL por poço) por 12 h a 4 0C, lavadas cinco vezes com PBS mais 0,05% de Tween 20, bloqueadas pela adição de 100 μL de 5% BSA por 1 h a 22 0C, e lavadas em PBS-0,05% Tween 20. As amostras padrão (diluições seriais de rMICA solúvel de 100 μ§/πι1 a 0,1 ng/ml em PBS-0,05% Tween 20) e de soro (100 μL por poço) foram então adicionadas por 2 h em temperatura ambiente. Após cinco lavagens, a detecção SR104 biotinilada Ab (150 ng/ml em PBS, 100 μL por poço) foi adicionada por 1 h em temperatura ambiente. As placas foram lavadas e incubadas por 20 min em temperatura ambiente com HRP conjugado por estreptavidina (1/30.000; Amersham Pharmacia Biotech), lavadas e reagidas com substrato de tetrametilbenzidina (Sigma-Aldrich) por 15 min a 37°C. A reação foi parada com 0,5 M H2SO4 (50 μl por poço). A absorvência foi medida a 450 nm. O limiar de detecção da proteína MICA solúvel recombinante foi de 0,1 ng/ml. Análise Estatística

Diferenças entre grupos foram avaliadas quanto à significância estatística por um teste t de Student ANOVA de uma-direção ou teste de soma de categoria Mann-Whitney, dependendo de se os dados eram normalmente distribuídos, usando-se o GraphPad Prism software versão 4,0b. Análise de qui-quadrado foi usada para comparar as freqüências sMIC entre vários grupos independentes. Análise de curva característica de receptor-operador (ROC) foi usada para analisar os pontos de corte de concentração SMICA e sua sensibilidade/especificidade. O corte determinado ainda usado para avaliar os riscos relativos e a de razão de probabilidade de não ocorrência. Os valores ρ significativos foram ajustados como <0,05.

Resultados

Níveis de soro sMIC mais elevados foram encontrados em mulheres inférteis, que experimentaram fracasso de implantação após IVF.

Dos 170 pacientes incluídos, 38 experimentaram implantação de embrião bem sucedida em seguida a IVF, entre as quais 30 ocorrendo gravidez deram à luz um bebê viável a termo e 8 abortos ocorreram após implantação bem sucedida. Três pacientes experimentaram aborto a 8 SA, dois pacientes a 9 SA, dois pacientes a 6 SA e um paciente a 7 SA. Relatórios de patologia (realizados para perdas > 8 SA) não foram em favor de perdas genéticas. As características do paciente são resumidas na Tabela 1.

sMIC do soro foi medido utilizando-se um ELISA sanduíche, como descrito (Hue et al, 2004). Sessenta e quatro (38 %) pacientes sofrendo IVF tinham níveis de soro sMIC detectáveis (média = 15,28 ng/ml, 95% faixas inferior-superior = 10,7 - 19,9 ng/ml).

Apesar do fato de que os parâmetros associados com o resultado de IVF foram normalizados nestes grupos (Tabela 1), os níveis de sMIC médios em pacientes positivos significativamente diferiram em mulheres que tinham implantação de embrião bem sucedida (média = 2,5, 25 - 75% faixas percentuais: 1,5 — 9,7) quando comparado com o grupo de fracasso de implantação (12,0, 3 — 24,2, < 0,021). Os inventores assim investigaram ainda se os valores dos níveis de sMIC podem ajudar na predição de fracasso de implantação em mulheres positivas sMIC. Eles assim definira um valor de corte de 2,45 ng/ml, permitindo avaliação de risco por análise ROC (sensibilidade 82, especificidade 50%). sMIC > a 2,45 foram associados com fracasso de implantação (razão de probabilidade de não ocorrência: 4,6, 95% CI 1,08 - 19,79, ρ = 0,031. Os níveis de soro sMIC > 27,7 ng/ml foram sempre associados com a falta de implantação de embrião após IVF (Fig. 1).

Tabela 1: Características das 170 mulheres inférteis recrutadas no estudo

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Níveis de soro sMIC predizem chances de ter um bebê nascido viável a termo após IVF.

Além do fracasso de implantação predito, os inventores ainda prospectivamente ensaiaram se os níveis de sMIC aumentados poderiam predizer o resultado da IVF como nascimento de um bebê vivo. Na realidade, após a implantação ter sido bem sucedida (38 mulheres), 8 mulheres experimentaram um abordo após IVF e 30 deram à luz um bebê viável. Quando positivos, os valores MIC de soro solúvel observados antes de IVF foram constatados serem significativamente menores no grupo de mulheres que deram à luz após IVF (média = 2 ng/ml, min.- máx. faixas: 1-6 ng/ml) com referência a mulheres que experimentaram aborto ou fracasso de implantação após IVF (média =11 ng/ml, min-máx: 0,1 - 96 ng/ml, Fig. 1). Os inventores assim avaliaram o valor de sMIC que pode predizer chances de obter-se gravidez bem sucedida, em vez de aborto ou fracasso de implantação. Usando-se o mesmo corte de 2,45 ng/ml (sensibilidade = 82% e especificidade = 75%), as chances de ter-se um bebê viável foram mais elevadas quando predito por níveis de soro de sMIC antes da IVF que são mais baixos do que o limite de 2,45 ng/ml (razão de probabilidade de não ocorrência = 13,8, CI 95% = 2,03 - 118, ρ = 0,002). Valores mais elevados de sMIC observados em mulheres conseguindo gravidez ocorrendo foram de 6 ng/ml (Fig. 1).

Os elevados valores de sMIC são associados com aborto após sucesso de implantação.

Embora a freqüência de mulheres positivas sMIC não diferisse significativamente em relação ao sucesso de implantação (36% no grupo de sucesso de implantação versus 38% no de fracasso de implantação), quando a implantação foi bem sucedida (38 casos), as freqüências de sMIC positivo foram mais elevadas no grupo de mulheres experimentando aborto (75%) do que naquele com gravidez de termo bem sucedida (26%, ρ = 0,003). Além disso, quando níveis de soro sMIC médios antes de IVF foram mostrados serem mais elevados no grupo que experimentou aborto após IVF (média = 9,7, min.-máx. observados = 2,5 - 24 ng/ml) do que no grupo conseguindo gravidez bem sucedida (média = 2,1, faixas min.-máx. 1- 6 ng/ml. Os inventores assim, ainda avaliaram se o risco de aborto poderia ser predito pelos níveis de soro sMIC. Embora níveis de soro sMIC mais elevados não fossem associados com a ocorrência de aborto na população total de mulheres grávidas na ausência de IW, os inventores puderam mostrar que, quando a implantação é bem sucedida após IVF, mais elevado sMIC foram associados com aborto ocorrendo durante a gravidez obtida após IVF. Na realidade, usando-se um valor de corte de níveis de soro sMIC > 3,2 ng/ml (sensibilidade 83% e especificidade 75%), sMIC pôde predizer aborto após implantação bem sucedida quando comparado com gravidez a termo (razão de probabilidade de não ocorrência - 35, ρ = 0,026, 95% CI 1,74 - 703). Não foi observado nascimento a termo quando as mulheres tinham níveis de soro sMIC > 6 ng/ml.

Discussão

Os mecanismos pelos quais sMIC influencia a implantação do embrião permanecem obscuros. As células matadoras naturais representam um papel essencial em estágios iniciais de implantação, visto que elas representam os parceiros imunes predominantes controlando a produção de citocina/quimiocina/fator angiogênico e modelagem de trofoblasto (Sargent et al., 2006). sMIC é um dos numerosos ligandos para o receptor NKG2D ativante, largamente expresso em NK e CD8 e linfóticos γδ Τ. O contato dos receptores NKG2D ativantes pelos ligandos NKG2D, entre os quais MIC solúvel, é um sinal coestimulatório para atividade citotóxica mediada por NK, proliferação, e produção de citocina (André et al, 2004; Bryceson et al, 2006; Raulet et al, 2003; Sutherland et al., 2002; Upshaw et al, 2006). Alternativamente, a internalização induzida por sMIC de seu receptor NKG2D foi descrita como uma atividade da célula NK antitumoral reguladora descendente (Wu et al, 2004). A regulação descendente de NKG2D por MIC solúvel derivada de placenta foi recentemente sugerida como um mecanismo de escape imune favorecendo a sobrevivência fetal (Mincheva-Nilsson et al., 2006). Assim, a modulação do repertório ou atividade lítica da citocina da célula uNK, resultante da interação entre o receptor NKG2D e seus ligandos, pode afetar o ambiente de implantação e ser prejudicial a gravidez bem sucedida após IVF.

O principal achado dos inventores é assim de que a molécula Relacionada com a Cadeia de MHC classe I imunoestimulatória indutível por estresse é prevalente antes de IVF em mulheres que experimentem fracasso de implantação e gravidez. Os níveis de soro de sMIC maiores do que 2,45 ng/ml são preditivos de matriz de mais elevadas taxas de fracasso de implantação e que níveis de soro sMIC > 6 ng/ml nunca resultaram em gravidez de evolução a termo, enquanto níveis > 28 ng/ml foram sempre associados com fracasso de IVF. Além disso, após implantação bem sucedida, as mulheres que possuem níveis sMIC >3,2 ng/ml estão sob altos riscos de experimentar aborto após IVF1. Os mecanismos relacionados com o status de origem e infertilidade, que podem contribuir para níveis aumentados de proteína sMIC no soro de mulheres que não obterão gravidez bem sucedida após fracasso de IVF permanecem não esclarecidos. A liberação de sMIC da membrana de células expressando-MIC foi relatada envolver clivagem por metaloproteinase (Waldhauer et al., 2006). A atividade da metaloproteinase alterada foi relatada em pacientes IVF com fracasso de implantação recorrente (Shibahara et al., 2005). Outra investigação dos mecanismos gerando MIC solúvel e o impacto de sMIC sobre as funções imunes associadas com o fracasso da implantação ou perda de gravidez após IVF são agora problemas desafiadores a explorar. O fato de que sMIC seja também um marcador dos processos auto e aloimunes, como contribuídos pelos coautores deste estudo em doença celíaca (Hue et al., 2004), onde mais elevada prevalência de infertilidade é informada (Meloni et al., 1999), sugere que sMIC possa ser a assinatura de um mais elevado potencial auto ou alorreativo da mãe para rejeitar o embrião fetal.

No todo, considerando elevadas implicações econômicas e psicológicas da IVF, este estudo é o primeiro a fornecer argumentos de que a quantificação de sMIC sérico pode ser considerada como um novo parâmetro com aplicações na avaliação não-invasiva e predição de resultado de IVF. Além disso, seu valor prognóstico, um principal valor deste biomarcador, é a possibilidade de sua dosagem antes da iniciação de tratamento de condicionamento hormonal de mulheres. Estes aspectos devem assim melhorar o aconselhamento ou controle dos riscos associados com IVF e, assim, prover conseqüentes benefícios para cuidados da saúde de mulheres inférteis.

Exemplo 2: MIC solúvel é encontrado em mais elevadas freqüências no plasma de doenças de gravidez vascular em mulheres.

A gravidez cria uma única situação em que a angiogênese extensa e o estabelecimento de tolerância imune maternal permitem desenvolvimento fetai e piacentai bem sucedido. Interferência entre células fetais de trofoblasto e células imunes maternais regulam o desenvolvimento inicial piacentai da gravidez, a vasculogênese e tolerância imune do feto. Placentação inadequada resulta em doenças de gravidez vascular (VPD), que incluem pré-eclâmpsia (PE), retardamento do crescimento intra-uterino (IUGR) e perda de gravidez recorrente, o que representa uma causa líder da morbidez e mortalidade do feto maternal. A pré-eclâmpsia é caracterizada por hipertensão e proteinúria após 20 semanas de gestação. Apesar dos recentes avanços no entendimento de como vascularização piacentai inadequada (remodelagem de artéria espiral incompleta) pode resultar em doenças de gravidez vascular, seu prognóstico permanece cruel e a remoção piacentai é ainda o único tratamento para controlar pré-eclampsia severa e principal restrição do crescimento uterino.

Exemplo 2a Materiais e Métodos Indivíduos

Os níveis de plasma MIC solúvel foram avaliados em 49 mulheres que experimentaram doenças de gravidez vascular (VPD), que incluem retardamento de crescimento intrauterino vascular (IUGR), Pré- eclâmpsia (PE) ou morte fetal intra-uterina (IUFD) e comparados com um grupo de controle de plasma de 53 mulheres com gravidez em andamento normal, igualadas quanto ao termo de gravidez (média 29 semanas). Métodos

A PE foi definida como uma pressão sangüínea arterial diastólica maior do que 90 mm Hg e uma pressão sangüínea sistólica maior do que 140 mm Hg, associada com proteinúria (mais do que 300 mg/24 h). Além disso, severas complicações maternais, associadas com aumentado risco de resultado adverso para tanto mãe como feto, foram relatados, particularmente associação com a síndrome de HELLP (H = hemólise; EL = elevadas enzimas de fígado; e LP = baixas plaquetas (Weinstein et ai., 2005) e oligúria, que conduz a insuficiência renal.

A IUGR vascular foi definida como medição ultrassonográfica < 2,5S percentual para idade gestacional associada com pelo menos um marcador biológico ou sonográfico de "insuficiência placentária" como Doppler de artéria uterina ou umbilical anormal (Chien et al., 2000) ou elevado nível de fibronectina de plasma (Ostlund et al., 2001). Critérios de exclusão do grupo IUGR vascular foram a presença de malformações congênitas ou anormalidades cromossomais no feto, recente citomegalovírus ou infecção toxoplasmática, trauma, abuso de drogas ou álcool durante a gravidez e feto constitucionalmente pequeno para a idade gestacional.

A IUFD foi definida por exame de ultrassom como um feto visível sem atividade cardíaca após 12 semanas de gesta—ao com biometria fetal de acordo com termo, ocorrendo após severo retardamento de crescimento. Resultados Tabela 2: As freqüências observadas no grupo VPD foram mais elevadas do que em um grupo de controle igualado em termo.

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Como mostrado na Figura 2, níveis mais elevados de MIC foram constatados em amostras positivas de MIC+ de mulheres com doenças de gravidez vascular. Exemplo 2 Materiais e Métodos Indivíduos

Em seguida a consentimento informado, 169 mulheres foram consecutivamente incluídas no estudo conduzido através de um período de dois anos (2004 - 2006).

81 pacientes apresentaram doenças de gravidez vascular (VPD) e foram ainda subdivididas em 3 grupos: 40 pacientes com PE, 23 pacientes com IUGR vascular, 18 pacientes com doença fetal intrauterina (IUFD), PE, IUGR, IUFD foi definida como descrita acima no exemplo 2a.

25 pacientes apresentaram IUGR não-vascular isolada, relacionada com aneuplodia fetal cromossomal em 4 casos, síndrome polimalformativa fetal em 8 casos, de origem tóxica ou infecciosa em 3 casos, e pequeno feto para a idade gestacional nos 10 casos restantes. IUGR não- vascular foi diagnosticada como medição ultrassonográfica <2,5° percentual para a idade gestacional com um nível de fibronectina normal, velocidade Doppler de artéria uterina e umbilical.

O grupo de controle consistiu de 63 mulheres grávidas saudáveis, visto por exame ginecológico de rotina e acompanhadas até o parto, para confirmar resultado de gravidez normal (NP). Gravidezes normais foram recrutadas ente 17 e 41 semanas de gestação para igualar o termo de gravidezes normais com aquele de pacientes com VPD.

Coleta de plasma

Amostras de sangue foram coletadas na ocasião do diagnóstico de doenças de gravidez vascular, ou IUGR isolada e na ocasião do exame obstétrico para o grupo de controle das gravidezes normais igualadas em termo. As amostras foram coletadas em 0,129 mol/1 citrato de sódio (3,8 %), centrifugadas e armazenadas a -80° de acordo com procedimentos padrão.

ELISA de captura para sMICA/B

Concentrações de MIC solúvel foram medidas no plasma usando-se um ensaio imunoabsorvente ligado por enzima sanduíche, como anteriormente descrito (Hue et al., 2004). O limiar de detecção da proteína MICA solúvel recombinante, usada como padrão em cada experimento, foi de 0,1 ng/ml e níveis de plasma mais elevados do que 0,3 ng/ml foram considerados como positivos.

Estatística

Foram realizadas análises com Prism software (GraphPad 4.0b, GraphPad, San Diego, CA) implementando-se o teste de Kruskal-Wallis não-paramétrico, seguido pelo pós-teste de Dunn, para comparar 3 ou mais variáveis contínuas, o teste Mann-Whitney para comparar 2 grupos não pareados e o teste de pares igualados Wilcoxon para a expressão NKG2D e os resultados do ensaio de desgranulação CD 107a. Os dados foram expressos como a média [faixa] e a média (pd) dependendo da distribuição. A associação entre variáveis categóricas foi testada após tabulação cruzada pelo qui-quadrado de Pearson (e pelo teste exato de fisher se η <5). A correlação foi melhorada pelo teste de Spearman. Um intervalo de confiança de 95% (p < 0,05) foi considerado significativo.

Análise multivariada de paridade, gestação, pressão sangüínea sistólica e diastólica, idade gestacional na amostragem, termo de parto e peso de bebê nos parâmetros de nascimento foram realizados para identificar marcador independente associado com detecção de MIC solúvel em plasma.

Resultados

Freqüência aumentada de sMLC do plasma em mulheres com doenças de gravidez vascular

Os níveis de plasma de sMIC foram avaliados em 3 grupos de mulheres igualadas em termo com NP, VPD ou IUGR não-vascular. Diferenças não significativas foram encontradas em idade, número de gestação, índice de massa corporal e idade gestacional na amostragem entre gravidezes normais, VPD e IUGR não-vascular. A pressão sangüínea sistólica e diastólica foi significativamente mais elevada em mulheres com VPD. Como esperado, a média de pesos de nascimento e idade gestacional de bebê no parto foram menores no grupo com VPD e IUGR não vascular, em comparação com gravidezes normais (p < 0,001). As principais características clínicas e biológicas destes pacientes são resumidas na Tabela 3.

Tabela 3: Características da população do estudo

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A comparação entre grupos foi realizada com o teste de Kruskal-Wallis não paramétrico, seguido pelo pós-teste de Dunn. Os valores indicam média [25 - 75 faixas interquartil] ρ < 0,001 entre doenças de gravidez vascular e outros grupos

ρ < 0,001 entre gravidezes normais e outros grupos

No grupo NP, somente uma das 63 mulheres tiveram baixos níveis de sMIC no plasma (0,5 ng/ml). Entretanto, deve ser citado que esta paciente foi acompanhada por lúpus sistêmico eritematoso, com normal evolução da gravidez. Das 25 mulheres com IUGR não-vascular, 1 tinha níveis de plasma sMIC detectáveis (1,63 ng/ml). Ao contrário, moléculas sMIC foram detectadas em 26 dos 81 pacientes (32%) no grupo VPF (p < 0,0001 com referência a NP). Além disso, os níveis de sMIC foram significativamente mais elevados em pacientes com pré-eclâmpsia (média, 25 - 75 faixas interquartis: 7,5 ng/ml, 1,37 - 32,69) do que em IUFD (2,18 ng/ml, 0,86 - 7,58, ρ < 0,01) e IUGR vascular (1,63 ng/ml, 0,86 - 5,2, ρ < 0,05) (Tabela 4).

Tabela 4: Freqüência de detecção sMIC e níveis de plasma na população de estudo

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A presença da sMIC no plasma identifica um subgrupo de pré-eclâmpsia severa.

Foi então determinado se a presença de sMIC no plasma materno era associada com marcadores clínicos, biológicos ou sonográficos, que caracterizam a severidade do pré-eclâmpsia de acordo com o termo no diagnóstico, pressão sangüínea sistólica ou diastólica, quantificação da proteinúria, níveis de plasma no ácido úrico e fibronectina, análise de forma de onda de velocidade Doppler na artéria uterina, termo do parto e peso de nascimento do bebê (Tabela 3). Não ouve diferença entre pacientes positivas e negativas-sMIC para pressão sangüínea sistólica ou diastólica, nível de fibronectina e ácido úrico. Entretanto, a proteinúria média por dia, que reflete a insuficiência renal, foi significativamente mais elevada em mulheres PE com plasma positivo-sMIC do que em mulheres PE sem sMIC detectável (p = 0,04, Figura 3A). Análise multivariada de paridade, gestação, pressão sangüínea sistólica e diastólica, idade gestacional na amostragem, tempo de parto e peso de bebê no nascimento confirmaram ainda que a proteinúria era independentemente associada com a presença de sMIC. Além disso, análise sonográfica de forma de onda de velocidade Doppler da artéria uterina maternal, realizada na ocasião da PE mostrou que a incisura uterina diastólica inicial bilateral, uma reflexão da insuficiência placentária, era mais freqüente no grupo positivo-sMIC da PE (p = 0,037, Figura 3B). A freqüência de complicações maternais severas entre pacientes com PE em relação com detecção de plasma sMIC foi então estudada. Entre as 9 mulheres PE com plasma positivo-sMIC, 3 (33%) apresentaram oligúria com insuficiência renal aguda, em comparação com uma das 31 mulheres PE (3,2%) sem sMIC no plasma detectável (p = 0,03). Além disso, a freqüência da síndrome HELLP tendeu a ser mais elevada no grupo PE positivo sMIC (2 ou 9 pacientes, 22,2%), quando comparado com o grupo PE negativo de sMIC (1 em 31 pacientes, 3,2%, ρ = 0,1).

A presença de sMIC no plasma é associada com IUGR vascular

Para estabelecer se a presença de sMIC no plasma associa-se com o origem vascular de IUGR, os inventores compararam os níveis de sMIC em mulheres com IUGR vascular e não-vascular. Entre as 23 pacientes com IUGR vascular, 9 (39%) tinham sMIC no plasma detectável, em comparação com somente uma de cada 25 (4%) com IUGR não-vascular (OR= 15,43 [1,763 - 135], ρ = 0,0038). Assim, enquanto idade, termo na amostragem, peso de nascimento do bebê e termo de parto não eram diferentes entre os 2 grupos, a presença de sMIC em plasma maternal é significativamente associada com IUGR vascular. Além disso, plasma sMIC positivo predisse a etiologia vascular de IUGR com 90% de valor preditivo positivo (96% de especificidade e 39% de sensibilidade) e 63% de valor preditivo negativo.

Discussão

Os resultados dos inventores indicam que as moléculas de MIC solúveis são mais freqüentemente detectadas em plasma de mulheres com doenças de gravidez vascular do que naquelas com gravidez normal igualada quanto à idade gestacional. Além disso, os níveis de plasma da sMIC são correlacionados com a severidade da pré-eclâmpsia e parecem ser um marcador específico da IUGR vascular.

A pré-eclâmpsia é um distúrbio de multissistemas de causa desconhecida, que é único da gravidez humana. Entre eles, defeito trombofílico congênito tem estado associado com a ocorrência de VPD. Novos marcadores inflamatórios e trombóticos foram identificados sem aplicação clínica (Levine et al., 2006, Bretelle et al., 2003 e 2005). Além disso, a elevada proteinúria é associada a aumentado risco de adversos resultados maternais e fetais (Chan et al., 2005). Entretanto, a proteinúria não é independentemente preditiva de resultado adversos e nenhum valor limiar de excreção de proteína pode predizer severa complicação de pré-eclâmpsia. No estado da arte, nenhum marcador relevante de dados clínicos de severidade de PE foi identificado.

Considerando-se os resultados dos inventores, a presença de sMIC em plasma maternal provê um novo marcador clínico da severidade de PE. Opcionalmente, este parâmetro poderia também ser combinado com outros parâmetros, a fim de aumentar o nível de sensibilidade para predizer a pré-eclâmpsia, se necessário.

A presença de sMIC no plasma maternal é também associada com IUGR, outro subtipo de doenças vasculares de múltiplas origens, cujo prognóstico depende da causa, severidade e termo de diagnóstico. A insuficiência placentária devida a placentação anormal constitui a principal causa da IUGR chamada IUGR vascular. A maior parte de IUGR vascular é associada com PE e compartilha a mesma fisiopatologia. Ao contrário, a IUGR isolada pode representar o único sinal sonográfico de infecção fetal severa, aneuplodia ou síndrome genética associada com resultados neurológicos anormais, de modo que as pacientes podem solicitar término da gravidez em tais casos. A IUGR vascular é às vezes facilmente diagnosticada na presença de PE, marcadores vasculares maternais (fibronectina, elevado nível de ácido úrico) ou alteração do fluxo de onda de Velocimetria Doppler. Entretanto, no estado da arte havia uma falta de marcadores não-invasivos e específicos, que permitam diferenciar de IUGR vascular de não vascular. Por exemplo, os índices de Velocimetria Doppler uterina usados na predição de lesões hipóxicas-isquêmicas placentais em IUGR mostram 63% de especificidade para 97% de sensibilidade. Na ausência de etiologia IUGR óbvia, são necessárias explorações fetais invasivas para determinar prognóstico fetal, com taxa não desprezível de parto prematuro e perda fetal tardia.

Os resultados dos inventores mostram que a detecção sMIC em plasma de mulheres permitem predizer a origem vascular de IUGR com 96% de especificidade. Portanto, a quantificação sMIC na ocasião do diagnóstico IUGR constitui uma ferramenta não-invasiva útil para melhorar o controle da IUGR idiopática.

Estes resultados mostram que a quantificação das moléculas sMIC em plasma de mulheres é uma ferramenta não-invasiva útil para predizer o iminente início de complicações vasculares durante a gravidez. Exemplo 3: MIC solúvel é encontrada em mais elevadas freqüências em fluido folicular, sobrenadante de embrião, sêmen e em cateter usado para transferência de embrião, no caso de fracasso de implantação.

Os níveis de MIC solúvel foram avaliados em fluido folicular (FF), sobrenadante de embrião transferido (embrião T) ou em sobrenadante de embrião não-transferido (UT), Sêmen usado para IVF (T) ou não (UT) e em cateter usado para transferência de embrião (KT). A presença de MIC solúvel tem sido mais freqüentemente observada no caso de fracasso de implantação, como mostrado na Tabela 5.

Tabela 5

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Referências

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Claims (35)

1. Método para determinar resultado de fertilização in vitro, dito método caracterizado pelo fato de compreender ensaio in vitro para MICA (proteína A relacionada com cadeia de MHC classe I) em uma amostra, o nível de MICA sendo indicativo do resultado de IVF, em particular indicativo de taxas de fracasso de implantação e/ou aborto.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a amostra ser selecionada do grupo consistindo de: uma amostra de sangue, plasma, soro, biópsia de endométrio, fluido uterino, secreções vaginais e cervicais, muco cervical, bolsa de Douglas e fluido peritoneal no caso de exploração celioscópica (endometriose, pélvis aderente, seqüela infecciosa) de uma mulher que recebe o embrião transferido. uma amostra de sangue, plasma, soro e sêmen de um homem oferecendo o sêmen; uma amostra de sangue, plasma, soro, biópsia de endométrio, fluido uterino, secreções vaginais e cervicais, muco cervical, bolsa de Douglas, fluido folicular e fluido peritoneal no caso de exploração celioscópia (endometriose, pélvis aderente, seqüela infecciosa) de uma mulher fornecendo o oócito; e uma amostra de sobrenadante embriônico ou meio de cultura de embrião.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de a amostra ser uma amostra de sangue, plasma ou soro, preferivelmente uma amostra de soro.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o indivíduo ser a mulher que pretende receber o embrião transferido, o nível de MICA solúvel ser determinado antes do início do tratamento do condicionamento hormonal e um nível de MICA maior do que 2,45 ng/ml na amostra de soro ser indicativo de mais elevadas taxas de fracasso de implantação.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o indivíduo ser a mulher que pretende receber o embrião transferido, o nível de MICA solúvel ser determinado antes do início do tratamento de condicionamento hormonal e um nível de MICA maior do que 28 ng/ml na amostra de soro ser indicativo de uma mais elevada probabilidade de fracasso de IVF.

6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o indivíduo ser a mulher que pretende receber o embrião transferido, o nível de MICA solúvel ser determinado antes do início do tratamento de condicionamento hormonal e um nível de MICA maior do que 6 ng/ml na amostra de soro ser indicativo de uma alta probabilidade de aborto.

7. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o indivíduo ser a mulher que recebe o embrião transferido, o nível de proteína MICA solúvel poder também ser determinado após implantação e um nível de MICA maior do que 3,2 ng/ml na amostra de soro ser indicativo de uma alta probabilidade de aborto.

8. Método para selecionar um indivíduo para uma fertilização in vitro (IVF), dito método caracterizado pelo fato de compreender ensaio in vitro para MICA em uma amostra e seleção do indivíduo tendo um nível de MICA indicativo de uma probabilidade de IVF bem sucedida.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de a amostra ser selecionada do grupo consistindo de uma amostra de sangue, plasma, soro, biópsia de endométrio, fluido uterino, secreções vaginais e cervicais, muco cervical, bolsa de Douglas e fluido peritoneal, no caso de exploração celioscópica (endometriose, pélvis aderente, seqüelas infecciosas.

10. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de a amostra ser uma amostra de sangue, plasma ou soro, preferivelmente uma amostra de soro.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de o nível de MICA solúvel ser determinado antes do início do tratamento de condicionamento hormonal e um nível de MICA solúvel na amostra de soro menor do que 28 ng/ml, preferivelmente menor do que 6 ng/ml e, mais preferivelmente, menor do que 2,45 ng/ml ser indicativo de uma probabilidade de um IVF bem sucedida.

12. Método para determinar a qualidade do sêmen ou espermatozóide ou para determinar a probabilidade de infertilidade masculina em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender ensaio in vitro para MICA em uma amostra de sangue, soro, plasma ou sêmen do indivíduo, o nível de MICA sendo indicativo da qualidade do sêmen ou espermatozóide ou infertilidade masculina.

13. Método para determinar a qualidade do embrião ou para selecionar um embrião adequado para transferência de embrião, fertilização in vitro ou implantação, caracterizado pelo fato de compreender ensaio in vitro para MICA no meio de cultura do embrião ou sobrenadante, o nível de MtCA sendo indicativo da qualidade do embrião ou da adequabilidade do embrião para transferência de embrião, fertilização in vitro ou implantação.

14. Método para determinar a probabilidade de complicações na gravidez, incluindo aborto, doenças de gravidez vascular (VPD), pré- eclâmpsia (PE), retardamento do crescimento intra-uterino (IUGR) vascular, associado ou não com pré-eclâmpsia, síndrome de HELLP, esteatose gravídica, nefropatia gravídica ou morte fetal intra-uterina (IUFD), doenças da gravidez ou infertilidade associadas com patologias autoimunes em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender ensaio in vitro para MICA em uma amostra, o nível de MICA sendo indicativo da probabilidade de complicações na gravidez.

15. Método para determinar a probabilidade de pré-eclâmpsia severa em um indivíduo, dito método caracterizado pelo fato de compreender ensaio in vitro para MICA em uma amostra, o nível de MICA sendo indicativo de uma probabilidade de uma pré-eclâmpsia severa.

16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de a amostra ser selecionada do grupo consistindo de amostras de sangue, plasma, soro, placenta, sangue do cordão, células endoteliais e fluido amniótico.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de a amostra ser uma amostra de sangue, plasma ou soro, preferivelmente uma amostra de soro.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de a detecção de MICA solúvel na amostra, preferivelmente pelo menos 0,3 ng/ml, ser indicativa de uma mais elevada probabilidade de VPD, pré-eclâmpsia, IUGR vascular e/ou IUFD.

19. Método para diferenciar retardamento do crescimento intra-uterino (IUGR) vascular de não-vascular em um indivíduo, dito método caracterizado pelo fato de compreender ensaio in vitro para MICA em uma amostra, o nível de MICA sendo indicativo de uma probabilidade de IUGR vascular.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de a amostra ser uma amostra de sangue, plasma ou soro, preferivelmente uma amostra de soro.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de a detecção de MICA solúvel na amostra, preferivelmente pelo menos 0,3 ng/ml, ser indicativa de uma IUGR vascular.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- -4, 8-10, 12-17 e 19-20, caracterizado pelo fato de a etapa de ensaiar para MICA na amostra compreender uma etapa selecionada de: ensaiar para proteína MICA solúvel na amostra; ensaiar para ácido nucleico livre de célula codificando MICA; e ensaiar para anticorpos anti-MICA presentes na amostra.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- -21, caracterizado pelo fato de a etapa de ensaiar para MICA na amostra compreender contatar a amostra com um anticorpo anti-MICA, preferivelmente um anticorpo anti-MICA monoclonal.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de a etapa de ensaiar para MICA solúvel na amostra ser realizado por ensaio ELISA, preferivelmente por ensaio ELISA sanduíche.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de o ensaio de MICA ser combinado com o ensaio de um ou mais marcadores adicionais.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de dito(s) marcador(es) adicional(ais) ser/serem selecionados do grupo consistindo de marcadores HLA-G e angiogênicos.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de ditos marcadores angiogênicos serem selecionados do grupo consistindo de endoglina, PIGF e sFLTl.

28. Uso de um kit compreendendo pelo menos um elemento selecionado do grupo consistindo de um anticorpo anti-MICA, um conjunto de iniciadores específicos de um ácido nucleico codificando MICA, uma sonda específica de um ácido nucleico codificando MICA e uma proteína MICA, preferivelmente uma proteína MICA, dito uso caracterizado pelo fato de ser na medicina e biologia da reprodução.

29. Uso de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de ser para selecionar um indivíduo adequado para uma IVF, para determinar resultado da fertilização in vitro (IVF), para determinar a qualidade do sêmen ou espermatozóide, para selecionar o sêmen ou espermatozóide adequado para IVF, para determinar a probabilidade de infertilidade masculina em um indivíduo, para determinar a qualidade do embrião, para selecionar um embrião adequado para transferir embrião, fertilização in vitro, ou implantação, para identificar um indivíduo tendo um elevado risco de complicação durante a gravidez, em particular um indivíduo susceptível de aborto, doenças de gravidez vascular, pré-eclâmpsia, retardamento do crescimento intra-uterino (IUGR), associado ou não com pré- eclâmpsia, síndrome de HELLP, esteatose gravídica, nefropatia ou morte fetal intra-uterina, para determinar a severidade da pré-eclâmpsia ou para diferenciar retardamento do crescimento intra-uterino vascular (IUGR) de não-vascular.

30. Uso de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizado pelo fato de o anticorpo anti-MICA ser um anticorpo monoclonal.

31. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 28-30, caracterizado pelo fato de o kit compreender ainda uma proteína MICA solúvel.

32. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, caracterizado pelo fato de o kit compreender ainda um ou mais elementos selecionados do grupo consistindo de anticorpo, iniciadores e sondas específicos de um ou mais marcadores adicionais.

33. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de dito marcador adicional ser selecionado do grupo consistindo de marcadores HLA-G e angiogênicos.

34. Uso de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de dito marcador angiogênico ser selecionado do grupo consistindo de endoglina, PIGF e sFLTl.

35. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 34, caracterizado pelo fato de dito elemento para ensaiar um ou mais marcadores adicionais ser selecionado do grupo consistindo de um anticorpo HLA-G, endoglina, PIGF ou sFLTl, um conjunto de iniciadores específicos de um HLA-G codificando ácido nucleico, engoglina, PIGF ou sFLTl e uma sonda específica de um ácido nucleico codificando HLA-G, endoglina, PIGF ou sFLTl.