CN101638413A - 一种长春碱类生物碱的分离纯化方法 - Google Patents

一种长春碱类生物碱的分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

一种长春碱类生物碱的分离纯化方法，包括如下步骤：(1)粗品的预处理：将长春碱类生物碱粗品湿法上于氧化铝柱上，洗脱，收集生物碱流份，合并后减压浓缩至干，得预处理制品；(2)高效液相色谱分离：先制备色谱柱固定相，填料为硅胶，进样，梯度洗脱，检测器跟踪制备色谱分离情况，薄层层析或高效液相检测，合并富含长春碱流份；(3)重结晶：将生物碱流份减压浓缩至干，低级脂肪醇溶解，然后放置结晶，过滤，干燥。本发明适用于长春碱类生物碱的分离纯化，无须使用特殊填料，也不需要使用高毒性溶剂。操作简便、自动化程度高、分离效果好，固定相所用填料一次装柱、多次使用。流动相可回收循环使用，既环保又经济，适合于工业化生产。

Description

一种长春碱类生物碱的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及长春碱类生物碱，具体地说，涉及长春碱类生物碱的分离纯化方法。
背景技术
长春碱是夹竹桃科植物(Catharanthus roseus)中所含生物碱的一种，作为一种抗有丝分裂药物，能够抑制微管聚合并诱导自缔合的微管蛋白形成盘绕的螺旋形合体。长春碱自1958年被分离到现在的50年间，人们已通过化学方法合成了包括长春碱在内的一系列长春碱类衍生物，其中长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨等长春碱类生物碱已作为当今一大类重要的抗肿瘤药物。
从植物提取分离的长春碱或通过化学半合成方法得到的长春碱类生物碱，一般都含有较多杂质。另外由于长春碱类生物碱结构复杂，性质不太稳定，受热、光照或长时间暴露在空气中都容易变质。故一般的柱层析分离或单靠重结晶办法难以得到较高纯度的长春碱类生物碱。为此，人们在长期的生产和科学实验中，摸索出多种有效分离纯化方法，其中以常规柱层析分离结合重结晶技术较为普遍，也有通过C18反相柱层析分离结合重结晶技术制得符合药典质量标准的产品的方法，然而这种分离纯化技术目前主要应用在长春瑞滨的生产上。
上述方法中，不仅技术专属性强，而且一般需要反复过柱、多次重结晶，操作繁琐、溶剂耗用量大，并由此带来了环境污染问题比较严重。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种纯度高、无须使用特殊填料、也不需要使用高毒性溶剂、操作简单的长春碱类生物碱的分离纯化方法。
一种长春碱类生物碱的分离纯化方法，包括如下步骤：
(1)粗品的预处理：将长春碱类生物碱粗品湿法上于氧化铝柱上，用二氯甲烷-乙醇或三氯甲烷-甲醇洗脱，薄层层析跟踪柱层析分离情况，收集生物碱流份，合并后减压浓缩至干，得预处理制品；
由于无论是从植物提取物或是半合成得到的长春碱类生物碱粗品一般均含有较多的杂质，不经预处理步骤步骤直接上样进行制备色谱分离纯化，往往会导致固定相填料污染，影响制备柱的柱效及使用次数。因此，在生物碱粗品进入制备色谱分离纯化时，最好先将样品进行预处理，使粗品得到初步分离。个别情况也有例外，如长春地辛粗品可以直接用制备色谱进行分离，效果很好。
(2)高效液相色谱分离：先制备色谱柱固定相，填料为硅胶，预处理制品进样后，用三氯甲烷-甲醇或二氯甲烷-乙醇作为流动相进行梯度洗脱，检测器跟踪制备色谱分离情况，薄层层析或高效液相检测，合并富含长春碱流份；
(3)重结晶：将生物碱流份于30～50℃减压浓缩至干，用1～5倍体积低级脂肪醇溶解，然后于-20～-10℃放置结晶，过滤，干燥后得到高纯度的长春碱类生物碱。
在上述长春碱类生物碱的分离纯化方法中，步骤(1)所述长春碱类生物碱包括长春碱、长春新碱、长春地辛或长春瑞滨等等。
在上述长春碱类生物碱的分离纯化方法中，步骤(1)所述氧化铝柱的固定相所用的填料优选为中性氧化铝，粒度为100～200目，生物碱粗品与氧化铝的配比为质量比1∶10～1∶40，其流动相所用溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷。
在上述长春碱类生物碱的分离纯化方法中，步骤(2)所述分离生物碱与硅胶的质量比为1∶20～1∶60，流动相所用溶剂为二氯甲烷-乙醇或三氯甲烷-甲醇。
在上述长春碱类生物碱的分离纯化方法中，步骤(2)高效液相色谱分离是将预处理制品先用1～2倍二氯甲烷或三氯甲烷溶解，过滤后进样，将流动相加至色谱柱中进行洗脱，控制流速40～50ml/min，柱压保持在80～100bar，通过检测器跟踪分离情况，薄层层析检测，收集富含生物碱流份。
在上述长春碱类生物碱的分离纯化方法中，步骤(3)中所述低级脂肪醇优选为甲醇、乙醇、丙醇及其混合溶液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明经过长期研究，采用常规柱层析预处理，结合高效液相制备色谱及重结晶技术形成一种高效、经济的制备高纯度长春碱类生物碱的分离纯化方法。该方法不仅适用于长春瑞滨的分离纯化，也适用于长春地辛、长春碱、长春新碱等长春碱类生物碱的分离纯化，使用范围广。更为可取的是该方法无须使用特殊填料，也不需要使用苯或甲苯等高毒性溶剂。操作简便、自动化程度高、分离效果好，固定相所用填料一次装柱、多次使用。流动相可回收循环使用，既环保又经济，适合于工业化生产。
具体实施方式
实施例1长春碱的分离纯化
取长春碱粗品(含量65％)10g，用20ml二氯甲烷溶解，氧化铝柱层析(氧化铝200g)湿法上样，用二氯甲烷洗脱，薄层色谱(TLC)检测跟踪柱层析分离情况，收集含长春碱流份，于30～35℃减压浓缩至干，得长春碱预处理产物8.5g。
取长春碱预处理产物5g，加入10ml二氯甲烷溶解，手动进样，二氯甲烷-乙醇梯度洗脱，流速40ml/min。(制备柱填料：200～300目，硅胶200g，柱压：80～100bar)。紫外检测器跟踪柱层析分离情况，并佐以TLC进行流份收集分类。合并富含长春碱主流份，于35±10℃减压浓缩至干，得长春碱游离碱3.2g，含量88.5％(HPLC)，经成盐、精制得到硫酸长春碱1.9g，含量98.5％。
实施例2长春新碱的分离纯化
取长春新碱粗品(含量63％)5g，用10ml二氯甲烷溶解，氧化铝柱层析(氧化铝200g)湿法上样，用二氯甲烷洗脱，TLC检测跟踪柱层析分离情况，收集含长春新碱流份，于40～45℃减压浓缩至干，得长春新碱预处理产物8.3g。
取长春新碱预处理产物5g，加入10ml二氯甲烷溶解，手动进样，二氯甲烷-乙醇梯度洗脱，流速50ml/min。(制备柱填料：200～300目，硅胶200g，柱压：80～100bar)。紫外检测器跟踪柱层析分离情况，并佐以TLC进行流份收集分类。合并富含长春新碱主流份，于35±10℃减压浓缩至干，得长春新碱游离碱3.1g，含量86.3％(HPLC)，经成盐、精制得到硫酸长春新碱2.0g，含量99.2％(HPLC)。
实施例3长春地辛的分离纯化
取长春地辛粗品5g(含量65.0％，HPLC)，加入10ml三氯甲烷溶解，手动进样，三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，流速50ml/min。(制备柱填料：200～300目，硅胶200g，柱压：80～100bar)。紫外检测器跟踪柱层分离情况，并佐以TLC进行流份收集分类。合并富含长春地辛主流份，于35±10℃减压浓缩至干，得长春地辛游离碱2.3g，含量95.0％(HPLC)，用甲醇-乙醇重结晶得到长春地辛1.9g，含量97.2％(HPLC)。
实施例4长春瑞滨的分离纯化
取长春瑞滨粗品(含量71.0％，HPLC)10g，用20ml三氯甲烷溶解，氧化铝柱层析(氧化铝200g)湿法上样，用三氯甲烷洗脱，TLC检测跟踪柱层析分离情况，收集含长春瑞滨流份，于35±5℃减压浓缩至干，得长春瑞滨预处理产物8.3g。
取长春瑞滨预处理产物5g，加入10ml三氯甲烷溶解，手动进样，三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，流速50ml/min。(制备柱填料：200～300目，硅胶200g，柱压：80～100bar)。紫外检测器跟踪柱层析分离情况，并佐以TLC进行流份收集分类。合并富含长春瑞滨主流份，于30±5℃减压浓缩至干，得长春瑞滨游离碱2.6g，含量98.4％(HPLC)，用乙醇精制得到长春瑞滨2.2g，含量99.5％(HPLC)。

Claims (6)

1、一种长春碱类生物碱的分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)粗品的预处理：将长春碱类生物碱粗品湿法上于氧化铝柱上，用二氯甲烷-乙醇或三氯甲烷-甲醇洗脱，薄层层析跟踪柱层析分离情况，收集生物碱流份，合并后减压浓缩至干，得预处理制品；
(2)高效液相色谱分离：先制备色谱柱固定相，填料为硅胶，预处理制品进样后，用三氯甲烷-甲醇或二氯甲烷-乙醇作为流动相进行梯度洗脱，检测器跟踪制备色谱分离情况，薄层层析或高效液相检测，合并富含长春碱流份；
(3)重结晶：将生物碱流份于30～50℃减压浓缩至干，用1～5倍体积低级脂肪醇溶解，然后于-20～-10℃放置结晶，过滤，干燥后得到高纯度的长春碱类生物碱。
2、根据权利要求1所述的长春碱类生物碱的分离纯化方法，其特征在于步骤(1)所述长春碱类生物碱为长春碱、长春新碱、长春地辛或长春瑞滨。
3、根据权利要求1所述的长春碱类生物碱的分离纯化方法，其特征在于步骤(1)所述氧化铝柱的固定相所用的填料为中性氧化铝，粒度为100～200目，生物碱粗品与氧化铝的配比为质量比1∶10～1∶40，其流动相所用溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷。
4、根据权利要求1所述的长春碱类生物碱的分离纯化方法，其特征在于步骤(2)所述分离生物碱与硅胶的质量比为1∶20～1∶60，流动相所用溶剂为二氯甲烷-乙醇或三氯甲烷-甲醇。
5、根据权利要求1所述的长春碱类生物碱的分离纯化方法，其特征在于步骤(2)高效液相色谱分离是将预处理制品先用1～2倍二氯甲烷或三氯甲烷溶解，过滤后进样，将流动相加至色谱柱中进行洗脱，控制流速40～50ml/min，柱压保持在80～100bar，通过检测器跟踪分离情况，薄层层析检测，收集富含生物碱流份。
6、根据权利要求1所述的长春碱类生物碱的分离纯化方法，其特征在于步骤(3)中，所述低级脂肪醇为甲醇、乙醇、丙醇及其混合溶液。
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