CN101633623A - 桑叶γ-氨基丁酸的提取方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桑叶γ－氨基丁酸的提取方法及其应用。本发明利用桑叶为原料，经过干燥桑叶、粉碎、水浸提和超声波-微波协同萃取制得粗提液，粗提液去除部分杂蛋白和多糖类物质后再经三级分离纯化制得高纯度γ－氨基丁酸白色结晶体。本发明提供了所述桑叶γ－氨基丁酸有促进动物生长发育、增强抗疲劳能力的活性功能。本发明方法简单，工艺条件成熟，适合工业化生产，为进一步开发桑叶在非绢丝产业上的新用途提供了技术基础，提出将桑叶GABA应用于医药、保健食品、畜牧业等领域，使之成为延伸与发展丝绸之路的新亮点。

Description

桑叶γ-氨基丁酸的提取方法及其应用

技术领域

本发明属于化学技术领域，具体涉及桑叶生物活性物质γ-氨基丁酸的的提取方法与应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(GABA)是一种功能性的非蛋白质氨基酸。自Stewatd等(1949)首次在土豆茎块中发现之后，Roberts和Udenfriend在1950年也分别在哺乳动物大脑中发现了GABA的存在，随后的研究表明，GABA分布广泛，在动物、植物和微生物中均有存在，是哺乳动物神经中枢的一种抑制性递质，具有重要的生理功能，有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、营养神经细胞、健肝利肾等多种功效。临床医学的研究认为，GABA对改善动物的生理代谢有着重要的活性功能，能有效改善脑血流通，增加氧的供给，促进脑的代谢功能和提高生物机体的免疫能力，且具有抑制抗利尿荷尔蒙激素的分泌，扩张血管，降低血压，防止动脉硬化的作用，在神经系统的发育过程中具有营养作用，是一种神经营养因子，应用前景广阔。随着对GABA生理功能的深入了解，它被作为一种新型的功能性因子越来越引起医药、食品、化工、农业等行业的关注，成为开发研究的热点。

自古以来，作为药食同源的桑叶，它除用作养蚕之外，早被人们用于治疗疾病和作为保健品的药膳用材料，如具有清热解毒功能的夏桑菊中药制剂，其主成分之一就是桑叶。桑树在我国大部分地区可以种植，尤其是广东广西，全年生长时间长，有栽培容易成本低的资源优势，全国现有桑田约75万公顷，高产的桑田每公顷产量约45～50吨，故对桑叶GABA进行研究并加以开发利用，这不仅挖掘、发展一种新的GABA生物新材料，而且对我国桑叶在非绢丝产业上的利用是一种创新，将有十分重要的科学价值和广阔的市场前景。

申请号为200410089069.2的中国专利公开了一种从桑叶中提取γ-氨基丁酸化合物的方法。以鲜桑叶为原料，通过烘前处理、真空烘燥、浸泡与浓缩、树脂分离与富集四大工序，得到含有γ-氨基丁酸化合物的桑叶提取物。该技术需要对桑叶进行费时耗能的烘前处理步骤，提取过程也比较繁琐，浸泡需要加热，容易对γ-氨基丁酸造成破坏，能耗高、产率低，而且得到的γ-氨基丁酸是一种混和物，纯度只能达到70％左右，不适合作为食品的添加剂或医药卫生使用的药物原料，不利于大规模应用生产。

如何改进从桑叶中提取γ-氨基丁酸化合物的方法和提取条件，获得更高纯度的γ-氨基丁酸并研究其活性，对桑叶γ-氨基丁酸的开发应用十分重要。

发明内容

本发明的目的是克服桑叶γ-氨基丁酸提取工艺的不足，提供一种简单、高效和得到高纯度产品的桑叶γ-氨基丁酸的提取方法。

本发明还有一个目的是提供所述γ-氨基丁酸的应用。

本发明目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种桑叶γ-氨基丁酸的提取方法，包括以下步骤：

(1)桑叶干燥后进行粉碎；

(2)取干桑叶粉加水浸泡，超声波-微波协同萃取，收集萃取上清液，旋转蒸发浓缩制得γ-氨基丁酸粗提液；

(3)γ-氨基丁酸粗提液经无水乙醇沉淀去除部分杂蛋白和多糖类物质，再经三级分离纯化制得γ-氨基丁酸白色结晶体。

步骤(1)所述桑叶干燥是采摘桑叶叶片，包括桑叶嫩叶或成熟叶，用清水冲洗干净，晾干，置于烘箱中在83～87℃烘28～32min后降温至63～67℃烘4～4.5h，干燥后的样品进行粉碎，过40目筛，装袋密封后低温(5～0℃)保存备用。

步骤(2)所述加水浸泡是取干桑叶粉加水浸泡，按照桑叶粉重量克数(g)∶水体积毫升数(mL)为1∶30～1∶35的比例加水，浸泡13～17min；所述萃取是将浸泡液置于微波144W、超声波50W的条件下进行常规超声波-微波协同萃取，萃取时间为160～170秒，萃取液通过离心去沉淀，收集上清液，按照常规方法旋转蒸发浓缩。

步骤(3)包括以下步骤：

A用无水乙醇沉淀法去除部分杂蛋白和多糖类物质；

B用大孔树脂S-8进行一级分离纯化；

C用葡聚糖凝胶G-10进行二级分离纯化；

D用732磺酸型阳离子树脂进行三级分离纯化；

E将经过三级分离纯化后的桑叶γ-氨基丁酸产物经旋转蒸发和冷冻干燥进行浓缩，获得结晶。

其中：

步骤A：沉淀法去除部分杂蛋白和多糖类物质

取粗提液，按体积比1∶2倍量加入无水乙醇，过夜，在3000r/min离心10min，弃沉淀，旋转蒸发浓缩；

步骤B：大孔树脂S-8分离及除色素

树脂湿法装柱(2.5×70cm)，充分平衡后，取经醇沉淀法分离的提取液，调pH值为5，上样，流速控制2mL/min，进行分离及除色素处理，收集含GABA的洗脱液，浓缩；

步骤C：葡聚糖凝胶G-10分离纯化

将经过去除色素处理后的浓缩液上柱，蒸馏水洗脱，流速3mL/min，自动收集器收集洗脱液，Berthelot法检测或用茚三酮试纸检测，收集含GABA的洗脱液，进行旋转蒸发，浓缩；

步骤D：阳离子树脂分离纯化

用732磺酸型阳离子树脂作进一步的分离纯化：将经过G-10分离的浓缩液调pH值为3，上柱，流速控制2mL/min，吸附完毕后用蒸馏水洗至pH值为6，然后用0.25mol/L氨水进行洗脱，洗脱过程中不断用茚三酮丙酮试纸检测pH值变化，当茚三酮反应呈蓝色，pH值为6时，收集流出液，直至茚三酮蓝色反应消失为止(也可用硅胶薄板层析进行检测)，合并流出液，进行浓缩，-20℃冷冻干燥。

经过上述分离纯化后，获得高纯度的GABA晶体。

样品的测定：

将按照本发明方法制得的桑叶GABA晶体，送中国广州分析测试中心进行结构和纯度检测。经中国广州分析测试中心检定，制备得到的桑叶GABA晶体，结构与γ-氨基丁酸相符，经高效液相色谱法检测其纯度为90.3％。

本发明同时提供了所述桑叶γ-氨基丁酸在制备促进动物生长发育和/或增强抗疲劳能力药物或食品方面的应用。

本发明的有益效果是：

(1)本发明利用桑叶为原料，利用简单易行的生物化学和生物分子筛的技术方法，从桑叶中分离制备出高纯度的γ-氨基丁酸白色结晶体，并进行了活性研究，分析了桑叶GABA的生物活性和作用功能，证明了桑叶含有丰富的GABA，具有容易提取，生产成本较低的资源优势，为进一步开发桑叶在非绢丝产业上的新用途提供了相应的新技术。并提出了将桑叶GABA应用于医药、保健食品、畜牧业等领域的新思路，使之成为延伸与发展丝绸之路的新亮点。

(2)本发明不仅从桑叶中提取得到了γ-氨基丁酸，而且成功制备出高纯度的白色结晶的桑叶γ-氨基丁酸，通过动物试验证明了具有促进生长发育、增强抗疲劳的功能，且证实其无不良的副作用，是一种新型的、源自桑叶具有活性功能的天然新原料，在医药、食品、化工、农业等行业有广泛的应用前景。

(3)本发明从桑叶中提取γ-氨基丁酸的方法简单，工艺条件成熟，适合工业化生产的要求，容易应用推广。

附图说明

图1本发明γ-氨基丁酸提取工艺流程图

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明。

本发明γ-氨基丁酸提取工艺流程图见附图1所示。

本发明使用的实验试剂及设备：

无水甲醇，蒸馏水，无水乙醇，盐酸，NaOH，氨水等均为国产分析纯；

S-8树脂，南开大学化工厂；

732树脂，广州名竣化工有限公司；

葡聚糖凝胶G-10，美国波仕特(amresco)公司；

CW-2000型超声-微波协同萃取仪，上海新拓微波溶样测试技术有限公司；

自动收集器：BS-100A上海精科实业有限公司；

旋转蒸发器：RE-52A上海亚荣生化仪器厂；

HL-2恒流泵，上海精科实业有限公司；

UV-1700紫外分光光度计：岛津仪器(苏州)有限公司；

普通层析柱，2.5×70cm，上海华美实验仪器厂；

高效液相色谱仪(1100)：美国安捷伦公司。

实施例1

γ-氨基丁酸的提取制备

1、具体操作步骤如下：

(1)桑叶干燥后进行粉碎；

采摘桑品种抗青10号的成熟叶片，采后用清水冲洗去掉附着在桑叶表面的灰尘，晾干，置烘箱中用85℃烘30min，然后降温至65℃烘4.2h。

干燥后的样品进行粉碎，装袋密封后低温(5～0℃)保存备用。

(2)制备γ-氨基丁酸的粗提液

按照按照桑叶粉重量(g)∶水体积(mL)为1∶30的比例往干桑叶粉中加水，浸泡15min，然后在微波144W、超声波50W的条件下进行超声波-微波协同萃取，时间160s，萃取液通过离心去沉淀，收集上清液，旋转蒸发浓缩。

(3)γ-氨基丁酸的分离纯化

A：沉淀法去除部分杂蛋白和多糖类物质

按粗提液∶无水乙醇的体积比为1∶2倍量加入无水乙醇，过夜，然后3000r/min离心10min，弃沉淀，旋转蒸发浓缩。

B：大孔树脂S-8分离及除色素

树脂湿法装柱(2.5×70cm)，充分平衡后，取经醇沉淀法分离的提取液，调pH为5，上样，流速控制2mL/min，进行分离及除色素处理，收集溶液，浓缩。

C：葡聚糖凝胶G-10分离纯化

将经过去除色素处理后的浓缩液上柱，蒸馏水洗脱，流速3mL/min，自动收集器收集洗脱液，Berthelot法检测或用茚三酮试纸检测，收集含GABA的滤液，进行旋转蒸发，浓缩。

D：阳离子树脂分离纯化

用732磺酸型阳离子树脂作进一步的分离纯化。

将经过G-10分离的浓缩样本液调pH为3，上柱，流速控制2mL/min，吸附完毕后用蒸馏水洗至pH 6，然后用0.25mol/L氨水进行洗脱，洗脱过程中不断用茚三酮丙酮试纸检测pH变化，当茚三酮反应呈蓝色，pH为6时，收集流出液，直至茚三酮蓝色反应消失为止(也可用硅胶薄板层析进行检测)，合并流出液，进行浓缩，冷冻干燥。

经过上述分离纯化后，获得高纯度的GABA晶体。

实施例2

γ-氨基丁酸的提取制备

(1)桑叶干燥后进行粉碎；

采摘桑品种抗青10号的成熟叶片，采后用清水冲洗去掉附着在桑叶表面的灰尘，晾干，置烘箱中用83℃烘32min，然后降温至67℃烘4h。

干燥后的样品进行粉碎，装袋密封后低温(5～0℃)保存备用。

(2)制备γ-氨基丁酸的粗提液

按照按照桑叶粉重量(g)∶水体积(mL)为1∶35的比例往干桑叶粉中加水，浸泡13min，然后在微波144W、超声波50W的条件下进行超声波-微波协同萃取，时间170s，萃取液通过离心去沉淀，收集上清液，旋转蒸发浓缩。

(3)γ-氨基丁酸的分离纯化

A：沉淀法去除部分杂蛋白和多糖类物质

按粗提液∶无水乙醇的体积比为1∶2倍量加入无水乙醇，过夜，然后3000r/min离心10min，弃沉淀，旋转蒸发浓缩。

B：大孔树脂S-8分离及除色素

树脂湿法装柱(2.5×70cm)，充分平衡后，取经醇沉淀法分离的提取液，调pH为5，上样，流速控制2mL/min，进行分离及除色素处理，收集溶液，浓缩。

C：葡聚糖凝胶G-10分离纯化

将经过去除色素处理后的浓缩液上柱，蒸馏水洗脱，流速3mL/min，自动收集器收集洗脱液，Berthelot法检测或用茚三酮试纸检测，收集含GABA的滤液，进行旋转蒸发，浓缩。

D：阳离子树脂分离纯化

用732磺酸型阳离子树脂作进一步的分离纯化。将经过G-10分离的浓缩样本液调pH为3，上柱，流速控制2mL/min，吸附完毕后用蒸馏水洗至pH 6，然后用0.25mol/L氨水进行洗脱，洗脱过程中不断用茚三酮丙酮试纸检测pH变化，当茚三酮反应呈蓝色，pH为6时，收集流出液，直至茚三酮蓝色反应消失为止(也可用硅胶薄板层析进行检测)，合并流出液，进行浓缩，冷冻干燥。

实施例3γ-氨基丁酸的提取制备

(1)桑叶干燥后进行粉碎；

采摘桑品种抗青10号的成熟叶片，采后用清水冲洗去掉附着在桑叶表面的灰尘，晾干，置烘箱中用87℃烘28min，然后降温至63℃烘4.5h。干燥后的样品进行粉碎，装袋密封后低温(5～0℃)保存备用。

(2)制备γ-氨基丁酸的粗提液

按照按照桑叶粉重量(g)∶水体积(mL)为1∶32的比例往干桑叶粉中加水，浸泡17min，然后在微波144W、超声波50W的条件下进行超声波-微波协同萃取，时间165s，萃取液通过离心去沉淀，收集上清液，旋转蒸发浓缩。

(3)γ-氨基丁酸的分离纯化

A：沉淀法去除部分杂蛋白和多糖类物质

按粗提液∶无水乙醇的体积比为1∶2倍量加入无水乙醇，过夜，然后3000r/min离心10min，弃沉淀，旋转蒸发浓缩。

B：大孔树脂S-8分离及除色素

树脂湿法装柱(2.5×70cm)，充分平衡后，取经醇沉淀法分离的提取液，调pH为5，上样，流速控制2mL/min，进行分离及除色素处理，收集溶液，浓缩。

C：葡聚糖凝胶G-10分离纯化

将经过去除色素处理后的浓缩液上柱，蒸馏水洗脱，流速3mL/min，自动收集器收集洗脱液，Berthelot法检测或用茚三酮试纸检测，收集含GABA的滤液，进行旋转蒸发，浓缩。

D：阳离子树脂分离纯化

用732磺酸型阳离子树脂作进一步的分离纯化。将经过G-10分离的浓缩样本液调pH为3，上柱，流速控制2mL/min，吸附完毕后用蒸馏水洗至pH 6，然后用0.25mol/L氨水进行洗脱，洗脱过程中不断用茚三酮丙酮试纸检测pH变化，当茚三酮反应呈蓝色，pH为6时，收集流出液，直至茚三酮蓝色反应消失为止(也可用硅胶薄板层析进行检测)，合并流出液，进行浓缩，冷冻干燥。

实施例4γ-氨基丁酸的纯度鉴定

将实施例1～3制备的桑叶GABA晶体，送中国广州分析测试中心进行结构和纯度检测。

仪器：Agilent LC1200，G1362A RID检测器，色谱柱：HypersilODS分析柱(2.1×200mm)，5-Micro(美国)。

色谱条件：色谱柱：Hypersil ODS分析柱。流动相A液：取三水醋酸钠1.20g、三乙胺100μL、醋酸1-2滴和四氢呋喃1.8mL，定容至500mL；流动相B液：取三水醋酸钠1.35g、乙腈200mL和甲醇200mL，用无水醋酸调pH至7.30。流动相均以0.45μm滤膜过滤，超声脱气后使用。在0～20min内，由100％A变化到100％B，继续用B液洗脱5min。然后以B相洗脱5min，A相平衡5min。流速0.450mL/min。柱温38℃，激发波长340nm、发射波长450nm。进样量：20μL。

标准曲线：精量取配制好的1.0mg/mL γ-氨基丁酸标准液，配制成0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.50、1.0mg/mL的系列标准液，按照样品衍生步骤衍生并用HPLC测定，以峰面积A对浓度C(mg/mL)绘制标准曲线，回归方程为：A＝8083.6X-15.7，相关系数为r＝0.9999(n＝5)，最小检测浓度为0.0mg/mL。

精密度试验：精确吸取样品的超滤液3份，按上述衍生法处理测定，γ-氨基丁酸测定结果的相对标准偏差小于1.1％。

回收率试验：精确称取γ-氨基丁酸标准品，加入样品中，按样品制备方法处理后，进行HPLC测定，其平均回收率为99.7％。

经中国广州分析测试中心检定，制备得到的桑叶GABA晶体，结构与γ-氨基丁酸相符。检测报告编号是BW20082458，出具的检测结果是：送检样品经超导核磁共振仪测1HNMR，13CNMR，DEPT和红外光谱，经谱图分析，其结构与γ-氨基丁酸相符。经高效液相色谱法检测其纯度为90.3％。

实施例5本发明桑叶γ-氨基丁酸的生物活性实验

实验方法：将本发明制备得到的桑叶GABA用灌胃法处理NTH系雄性小鼠(NIH系雄性小鼠和喂养饲料购自南方医科大学)，自由摄食和饮水。用桑叶γ-氨基丁酸灌胃处理前，先进行适应性喂养7天，然后开始灌胃处理，受试小鼠设低剂量组、中剂量组、高剂量组和对照组，每组6只，设2个重复。每天的GABA灌胃量分别为0.15g/kg、0.3g/kg、0.9g/kg(GABA/小鼠体重，为人体推荐用量的5、10、30倍)，连续灌胃4周。每天记录小鼠的生长发育状况，称量体重，检测相关指标，进行差异性的比较分析。

1.对小鼠生长发育的影响

用桑叶GABA采取灌胃法处理NIH系雄性小鼠4周后，称量体重，比较各剂量对小鼠生长发育的影响，结果见表1。

表1GABA对小鼠发育体重增长的影响

注：体重增加率＝初始体重/结束体重；表中小鼠体重为平均值，n＝12

实验结果表明，从灌胃处理开始到结束经过4周后，小鼠的体重增长率，对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的增重比率分别为：26.1％、28.4％、26.9％、26.6％，低剂量试验组比对照组的体重增加率提高了2.3个百分点，说明本发明桑叶γ-氨基丁酸对小鼠生长发育有促进作用。比较其差异水平，经t检验，各剂量组与空白对照组之间的体重差异不显著(p＞0.05)。从不良影响的角度去分析，桑叶GABA对小鼠发育体重的增长无不良影响。

2.增强抗疲劳能力的效果实验

用桑叶GABA采取灌胃法处理NIH系雄性小鼠4周后，通过负重游泳，观察小鼠在水中游泳时间的长短，以游泳时间的长短来衡量其抗疲劳的能力，结果见表2。

表2GABA灌胃法处理小鼠4周后负重游泳的经过时间

注：游泳经过时间为小鼠从放下水至体力衰竭下沉时；*：表示差异显著(p＜0.05，n＝6)；**：表示差异极显著(p＜0.01，n＝6)

从表2的结果可以明显看到，经用桑叶GABA灌胃法处理的NIH系雄性小鼠，负重游泳经过的时间比对照组长，低剂量组、中剂量组、高剂量组分别比对照组提高53.92％、169.35％和111.47％。经t检验，低剂量组与对照组相比，差异显著；中、高剂量组与对照组相比，差异极显著。说明桑叶GABA具有增强抗疲劳的显著效果。

3.对发育生理影响的检验实验

为评价桑叶GABA的生物安全性，解剖用桑叶GABA灌胃法处理4周后的NIH系雄性小鼠，选择了重要的组织器官进行生理生化的检测分析。

(1)小鼠脏体组织器官比值的变化

比较处理组与对照组的脏体发育情况，调查结果如表3所示。

表3处理组与对照组小鼠的脏体组织与体重的比值

注：对照组1为没有经过负重游泳处理；对照组2和各处理组均经过负重游泳处理；*：表示差异显著(p＜0.05，n＝6)。

在脏体组织器官/体重比方面，高剂量处理组的NIH系雄性小鼠的肝脏/体重比，比对照组重，差异达到显著，表明高剂量的GABA喂养，会引起小鼠肝脏的增重增大。对心脏、脾脏和肾脏的影响，从脏体组织器官比值的变化来看，则差异不明显，认为无不良的影响。

(2)小鼠血液中乳酸、尿素氮和肝糖原的变化

为分析桑叶GABA对小鼠生理代谢的影响，检测了处理组和对照小鼠血液中的乳酸、尿素氮和肝糖原的含量变化，结果如表4所示。

表4处理组与对照组小鼠血乳酸、血尿素氮、肝糖原的含量

注：对照组1为没有经过负重游泳处理；对照组2和各处理组均经过负重游泳处理。差异性比较时，对照组1与对照组2作比较；处理组则与对照组2作比较。*：表示差异显著(p＜0.05，)；**：表示表示差异极显著(p＜0.01)

从表中结果可以看到，同是对照组的小鼠，游泳处理与不游泳处理，小鼠血液中的乳酸、尿素氮和肝糖原会发生很大的变化，小鼠经过游泳处理后，血尿素氮、血乳酸水平升高，肝糖原含量显著降低，说明游泳时，小鼠会改变体内的生理生化代谢，从而获取能量，支持其运动。

比较处理组与对照组2的差异变化，小鼠的血乳酸含量，处理组的显著低于游泳对照组。血尿素氮，低、中剂量处理组极显著低于游泳对照组，高剂量处理组也低于游泳对照组。肝糖原含量是处理组高于游泳对照组，尤其是低、中剂量处理组极显著高于游泳对照组。由此表明，小鼠经过桑叶GABA喂养后，在发生剧烈运动(放在水中游泳至力衰竭下沉)时，其血乳酸、血尿素氮的升高比对照组低，而肝糖原的下降比对照组少，这表明桑叶GABA有增强小鼠抗疲劳的耐受能力的作用。

Claims (9)

1、一种桑叶γ-氨基丁酸的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)桑叶干燥后进行粉碎；

(2)取干桑叶粉加水浸泡，超声波-微波协同萃取，收集萃取上清液，旋转蒸发浓缩制得γ-氨基丁酸粗提液；

(3)γ-氨基丁酸粗提液经无水乙醇沉淀去除部分杂蛋白和多糖类物质，再经三级分离纯化制得γ-氨基丁酸白色结晶体。

2、根据权利要求1所述桑叶γ-氨基丁酸的提取方法，其特征在于步骤(1)所述桑叶干燥是采摘桑叶叶片，洗净晾干后烘干粉碎；所述烘干是置于烘箱，在83～87℃烘28～32 min后降温至63～67℃烘4～4.5 h。

3、根据权利要求1所述桑叶γ-氨基丁酸的提取方法，其特征在于步骤(2)所述桑叶粉与水的料液比按照桑叶粉重量克数：水体积毫升数为1∶30～1∶35；浸泡时间为13～17 min；所述微波为144W、超声波为50W；萃取时间为160～170秒。

4、根据权利要求1所述桑叶γ-氨基丁酸的提取方法，其特征在于步骤(3)包括以下步骤：

A用无水乙醇沉淀法去除部分杂蛋白和多糖类物质；

B用大孔树脂S-8进行一级分离纯化；

C用葡聚糖凝胶G-10进行二级分离纯化；

D用732磺酸型阳离子树脂进行三级分离纯化；

E将经过三级分离纯化后的桑叶γ-氨基丁酸产物经旋转蒸发、冷冻干燥，获得结晶。

5、根据权利要求4所述桑叶γ-氨基丁酸的提取方法，其特征在于步骤A是取粗提液，按体积比1∶2倍量加入无水乙醇，过夜，在3000 r/min离心10 min，弃沉淀，旋转蒸发浓缩。

6、根据权利要求4所述桑叶γ-氨基丁酸的提取方法，其特征在于步骤B是树脂湿法装柱，充分平衡后，取经醇沉淀法分离的提取液，调pH值为5，上样，流速控制2 mL/min，收集洗脱液得浓缩液。

7、根据权利要求4所述桑叶γ-氨基丁酸的提取方法，其特征在于步骤C是将浓缩液上柱，蒸馏水洗脱，流速3 mL/min，收集洗脱液，旋转蒸发得浓缩液。

8、根据权利要求4所述桑叶γ-氨基丁酸的提取方法，其特征在于步骤D是将步骤C制备的浓缩液调pH值为3，上柱，流速控制2mL/min，吸附完毕后用蒸馏水洗至pH值为6，用0.25 mol/L氨水进行洗脱，洗脱过程中不断用茚三酮丙酮试纸检测pH变化，当茚三酮反应呈蓝色，pH值为6时，收集流出液，直至茚三酮蓝色反应消失为止，合并流出液，进行浓缩，冷冻干燥。

9、一种权利要求1所述桑叶γ-氨基丁酸的应用，其特征在于应用于制备促进动物生长发育或/和增强抗疲劳能力方面药物或食品。

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