CN101632776B - 一种治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备工艺，该工艺将蚂蚁和千年健采用CO₂超临界萃取后，所得萃取物采用β-环糊精制备成萃取物的包合物，将重楼、黄芪、三七加入浓度为70-90％的乙醇提取，醇提后所得药渣与老鹳草、蚂蚁和千年健CO₂超临界萃取的萃余物水提，将重楼、黄芪、三七醇提液浓缩成浸膏后干燥、粉碎成醇提物干粉；水提液浓缩成浸膏后干燥，粉碎成水提物干粉；将蚂蚁千年健混合萃取物的包合物、水提物干粉、醇提取物干粉混合后制成所需制剂。本发明制备的中药组合物是治疗类风湿性关节炎的有效制剂，该方法制备的制剂在抗炎、抗凝血、镇痛方面均优于原工艺制剂，显著提高了产品的科技含量和核心竞争力。

Description

一种治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备工艺

技术领域

本发明属于中药制药领域，具体涉及一种治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备工艺。

背景技术

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的以慢性多关节炎症病变为主要表现的全身性免疫性疾病，该病的致残率高，已成为世界上公认的顽疾之一，由于其发病机制尚未完全明确，临床上还缺乏特异性治疗措施。近年来，中医药在治疗RA中取得了很大的进展，前景较为广阔。

玄七通痹胶囊处方由蚂蚁、黄芪、重楼、三七、千年健、老鹳草六味药材组成，是治疗类风湿性关节炎的有效制剂。该方自投产以来，因其疗效确切，无不良反应，受到了广大患者的普遍欢迎。但是有患者反映该药短时间服用止痛作用不明显，其远期疗效要优于近期疗效。

蚂蚁是蚁科Formicidae的俗称，又名虫义、玄驹、蚍蜉、马蚁，在我国有食用及药用的悠久的历史，中医学认为蚂蚁具有补肾、除湿、益气的作用。蚂蚁的挥发油中含有丰富的不饱和脂肪酸、萜类等物质，可以影响免疫系统的功能，并且有调整吞噬作用、促进细胞因子的产生和白细胞的迁移的作用，也干预巨噬细胞的抗体表达。

千年健是天南星科千年健属植物千年健Homalomena occul ta(Lour.)Schott的干燥根茎，该药材主要用于祛风除湿、舒筋活络、补肝肾壮筋骨、消肿止痛排脓及和胃止痛等，其挥发油中主要含有芳樟醇等倍半萜烯、萜醇类物质，具有祛风除湿、舒筋活络、补肝肾壮筋骨等功效。

黄芪最早为豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.和蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根，是健脾益气、固表利尿、脱毒排脓、敛疮生肌的要药，其主要活性成分是黄芪皂苷和多糖，黄芪皂苷具有消炎、降血压、抗心肌缺血、中枢镇痛、镇静的作用；黄芪多糖具有增强机体免疫力、提高人体抗应激反应能力的作用。

重楼为百合科云南重楼Paris poly-phylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.和七叶一枝花Paris poly-phylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根茎。具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效，其主要活性成分为薯蓣皂苷元，具有抗肿瘤、消炎、镇静、镇痛、止血等作用。

三七为五加科植物Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根及根茎，具有镇痛、抗炎、滋补强壮等功效，其主要活性成分为三七皂苷、三七素等，为贵重药材。生品重于散瘀止血，熟品重于补血。

老鹳草为牦牛儿科植物牦牛儿苗Erodium step hanianum Willd、老鹳草Geranium wilfordii Maxim.或野老鹳草Geranium carolinanum L.的干燥地上部分，具有祛风除湿、通经络、清热解毒之功效，其主要活性成分为鞣质、黄酮类化合物。鞣质为一种具有沉淀蛋白质特性的水溶性多元酚类化合物，不仅具有常见的收敛、抗菌消炎、止血、驱虫、止泻、抗多种病原虫感染性疾病的作用，还具有抗肿瘤、抗突变、抗脂质过氧化、抗变态反应，抑制胃蛋白酶，预防应激性胃肠损伤，降压、降脂，改善肝肾功能等功用，并对中枢神经系统有镇静作用。

玄七通痹胶囊原配方为蚂蚁8-10重量份、黄芪2-3重量份、三七1-2重量份、千年健0.8-1.2重量份、老鹳草0.8-1.2重量份、重楼1-2重量份，按配方取黄芪粉碎成细粉，取蚂蚁、三七、重楼、老鹳草、千年健加5-7倍量的20-80％乙醇浸泡1-3小时，然后微沸回流提取2-4小时，冷却后放出提取液，再次按3-5倍量加入50-70％乙醇，微沸回流提取2-3小时，冷却后放出提取液，重复提取2-3次，合并提取液，静置得上清液；将上清液浓缩至40-50℃时相对密度为1.20-1.25，得稠膏；加入备用的黄芪粉，与所得稠膏混合均匀，于60-65℃干燥，得干浸膏；粉碎，过筛，加适量辅料，混匀，制成胶囊剂。

原工艺中将黄芪直接打粉入药，其微生物限度难以控制，服用量大；另外，其它几味药材则用50-70％乙醇混合提取，其出发点是兼顾其脂溶性和水溶性成分充分的提取，但是实际上有效成分并未充分提取，该药短时间服用止痛作用不明显，因此其药效和生物利用度有待进一步提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗类风湿性关节炎的中药组合的制备工艺。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种治疗类风湿性关节炎的中药组合的制备工艺，选用为蚂蚁8-10重量份、黄芪2-3重量份、三七1-2重量份、千年健0.8-1.2重量份、老鹳草0.8-1.2重量份、重楼1-2重量份为原料药，该工艺包括以下步骤：

a、CO₂超临界萃取：将蚂蚁和千年健粉成粗粉后置于萃取釜中进行CO₂超临界萃取，萃取压力为24-36Mpa，萃取温度为40-60℃，萃取时间为30-90min，收集蚂蚁与千年健混合萃取物；

b、萃取物包合：取蚂蚁与千年健混合萃取物，用质量百分比浓度为10-30％的乙醇溶解，另取蚂蚁与千年健的混合萃取物重量4-8倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量2-4倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加蚂蚁与千年健混合萃取物溶液，碾磨包合20-40分钟，倾出，冷藏静置，滤过，真空干燥，即得混合萃取物的包合物；

c、醇提：将重楼、黄芪、三七用质量百分比浓度为70-90％的乙醇提取；

d、水提：醇提后所得药渣、老鹳草与蚂蚁和千年健CO₂超临界萃取的萃余物进行水提；

e、混合、干燥、粉碎：将上述醇提液浓缩成浸膏后干燥、粉碎成醇提取物干粉，水提液浓缩成浸膏后干燥，粉碎成水提物干粉；将蚂蚁千年健混合萃取物包合物、水提物干粉、醇提取物干粉混合，加适量辅料，常规方法制成所需剂型。

所述的治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备工艺，优选蚂蚁8.5-9.0重量份、黄芪2.0-2.5重量份、三七1.0-1.5重量份、千年健1重量份、老鹳草1重量份、重楼1.5-2.0重量份为原料药。

上述工艺具体包括以下步骤：

a、CO₂超临界萃取：将蚂蚁和千年健粉成粗粉后置于萃取釜中进行CO₂超临界萃取，萃取压力为24Mpa，萃取温度为60℃，萃取时间为90min，收集蚂蚁与千年健混合萃取物；

b、萃取物包合：取蚂蚁与千年健混合萃取物，用质量百分比浓度为10％的乙醇溶解，另取蚂蚁与千年健的混合萃取物重量6倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量2倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加蚂蚁与千年健混合萃取物溶液，碾磨包合30分钟，倾出，冷藏静置，滤过，真空干燥，即得混合萃取物的包合物；

c、醇提：将重楼、黄芪、三七用质量百分比浓度为80％的乙醇8倍量提取2次，每次2h；

d、水提：醇提后所得药渣、老鹳草与蚂蚁和千年健CO₂超临界萃取的萃余物采用10倍量水提取2次，每次1h；

e、混合、干燥、粉碎：将上述醇提液浓缩成浸膏后干燥、粉碎成醇提取物干粉，水提液浓缩成浸膏后干燥，粉碎成水提物干粉；将蚂蚁千年健混合萃取物包合物、水提物干粉、醇提取物干粉混合，加适量辅料，常规方法制成所需剂型。

本发明治疗类风湿性关节炎的中药组合物的具体制备工艺流程如图1所示。

本发明的有益效果：通过本发明工艺制备得到的中药组合物，功能主治未发生变化，但镇痛与抗凝血、抗炎效果要明显优于老工艺。这主要是因为发明人在工艺确定之先，借鉴药物物质基础研究的理论，明确药物抗炎、镇痛的有效部位，为最终产品的良好疗效奠定了基础。工艺研究过程中，采用科学的统计学实验方法，结合生产实际，制定合理的评价指标、评分体系，这保证了药效成分最大程度的保留在产品中。最终的药效比较实验证明，本发明工艺制备得到的中药组合物的疗效优于老工艺产品，显著提高产品的科技含量和核心竞争力。

本工艺中针对不同的原料采用不同的制备工艺，使各原料的有效成分充分提取出来，增加了药效，具体体现在以下几个方面：

(一)CO₂超临界萃取工艺研究

1、试验方法

将千年健粉碎成粗粉，称取千年健粉19.16g，蚂蚁170g投入1L萃取釜中，加热萃取釜和解析釜，达到预定温度，送入一定量的CO₂气，调节各釜压力后开始循环萃取，其中解析釜I压力为8.0±0.5MPa，温度为50℃；解析釜II压力为5.0±0.5MPa，温度为37℃。按照正交设计安排进行试验，以蚂蚁千年健油得率为评价指标，考察各因素水平对萃取效果的影响，得出最佳工艺条件。

2、蚂蚁、千年健超临界萃取工艺研究的正交试验设计

通过预试验，发现对蚂蚁千年健萃取物超临界CO₂萃取得率影响较大的因素有萃取压力、萃取温度、萃取时间，以这三个因素为考察对象。选择L₉(3⁴)正交设计表，安排试验。因素水平表见表1。

表1蚂蚁、千年健超临界萃取因素水平表

以得油率为指标，极差分析结果C＞A＞B，即影响因素排列顺序为：萃取时间＞萃取压力＞萃取温度。各因素与水平之间的最佳组合为A₃B₃C₁，确定最佳工艺为：萃取压力为24MPa，萃取温度为60℃，萃取时间为90min。

(二)β-环糊精包合工艺研究

1、实验方法

按照正交实验的安排，取一定量的β-环糊精，加入规定倍量的水研匀，倒入胶体磨中，开动机器，缓慢连续加入挥发油，碾磨一定时间，于40℃真空干燥24小时，粉碎，用无水乙醇洗涤，40℃回风干燥，即得包合物。

2、正交实验设计

影响胶体磨法包合效果的主要因素有：物料比例(A)、加水量(B)、包合时间(C)、醇用量(D)等四个因素，选择采用L₉(3⁴)正交设计表，以包合物收率、包合物油利用率、包合物含油率为评价指标，并采用综合评分法，分析优选最佳工艺条件，因素水平划分及正交实验安排及结果见表2。

表2蚂蚁、千年健超临界萃取物包合正交实验因素水平表

包合物含油率＝包合物含油量/包合物重×100％  油利用率＝包合物含油量/挥发油投入量×100％

3、包合物中蚂蚁千年健油的含量测定方法

经过预实验得知，采用水蒸汽蒸馏法，蚂蚁千年健油空白回收率仅为40％，不适合用来计算蚂蚁千年健油的利用率。而采用有机溶剂提取法，由于不能直接得到油，且蚂蚁千年健油无对照品，故采用紫外分光光度法，以蚂蚁千年健油为对照，评价包合效果。

(1)UV检测波长的测定

精密称取包合物0.1g，加25mL无水乙醇超声30min，过滤，取续滤液，于紫外-可见分光光度计下扫描(190～600nm)，与未被包合的蚂蚁千年健油的扫描谱图进行比较，可见包合前后蚂蚁千年健油在217nm与282nm处均有最大吸收，确定以282nm附近的最大吸收峰强度评价包合效果。

(2)脱包溶剂的选择

精密称取包合物2g，分别加入25mL无水乙醇、二氯甲烷、醋酸乙酯、石油醚(60～90℃)，称重，超声30min，冷却后再称重，用相应的溶剂补足减失的重量，过滤，取续滤液于紫外-可见分光光度计下扫描(190～600nm)，观察吸收峰的强弱，由图谱可知，无水乙醇的脱包能力最强，故确定脱包溶剂为无水乙醇。

(3)标准曲线的制备

精密称取相对密度为0.94的蚂蚁千年健油1g，以无水乙醇溶解并定容至100mL，配成10mg/mL的储备液，分别吸取储备液5mL、4mL、3mL、2mL、1mL以无水乙醇定容至10mL，在282nm处测定吸收度，以蚂蚁千年健油的浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程：Y＝0.220C+0.020，R²＝0.999，表明蚂蚁千年健油浓度在1mg/mL～5mg/mL范围内线性关系良好，结果见图2。

4、蚂蚁、千年健油包合结果及分析

包合物得率、含油率和油利用率为指标，分别选取最高者作为100分，其余按公式计算：得分y_i′＝100-最高值+y_i，然后对三个指标赋与不同的权重。结合生产实际要求分别赋予包合物得率权重系数为0.2，含油率及油利用率权重系数分别为0.4。计算结果表明：极差分析结果D＞A＞B＞C，即影响因素排列顺序为：溶媒含醇量＞物料比例＞加水倍量＞包合时间。各因素与水平之间的最佳组合为A₂B₁C₂D₁，以C项作为误差项，进一步进行方差分析，各因素对实验结果的影响均不显著。包合最佳因素组合为物料比例1∶6，加入2倍量的水，包合30min，溶媒含醇量为10％。

5、包合物的表征

(1)紫外扫描法在水中加入蚂蚁千年健油，超声30min，配制成蚂蚁千年健油饱和溶液；按照蚂蚁千年健油与β-环糊精比例1∶6，配制成混合溶液；以相同质量蚂蚁千年健油包合物配制成脱包后溶液；根据所用油量，按比例取β-环糊精配制成溶液。将样品进行紫外扫描，以波长为横轴(200nm～600nm)，吸收度为纵轴，扫描图谱见图3。

(2)差示扫描量热法(DSC)分别对β-环糊精、蚂蚁千年健油β-环糊精包合物、蚂蚁千年健超临界油、β-环糊精与蚂蚁千年健超临界油的物理混合物进行DSC扫描。

结果：蚂蚁千年健油没有吸热峰或放热峰，β-环糊精在113.8℃及223.9℃有两个吸热峰，热焓值分别为-334.1J/g及-6.554J/g，物理混合物在128.3℃及226.1℃有两个吸热峰，热焓值分别为-266.7J/g及-4.0767J/g，包合物在117.6℃及224.3℃有两个吸热峰，其热焓值为-240.7J/g及-2.095J/g，与混合物及β-环糊精相比有所升高且峰向左移，表明经β-环糊精包合后形成了新的物相。

(三)醇提工艺研究

1、正交试验安排与结果

通过预实验确定提取因素水平，采用L₉(3⁴)正交试验安排表，进行正交试验并测定结果，以干膏得率、黄芪甲苷含量、重楼皂苷I含量及三七皂苷R₁含量为指标，以综合评分为评价指标确定最佳工艺。

表3醇提正交实验因素水平表

2、结果分析

以干膏重、黄芪甲苷含量、重楼皂苷I含量、三七皂苷R₁含量为指标，分别选取最高者作为100分，其余按公式计算：得分y_i′＝100-最高值+y_i，然后对三个指标赋与不同的权重。结合生产实际要求分别赋予干膏重、重楼皂苷I、三七皂苷R₁权重系数分别为0.2，黄芪甲甘权重系数为0.4，由极差分析可知，各因素对该指标的影响大小排列为D＞C＞B＞A，均无显著性差异，D因素的水平优劣排列如下：3＞2＞1，其中1和3水平具显著性差异，1和2，2和3水平无显著性差异。C因素的水平优劣排列如下：2＞3＞1，各水平间均无显著性差异。B因素的水平优劣排列如下：2＞3＞1，各水平间均无显著性差异。A因素的水平优劣排列如下：2＞1＞3，各水平间均无显著性差异。以综合评分为指标的工艺为A₂B₂C₂D₃，从生产成本耗时等方面考虑，确定最佳工艺条件为A₂B₂C₃D₂，即：乙醇浓度80％8倍量，提取2次，每次2h。

(四)水提工艺研究

1、正交实验设计与结果

采用L₉(3⁴)正交试验安排表，进行正交试验并测定结果，以所得干膏得率、氨基酸含量(相对于牛磺酸的含量)为指标，以综合评分为评价指标确定最佳工艺。

表4正交试验因素水平表

2、正交实验结果：优化所得的最佳工艺A₂B₁C₂。

3、氨基酸的含量测定

(1)牛磺酸对照品溶液的配制

精密称取牛磺酸对照品12.2g，至于10mL容量瓶中，用水溶解后定容至刻度，摇匀，作为储备液；精密吸取储备液5mL，至于25mL容量瓶中，用水定容至刻度，得0.244mg/mL的牛磺酸对照品溶液，备用。

(2)供试品溶液的制备

精密称取水提干膏粉5g，加入50mL蒸馏水，加热煮沸后，3000r/min离心5min过滤，滤液用蒸馏水定容至100mL，备用。

(3)磷酸盐缓冲液的配制

精密称取磷酸氢二钠4.37g，磷酸二氢钠1.22g，加水溶解，并稀释至100mL容量瓶中，得pH为6.4的磷酸盐缓冲液，备用。

(4)2％茚三酮溶液的配制

精密称取茚三酮1g，放入含有热水的烧杯中，使其溶解后，定量转入50mL的量瓶中，定容至刻度，即得，备用。

(5)UV波长扫描

精密吸取牛磺酸对照品溶液、供试品溶液各2mL，分别加入1mL2％茚三酮溶液和1mL磷酸盐缓冲液，分别放入25mL、50mL容量瓶中，置沸水裕中加热20min，取出迅速冷却至室温后，用水定容至刻度，摇匀，静置15min后，于紫外-可见分光光度计下(190～800nm)进行波长扫描，对照品及样品在401nm、569nm处有最大吸收，空白溶液无影响，确定波长为569nm。

(6)标准曲线的制备

取5个25mL的容量瓶并编号，精密吸取上述牛磺酸对照品溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL于容量瓶中，各加入2％茚三酮溶液1mL，磷酸盐缓冲液1mL，置沸水裕中加热20min，取出迅速冷却至室温后，用水定容至刻度，摇匀，静置15min后，在569nm处测定吸光度A，以吸光度为纵坐标(Y)，以浓度(C)为横坐标，建立标准曲线，得回归方程：Y＝74.98C-0.165，r＝0.983，表明牛磺酸在浓度4.88μg/mL～24.4μg/mL范围内线性关系良好。见图4.

(7)成型工艺研究堆密度的测定堆密度是指单位容积微粉或颗粒的重量。称取一定重量的微粉，装入10mL量筒中，以固定高度落下数次(每次保证试验条件一致)，使松紧适宜，以重量及容积计算其堆密度。

表5微粉堆密度测定结果

根据微粉堆密度的测定结果，我们采用各部分干膏直接打粉后装入0号胶囊方法装样。

4、结论

本实验采用超临界CO₂萃取技术对蚂蚁千年健进行混合萃取，即能提取低沸点的易挥发油，避免破坏具有植物特征的香味成分，萜烯类组分也不易损失，又能提取出动物药中较多的醇、酯、不饱和脂肪酸及热不稳定组分，大大提高了萃取物得率，缩短了提取时间。

采用本工艺制备β-环糊精包合物，物料利用率高。

(五)质量研究

本发明组合物中黄芪为臣药，其中黄芪甲苷为主要活性成分，为更好地控制制剂质量，选用黄芪甲苷为含量测定的指标成分。

1、仪器与试药高效液相色谱仪(日本岛津，带自动进样器)；Hypersil-ODS柱(4.6×250mm，5μm)；LC-Solution色谱工作站；PL-ELS2100蒸发光散射检测器(英国)；黄芪甲苷对照品(0781-9908，中国药品生物制品检定所)；本发明组合物(按实施例1方法制备得到)；乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

含量测定

(1)供试品溶液制备方法的考察

通过查阅文献以及预试验可知，由于中成药成分复杂，虽然采用大孔吸附树脂附集洗脱，但其脂溶性成分等不能完全除去，故本试验主要考察了以下四种供试品制备方法。见表6。

表6考察供试品溶液制备方法表

综合分析，方法2中黄芪甲苷提取不完全，方法1和方法4未经三氯甲烷脱脂，脂溶性成分过多，影响分离度及峰形的美观度，并且方法4中未经D101型大孔吸附树脂处理的样品中杂质较多，容易损害色谱柱，综合以上几点，方法3效果最好。但从图谱上看，水溶性成分仍较多，除杂不完全，故又增大了水及40％乙醇的洗脱用量，达到了满意的效果。

(2)色谱条件的优选

1)对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2mg黄芪甲苷的对照品溶液，即得。

2)供试品溶液的制备精密称取本发明组合物内容物约2g，加甲醇适量冷浸过夜，索式提取4h，提取液回收甲醇至干，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次20mL，合并正丁醇层，用氨试液洗涤两次，每次20mL，正丁醇液蒸干，残渣加10mL水使溶解，用三氯甲烷10mL萃取1次，挥去三氯甲烷，通过D101型大孔吸附树脂柱，用50mL水洗脱，弃去水液，继用150mL40％乙醇洗脱，弃去40％洗脱液，再用80mL70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，蒸干，残渣用甲醇定容至2mL，作为供试品溶液。

3)星点设计通过预试验可知，HPLC-ELSD测定黄芪甲苷含量的主要影响因素有流动相乙腈与水的比例(X₁)、蒸发室温度℃(X₂)及其氮气流速SLM(X₃)，确定其各最大值最小值后，根据星点设计的原理，各因素设置5个水平，用代码值±α、±1、±0来表示，α＝1.732，因素及水平见表7，具体实验方案安排见表8。

表7星点设计因素水平表

表8星点试验安排及效应值

注：实验15～20号为重复实验，故用均值表示

4)数据处理将峰面积、分离度、对称度均标准化为0～1之间的归一值，各指标“归一值”求算几何平均数，得总评“归一值”(OD)。公式如下：OD＝(d₁d₂...d_k)^1/kk为指标数，dmin＝(Ymax-Yi)/(Ymax-Ymin)，dmax＝(Y_i-Ymin)/(Ymax-Ymin)，峰面积、分离度取值越大越好，对称度为|1-对称度|取值越小越好。

5)模型拟合采用design expert 7.1得到回归方程，Y＝-43.28+2.7A-0.16B+22.32C-0.15AB-1.07AC-0.05BC-0.04A²+0.12B²+0.05ABC+0.03A²B+0.016A²C-0.05AB²(R²＝0.9876，R²adj＝0.9662)。方差分析得出，模型方差P＜0.05，说明该模型具有显著性，且B、C、AB、BC、A²、B²、ABC、A²B、A²C、AB²均具有显著性，故本实验以此方程作为分析及预测的模型，未将模型进行进一步简化，固定三个自变量之一为中值，以总评“归一值”为因变量，相对于另二个自变量的效应面三维图见图5～7。

6)药材的含量测定按2005年版《中国药典》方法制备黄芪药材供试品溶液，按上述色谱条件，对3个批号不同来源药材进行测定，每个批号平行制备2份，进样20μl，每份进2针。结果药材的平均含量为1.683mg·g^-1。(表中数值为每份的平均值)。

7)样品的含量测定分别取3个批号的本发明组合物，按上述供试品溶液制备方法进行制备，每个批号平行制备2份，按确定好的色谱条件测定，进样20μl，每份进2针。结果样品的平均含量为344.71μg·g^-1(表中数值为每份的平均值)。

表9样品含量测定结果

8)本发明组合物中黄芪甲苷含量标准设定

根据药材含量计算，样品中黄芪甲苷的平均转移率为61％，《中国药典》2005版一部规定黄芪药材的含量限度为：含黄芪甲苷(C₄₁H₆₈O₁₄)不得少于0.04％，按此数据计算，将原药材的含量限度折算到制剂为110μg·g^-1，考虑生产实际情况将其下浮20％，依照上述操作，设定本品1g含黄芪甲苷(C₄₁H₆₈O₁₄)不得少于0.088mg。

结论：在供试品制备方法考察时，考虑到三氯甲烷的毒性，本试验中我们曾把三氯甲烷换成极性相似而毒性稍弱的二氯甲烷，但脱脂效果不理想，故选择三氯甲烷进行脱脂。

采用星点设计-效应面法优选HPLC-ELSD测定黄芪甲苷的色谱条件，用优选出的色谱条件进行含量测定时，分离度，对称度效果均较好，此法既能较好地保证试验精度又可以分析各因素之间的相互作用，同时试验次数也较少，在模型建立上采用非线性数学模型拟合，复合相关系数较高，预测值更接近真实值。为星点设计-效应面法在优选色谱条件的应用上提供了可行性依据。

(六)药效实验研究

根据临床功能主治：滋补肝肾，活血化瘀，消肿止痛，用于风寒湿痹引起的关节疼痛，肿胀，手足不温，四肢麻木，肩臂腰腿疼痛，研究处方中各味药材的不同提取方法产物的镇痛、抗炎和抗凝血几个方面的作用，验证其与临床主治有关的药效学作用，并与原工艺制剂比较验证新工艺制剂的有效性。

1、实验动物

昆明种小鼠(中国人民解放军第二军医大学实验动物中心，雌雄各半)。

2、试验药物(以下称玄七通痹胶囊)

玄七通痹胶囊(新工艺，按照实施例1方法制备得到)(南京中山制药有限公司，批号：081201；玄七通痹胶囊(老工艺，将蚂蚁687.5g、黄芪187.5g、三七95g、千年健77.5g、老鹳草77.5g、重楼125g，按配方取黄芪粉碎成细粉，按配方取蚂蚁、三七、重楼、老鹳草、千年健加6倍量的60％乙醇浸泡2小时，然后微沸回流提取3小时，冷却后放出提取液，再次按4倍量加入60％乙醇，微沸回流提取3小时，冷却后放出提取液，重复提取3次，合并提取液，静置得上清液；将上清液浓缩至50℃时相对密度为1.20-1.25，得稠膏；加入备用的黄芪粉，与所得稠膏混合均匀，于60-65℃干燥，得干浸膏；粉碎，过筛，加适量辅料，混匀，制成胶囊剂)(南京中山制药有限公司，批号：070501)；各味药材系列提取物(南京中山制药有限公司自制，批号、代号见表3.1)；羧甲基纤维素钠(中国医药集团上海化学试剂公司，批号：F20020928)；角叉菜胶(sigma公司，批号：122k1444)；氯化钠注射液(南京小营制药厂，批号：2004102603)；阿司匹林(南京白敬宇制药有限责任公司，批号：050611)；芬必得(中美天津史克制药有限公司，批号：05040122)；其他试剂为分析纯。

表10各味药材系列提取物

3、动物模型的建立与实验方法

1)动物分组

各药效实验根据受试药物分组，预实验设定为对照组(0.5％CMC-Na)、阳性药组(芬必得、阿司匹林)、受试药物组(以下简称为代号)若干。新工艺玄七通痹胶囊药效验证实验设定根据受试药物分为4组，分别为对照组(0.5％CMC-Na)、阳性药组(阿司匹林)、受试药物组(新老工艺玄七通痹胶囊)。动物所用药物临床等效剂量以mg/kg-mg/m²转换因子换算，结合实际，人、小鼠体重分别以50kg、20g计，按体表面积折算成小鼠等效用量为2.45g/kg，老工艺为1.49g/kg。

2)小鼠醋酸扭体法镇痛试验

取健康昆明小鼠，按体重随机分组，根据玄七通痹胶囊临床生药用量，分别按组给予阳性药(布洛芬，给药量：100mg/kg)、空白(0.5％CMC-Na，给药量为：0.3ml/10g)、各味药材系列提取物、玄七老工艺(给药量为1.49g/kg)、玄七新工艺(给药量为2.45g/kg)，每天给药一次，连续给药12天。末次给药前禁食12小时，然后给药45min后，腹腔注射0.6％醋酸溶液，0.2mL/只，观察小鼠15min内的扭体次数。

3)角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的抑制作用试验

取健康昆明小鼠，按体重随机分组，根据玄七通痹胶囊临床生药用量，分别按组给予阳性药(阿司匹林，给药量200mg/kg)、空白(CMC-Na给药量2.5g/kg)、各味药材系列提取物、玄七老工艺(给药量为1.49g/kg)、玄七新工艺(给药量为2.45g/kg)，每天给药一次，连续给药12天。末次给药前禁食12小时，给药1小时后，在小鼠的右后足皮下注射1％角叉菜胶0.03mL，4h后分别剪下左右足称重，计算肿胀度。然后致炎足充分剪碎，于2mL生理盐水中浸泡12小时，3000r/min离心5min，取上清液以备测定前列腺素2(PGE₂)含量(PGE₂含量以吸光度表示，并换算为单位足重的含量)。肿胀度＝(致炎足重-正常足重)×100％÷正常足重

4)二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用试验

取健康昆明小鼠，按体重随机分组，连续灌胃给药6天，禁食12小时过夜，第7天再给药一次，1小时后，在小鼠右耳的前后两面均匀涂布二甲苯0.05mL，左耳不做任何处理。各组分别于致炎后60分钟脱颈椎处死小鼠，剪下双耳用7mm直径打孔器分别在双耳相同部位打下圆耳片，电子天平称质量。计算肿胀度及肿胀抑制率，比较给药组与对照组差异情况，进行t检验。计算公式为：

肿胀度(mg)＝右耳片质量(mg)-左耳片质量(mg)

肿胀抑制率＝(对照组肿胀度-给药组肿胀度)÷对照组肿胀度×100％。

5)毛细管法测定小鼠凝血时间试验

取健康昆明小鼠，按体重随机分组，根据玄七通痹胶囊临床生药用量，分别按组给予阳性药(阿司匹林，给药量36mg/kg)、空白(0.5％CMC-Na，给药量为：0.3mL/10g)、各味药材系列提取物、玄七老工艺(给药量为1.49g/kg)、玄七新工艺(给药量为2.45g/kg)，每天给药一次，连续给药12天。末次给药前禁食12小时，然后给药后50分钟眼球取血，用毛细管法测量凝血时间。

4、预试验结果及分析

1)各味药材系列提取物的醋酸扭体镇痛试验实验结果

试验结果以15min内扭体反应次数表示，统计学检验采用组间t检验，结果见表11。

表11各味药材系列提取物醋酸扭体镇痛试验实验结果

注：^**：P＜0.01；与对照组比较(t检验)。

实验结果表明，H组小鼠扭体反应数与对照组比较无显著差异(P＞0.05)；其余各组均与对照组比较有极显著差异(P＜0.01)。

2)各味药材系列提取物的角叉菜胶致小鼠足趾肿胀的抑制作用试验结果

试验结果以肿胀度(％)表示，统计学检验采用组间t检验，结果见表12。

表12各味药材系列提取物的角叉菜胶致小鼠足趾肿胀的抑制作用试验结果

注：^*：P＜0.05  ^**：P＜0.01；与对照组比较(t检验)。

试验结果表明，A组、C组、F组的角叉菜胶足趾肿胀的抑制作用与对照组比较有极显著差异(P＜0.01)，D组、G组、H组、I组、J组的角叉菜胶足趾肿胀的抑制作用与对照组比较有显著差异(P＜0.05)，B组和E组的角叉菜胶足趾肿胀的抑制作用与对照组比较无显著差异。

3)各味药材系列提取物的二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用试验

试验结果以肿胀度(％)表示，统计学检验采用组间t检验，结果见表13。

表13各味药材系列提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用试验结果

注：^*：P＜0.05，^**：P＜0.01；与对照组比较(t检验)

结果表明，C组、D组、F组、I组和J组的耳肿胀度与对照组比较有极显著差异(P＜0.01)，A组和G组的耳肿胀度与对照组比较有显著差异(P＜0.05)，B组、E组和H组的耳肿胀度与对照组比较无显著差异(P＞0.05)。

4)各味药材系列提取物的毛细管法测定小鼠凝血时间试验结果

实验结果以凝血时间表示，结果见表14。

表14各味药材系列提取物毛细管法测定小鼠凝血时间试验结果

注：^*：P＜0.05，^**：P＜0.01；与对照组比较(t检验)

结果表明，A组、G组、I组和J组的凝血时间与对照组比较有极显著差异(P＜0.01)，B组和F组的凝血时间与对照组比较有显著差异(P＜0.05)，而其余各组的凝血时间与对照组比较无显著差异(P＞0.05)。

5、新工艺玄七通痹胶囊药效验证实验结果

1)醋酸扭体法小鼠镇痛试验

试验结果以15min内扭体反应次数为指标，统计学采用组间t检验，结果见表15。

表15新工艺玄七通痹胶囊醋酸扭体法小鼠镇痛试验实验结果

注：^**：P＜0.01，与对照组比较(t检验)，&&：P＜0.01，与老工艺比较(t检验)

结果表明，布洛芬、新工艺、老工艺的小鼠扭体反应数与对照组比较均有显著差异(P＜0.01)，新工艺与老工艺比较，新工艺能显著抑制小鼠的扭体反应次数(P＜0.01)。说明玄七通痹胶囊新工艺的镇痛效果要明显优于老工艺。

2)角叉菜胶致小鼠足趾肿胀的抑制作用试验结果

实验结果以肿胀度表示，结果见表16。

表16玄七通痹胶囊对角叉菜胶致小鼠足趾肿胀的抑制作用实验结果

注：^**：P＜0.01；与对照组比较(t检验)；&：P＜0.05，与老工艺比较(t检验)

结果表明，阿司匹林、新工艺、老工艺的角叉菜胶足趾肿胀的抑制作用与对照组比较有极显著差异(P＜0.01)，新工艺对角叉菜胶足趾肿胀的抑制作用与老工艺比较有显著差异(P＜0.05)。说明玄七通痹胶囊新工艺的抗炎效果要优于老工艺。

3)毛细管法测定小鼠凝血时间试验结果

实验结果以凝血时间表示，结果见表17。

表17.玄七通痹胶囊毛细管法测定小鼠凝血时间试验结果

注：^**：P＜0.01，与对照组比较(t检验)；&&：P＜0.05，与老工艺比较(t检验)

药效筛选实验结果表明，蚂蚁超临界油的β-环糊精包合物、重楼黄芪醇提物及其药渣的水提物、三七超细粉、老鹳草水提物在抗炎、镇痛、抗凝血方面均有显著效果；而蚂蚁超临界后的药渣在镇痛、抗凝血方面具有显著效果；千年健油β-环糊精包合物及其水提物在抗炎、镇痛方面具有明显效果；三七醇提物有镇痛作用；老鹳草醇提物在脚叉菜胶致炎试验上有明显效果。通过药效筛选试验，明确或验证了蚂蚁、千年健、黄芪、重楼、三七、老鹳草的药用部位及药理作用，对工艺路线的确定具有指导意义。

阿司匹林、新工艺、老工艺的凝血时间与对照组比较有极显著差异(P＜0.01)，新工艺的凝血时间与老工艺比较有极显著差异(P＜0.01)。说明玄七通痹胶囊新工艺的抗凝血效果要优于老工艺。

附图说明

图1为本发明治疗类风湿性关节炎的中药组合物制备工艺流程图。

图2为蚂蚁千年健油的标准曲线。

图3蚂蚁千年健油紫外扫描图谱

其中，1为蚂蚁千年健油；2为蚂蚁千年健超临界油与β-环糊精的物理混合物；3为脱包后蚂蚁千年健油；4为β-环糊精。

包合物检查的紫外图谱表明：蚂蚁千年健超临界油、蚂蚁千年健超临界油与β-环糊精的物理混合物、包合物脱包后的蚂蚁千年健油具紫外吸收，β-环糊精无紫外吸收，说明蚂蚁千年健超临界萃取物被β-环糊精包合后形成了包合物。且包合后蚂蚁千年健超临界萃取物的主要成分未发生变化。

图4牛磺酸的标准曲线。

图5星点设计模型拟合图-1。

从图中可以看出，氮气流速对OD值增加的影响不显著；蒸发室温度与氮气流速的交互作用呈负性相关，也就是说随着蒸发室温度的升高，氮气流速也降低，总评归一值OD就会相应的增大，说明试验中若要升高蒸发室的温度，相应地也要降低氮气的流速。从图上可以直接读取的较优范围为B：蒸发室温度80℃～100℃。

图6星点设计模型拟合图-2。

从图中可以看出，以谷底蒸发室温度90℃为界，当温度大于90℃时，随着温度的升高，流动相比例的降低，总评归一值OD就会相应的增大；当温度小于90℃时，随着温度的降低，流动相比例的降低，总评归一值OD就会相应的增大。从图上可以直接读取的较优范围为A：乙腈31.5～35。

图7星点设计模型拟合图-3。

从图中可以看出，当流动相乙腈增加到37.5时，OD值开始下降；AC呈负相关。综合以上分析，再考虑到成本、耗时及仪器损耗等问题，最后预测出的最佳工艺为流动相乙腈-水(33∶67)，蒸发室温度90℃，氮气流速1.4SLM。

具体实施方式

实施例1

蚂蚁687.5g、黄芪187.5g、三七95g、千年健77.5g、老鹳草77.5g、重楼125g，其特征在于该工艺包括以下步骤：

a、CO₂超临界萃取：按上述配方将蚂蚁和千年健粉成粗粉后置于萃取釜中进行CO₂超临界萃取，萃取压力为24Mpa，萃取釜温度为60℃，萃取时间为90min，收集蚂蚁与千年健CO₂超临界萃取的混合萃取物，备用；

b、萃取物包合：将蚂蚁与千年健超临界萃取的混合萃取物用质量百分比浓度为10％的乙醇溶解，另取蚂蚁与千年健超临界萃取的混合萃取物重量6倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量2倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加蚂蚁与千年健超临界萃取的混合萃取物溶液，碾磨包合30分钟，倾出，冷藏静置36小时，滤过，40℃真空干燥，即得萃取物包合物；

c、醇提：将重楼、黄芪、三七加入质量百分比浓度为80％乙醇，用量为重楼、黄芪、三七重量的8倍量，提取2次，每次2h；

d、水提：醇提后所得药渣、蚂蚁和千年健CO₂超临界萃取的萃余物与老鹳草，采用药渣、萃余物和老鹳草重量的10倍量水提取2次，每次1h；

e、混合、干燥、粉碎：将重楼、黄芪、三七醇提液浓缩成浸膏后60℃真空干燥、粉碎成120目干粉；水提液浓缩成浸膏后60℃真空干燥，粉碎成120目干粉，备用；

f、制粒：将蚂蚁千年健混合萃取物包合物、水提物干粉、醇提取物干粉混合后加适量辅料制成颗粒，再填充胶囊。

实施例2

蚂蚁750g、黄芪180g、三七110g、千年健80g、老鹳草80g、重楼120g，其特征在于该工艺包括以下步骤：

a、CO₂超临界萃取：按上述配方将蚂蚁和千年健粉成粗粉后置于萃取釜中进行CO₂超临界萃取，萃取压力为36Mpa，萃取釜温度为40℃，萃取时间为30min，收集CO₂超临界萃取的萃取物，备用；

b、萃取物包合：将蚂蚁与千年健超临界萃取的混合萃取物用质量百分比浓度为30％的乙醇溶解，另取蚂蚁与千年健超临界萃取的混合萃取物重量8倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量4倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加蚂蚁与千年健超临界萃取的混合萃取物溶液，碾磨包合40分钟，倾出，冷藏静置24小时，滤过，40℃真空干燥，即得萃取物包合物；

c、醇提：将重楼、黄芪、三七加入80％乙醇8倍量提取2次，每次2h；

d、水提：醇提后所得药渣、蚂蚁和千年健CO₂超临界萃取的萃余物与老鹳草采用10倍量水提取2次，每次1h；

e、混合、干燥、粉碎：将重楼、黄芪、三七醇提液浓缩成浸膏后60℃真空干燥、粉碎成120目干粉；水提液浓缩成浸膏后60℃真空干燥，粉碎成120目干粉，备用；

f、制粒：将蚂蚁千年健混合萃取物包合物、水提物干粉、醇提取物干粉混合后加适量辅料，制成颗粒，再压片。

实施例3

蚂蚁750g、黄芪180g、三七110g、千年健80g、老鹳草80g、重楼120g，其特征在于该工艺包括以下步骤：

a、CO₂超临界萃取：按上述配方将蚂蚁和千年健粉成粗粉后置于萃取釜中进行CO₂超临界萃取，萃取压力为30Mpa，萃取釜温度为50℃，萃取时间为60min，收集CO₂超临界萃取的萃取物，备用；

b、萃取物包合：将蚂蚁与千年健超临界萃取的混合萃取物用质量百分比浓度为30％的乙醇溶解，另取蚂蚁与千年健超临界萃取的混合萃取物重量4倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量2倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加蚂蚁与千年健超临界萃取的混合萃取物溶液，碾磨包合20分钟，倾出，冷藏静置24小时，滤过，40℃真空干燥，即得萃取物包合物；

c、醇提：将重楼、黄芪、三七加入80％乙醇8倍量提取2次，每次2h；

d、水提：醇提后所得药渣与蚂蚁和千年健CO₂超临界萃取的萃余物、老鹳草采用10倍量水提取2次，每次1h；

e、混合、干燥、粉碎：将重楼、黄芪、三七醇提液浓缩成浸膏后60℃真空干燥、粉碎成120目干粉；水提液浓缩成浸膏后60℃真空干燥，粉碎成120目干粉，备用；

f、制粒：将蚂蚁千年健混合萃取物包合物、水提物干粉、醇提取物干粉混合后，加入适量辅料，制成口服液。

Claims (3)

1.一种治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备工艺，选用蚂蚁8-10重量份、黄芪2-3重量份、三七1-2重量份、千年健0.8-1.2重量份、老鹳草0.8-1.2重量份、重楼1-2重量份为原料药，其特征在于该工艺包括以下步骤：

a、CO₂超临界萃取：将蚂蚁和千年健粉成粗粉后置于萃取釜中进行CO₂超临界萃取，萃取压力为24-36Mpa，萃取温度为40-60℃，萃取时间为30-90min，收集蚂蚁与千年健混合萃取物；

b、萃取物包合：取蚂蚁与千年健混合萃取物，用质量百分比浓度为10-30％的乙醇溶解，另取蚂蚁与千年健的混合萃取物重量4-8倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量2-4倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加蚂蚁与千年健混合萃取物溶液，碾磨包合20-40分钟，倾出，冷藏静置，滤过，真空干燥，即得混合萃取物的包合物；

c、醇提：将重楼、黄芪、三七用质量百分比浓度为70-90％的乙醇提取；

d、水提：醇提后所得药渣、老鹳草与蚂蚁和千年健CO₂超临界萃取的萃余物进行水提；

e、混合、干燥、粉碎：将上述醇提液浓缩成浸膏后干燥、粉碎成醇提取物干粉，水提液浓缩成浸膏后干燥，粉碎成水提物干粉；将蚂蚁千年健混合萃取物包合物、水提物干粉、醇提取物干粉混合，加适量辅料，常规方法制成所需剂型。

2.根据权利要求1所述的治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备工艺，选用蚂蚁8.5-9.0重量份、黄芪2.0-2.5重量份、三七1.0-1.5重量份、千年健1重量份、老鹳草1重量份、重楼1.5-2.0重量份为原料药。

3.根据权利要求1所述的治疗类风湿性关节炎的中药组合物的制备工艺，其特征在于该工艺具体包括以下步骤：

a、CO₂超临界萃取：将蚂蚁和千年健粉成粗粉后置于萃取釜中进行CO₂超临界萃取，萃取压力为24Mpa，萃取温度为60℃，萃取时间为90min，收集蚂蚁与千年健混合萃取物；

b、萃取物包合：取蚂蚁与千年健混合萃取物，用质量百分比浓度为10％的乙醇溶解，另取蚂蚁与千年健的混合萃取物重量6倍量的β-环糊精，加入β-环糊精重量2倍量的水研匀，倒入胶体磨中，缓慢连续滴加蚂蚁与千年健混合萃取物溶液，碾磨包合30分钟，倾出，冷藏静置，滤过，真空干燥，即得混合萃取物的包合物；

c、醇提：将重楼、黄芪、三七用质量百分比浓度为80％的乙醇8倍量提取2次，每次2h；

d、水提：醇提后所得药渣、老鹳草与蚂蚁和千年健CO₂超临界萃取的萃余物采用10倍量水提取2次，每次1h；

e、混合、干燥、粉碎：将上述醇提液浓缩成浸膏后干燥、粉碎成醇提取物干粉，水提液浓缩成浸膏后干燥，粉碎成水提物干粉；将蚂蚁千年健混合萃取物包合物、水提物干粉、醇提取物干粉混合，加适量辅料，常规方法制成所需剂型。

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