CN101632706B - 鸡血藤提取物、其制备方法及其制剂和医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡血藤有效部位提取物，它含有主要成份染料木黄酮和芒柄花黄素，通过下述方法制得：取原药材鸡血藤，除去杂质，粉碎后分别依次用石油醚，乙酸乙酯/氯仿，甲醇振荡提取，以甲醇提取滤液，浓缩后再经真空冻干成粉末，还公开了含有上述鸡血藤有效部位提取物的药物组合物以及所述的药物组合物在制备防治氧化药物、防治氧化应激疾病药物以及防治帕金森疾病药物中的应用，本发明的鸡血藤有效部位提取物的提取方法工艺过程简便、易于控制；鸡血藤提取物及其制剂具有较强的双重抗氧化作用，能防治氧化应激疾病；还能防治帕金森疾病，为防治氧化应激疾病及帕金森疾病提供了新的、有效的药物。

Description

鸡血藤提取物、其制备方法及其制剂和医药用途

技术领域

本发明属中药制药领域，涉及一种中草药鸡血藤提取物及其制备方法以及在制备药物中的应用，尤其在制备抗氧化，防治氧化应激疾病以及防治帕金森疾病中的应用。 

背景技术

当人体受到外界有害刺激，如：紫外线、重金属、有毒化学物质等，以及人体衰老而导致内源性抗氧化水平降低，就会产生过氧化应激(OxidativeStress，OS)。OS产生大量自由基，生成脂质过氧化物，损伤DNA和蛋白质产物，引发和加重心血管疾病、癌症、糖尿病、肾病变和帕金森病等。人体摄入外源性抗氧化物质，如：维生素C，维生素E和植物多酚等可以直接消除自由基；摄入能提高自身内源性抗氧化酶活力的药物可以间接清除自由基，防止OS产生，从而预防和治疗相关疾病。人体重要的抗氧化酶有超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽还原酶(Glutathion peroxidase，GSH-Px)等。还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量是衡量体内过氧化状态的重要指标。 

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)又称震颤麻痹，表现为震颤、肌肉僵硬、运动障碍等特征性症状。OS是引发和加重PD的重要原因。我国人群发病率约为1.7％，且随着老龄人口增加而升高。PD给病人、看护者及社会带来严重的情感、身体和经济的负担，越来越成为政府部门、医疗机构和生物制药行业关注的重大问题。 

中草药鸡血藤(豆科植物，Suberect Spatholobus Stem)，最早收载于《本草纲目拾遗》和《本草再新》等书籍，有补血、活血和通络功效。中华人民共和国药典(2000年版)中用于月经不调、血虚萎黄、麻木瘫痪、风湿痹痛等疾病。未见有关防治氧化应激疾病的报道，亦未见单独用于帕金森疾病治疗的报道。 

有关鸡血藤有效部位提取物的提取方法方面的技术，中国专利200610137716.1、《具有抗肿瘤作用的鸡血藤提取物及其制作方法》描述了一种提取方法，主要包括以下步骤：1)制作原料药，将中药材鸡血藤用水浸泡8-24小时，洗净泥土，取出，闷润8-12小时，至内外湿度一致；切片，晒干，过筛，制成原料药；2)水溶性提取；或3)醇溶性提取；4)聚酰胺柱层析纯化产物：回收乙醇至无醇味，经水浴蒸干，真空干燥得各洗脱物。用本发明方法获得的鸡血藤提取物主要应用于肿瘤疾病的预防与治疗。 

但现有技术中未见有使用非极性溶剂作为提取溶剂的报道。 

发明内容

本发明解决的技术问题是提供中药鸡血藤(Suberect Spatholobus Stem)的活性部位及提取方法，该提取方法使用非极性溶剂作为提取的溶剂。 

本发明解决的另一个技术问题是提供以上述鸡血藤活性部位作为原料的药物组合物。 

本发明解决的又一个技术问题是提供上述鸡血藤活性部位在制备抗氧化、防治氧化应激疾病以及防治帕金森疾病药物中的应用。 

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是这样的： 

本发明公开了一种鸡血藤有效部位提取物，通过大量的化学和药理研究测试，中药鸡血藤中含有丰富的染料木黄酮和芒柄花黄素等黄酮类成分，可作为药物制剂原料，它通过下述方法制得：取原药材鸡血藤，除去杂质，粉碎后分别依次用石油醚，乙酸乙酯/氯仿，甲醇振荡提取，以甲醇提取滤液，浓缩后再经真空冻干成粉末。 

本发明还公开了鸡血藤提取物的制备方法，其特征在于选用石油醚、乙酸乙酯/氯仿作为提取溶剂，包括以下步骤：鸡血藤药材除去杂质、粉碎、加石油醚振荡、过滤取滤渣、滤渣加入乙酸乙酯/氯仿振荡、甲醇洗脱、浓缩、真空冻干成粉末。 

具体地说，本发明的鸡血藤提取物的制备方法包括如下步骤： 

a.取鸡血藤药材，去除杂质，并粉碎，得药材粗粉或细颗粒； 

b.加入10倍质量体积比的石油醚，于室温下振荡过夜，然后过滤取滤渣， 溶剂回收； 

c.上一步骤所得滤渣加入10倍质量体积比的乙酸乙酯/氯仿混合溶剂振荡过夜，过滤取滤渣，溶剂回收； 

d.上一步骤所得滤渣加入10倍质量体积比的甲醇，在室温下振荡过夜，过滤，取滤液； 

e.上一步骤所得滤液经浓缩后再进行真空冻干成粉末。 

其中步骤c所述的乙酸乙酯/氯仿混合溶剂是指乙酸乙酯与氯仿按体积比1∶1混合。 

本发明的技术方案中，提取溶剂均为分析纯，石油醚沸程为60-90摄氏度。 

本发明的一种药物组合物，含有所述的鸡血藤有效部位提取物及药学上可接受的载体。 

具体的说，所述的药物组合物是以所述鸡血藤有效部位提取物作为原料加入药剂学上通常所说的辅料，制成的胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂或滴丸剂。 

本发明还公开了所述的鸡血藤有效部位提取物在制备防治氧化药物中的应用。 

还公开了所述的鸡血藤有效部位提取物在制备防治氧化应激疾病药物中的应用。 

本发明还提出所述的鸡血藤有效部位提取物在制备防治帕金森疾病药物中的应用。 

经体外实验和体内动物实验结果证明：鸡血藤提取物具有直接清除自由基和提高体内抗氧化酶，间接清除自由基的双重抗氧化作用。体内实验结果证明，鸡血藤提取物能有效降低阿朴吗啡诱导的PD大鼠的同侧旋转行为，增加大脑黑质部位神经元细胞数量，提高超氧化物岐化酶(SOD)活力，增加还原型谷胱甘肽(GSH)的含量，并抑制丙二醛(MDA)形成。细胞实验结果证明，鸡血藤提取物能有效提高双氧水损伤的大鼠嗜铬神经细胞(PC12)和6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的存活率。化学实验证明，鸡血藤提取物能有效清除自由基，对Fe⁺³有较强的还原力。 

与现有技术相比，本发明提供了一种鸡血藤有效部位的新的提取方法，该方法工艺过程简便、易于控制；所提供的鸡血藤有效部位的提取物及其制剂具有较强的双重抗氧化作用，能防治氧化应激疾病；还能防治帕金森疾病，为防治氧化应激疾病及帕金森疾病提供了新的、有效的药物。 

附图说明

图1是本发明的鸡血藤提取物中染料木黄酮HPLC谱图， 

图2是本发明的鸡血藤提取物中芒柄花黄素HPLC素谱图， 

图3鸡血藤提取物HPLC谱图， 

其中，鸡血藤提取物(3.825mg/ml)，进样体积(20ul)，染料木黄酮和芒柄花素(0.1mg/ml)，进样体积(20ul)，标记峰分别为：A和B。 

图4鸡血藤提取物体外清除二苯代苦味酰肼(DPPH)自由基的作用(均数±SD，n＝5)， 

图5鸡血藤提取物总还原力(均数±SD，n＝5)， 

图6鸡血藤提取物对双氧水损伤的大鼠嗜铬神经细胞(PC12)的保护作用(均数±SD，n＝5)， 

图7鸡血藤提取物对6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的保护作用(均数±SD，n＝5)， 

图8鸡血藤提取物对6-ODHA致PD大鼠SOD活性影响(均数±SD，n＝5)， 

图9鸡血藤提取物对6-ODHA致PD大鼠GSH含量影响(均数±SD，n＝5)， 

图10鸡血藤提取物对6-ODHA致PD大鼠MDA含量影响(均数±SD，n＝5)， 

图11鸡血藤提取物对6-ODHA致PD大鼠同侧旋转影响(均数±SD，n＝5)， 

图12鸡血藤提取物对6-ODHA致PD大鼠大脑黑质部位神经元细胞数量的影响(均数±SD，n＝5。 

具体实施方式

以下例举实施例更具体地说明本发明，实施例所示成分、比率、操作条件和顺序等可在不脱离本发明精神的限定内适当变更。 

提取工艺： 

取1.0kg鸡血藤去除杂质→粉碎→加入10倍(w/v)石油醚室温振荡过夜，过滤(溶剂回收)→滤渣加入10倍(w/v)乙酸乙酯/氯仿(1∶1)振荡过夜，过滤(溶剂回收)→滤渣加入10倍(w/v)甲醇室温振荡过夜，过滤→滤液浓缩后真空冻干成红褐色粉末，得提取物粉末0.1419kg。 

本方法通过下述方法提取活性成部位： 

1、取原药材鸡血藤，除去残枝、砂石等杂物，粉碎后分别用石油醚，乙酸乙酯/氯仿(1∶1)和甲醇提取。甲醇提取液浓缩后真空冻干成粉末。 

2、用高效液相色谱(High-performance liquid chromatography，HPLC)，检测其中含有(染料木黄酮和芒柄花黄素)等主要成份。 

实施例1 

鸡血藤提取物分别依次用石油醚乙酸乙酯/氯仿和甲醇提取，甲醇提取液浓缩后真空冻干，用高效液相色谱检查，其中主要含有染料木黄酮和芒柄花黄素等成分。 

具体提取过程描述如下：取1.0kg鸡血藤去除杂质，经粉碎，加入10倍质量体积比的石油醚室温振荡过夜，过滤，溶剂回收，所得滤渣加入10倍质量体积比的乙酸乙酯/氯仿(1∶1)振荡过夜，接着过滤，溶剂回收，滤渣再加入10倍质量体积比的甲醇在室温下振荡过夜，过滤；所得滤液浓缩后真空冻干成红褐色粉末，得提取物粉末0.1419kg。 

图1所示图谱是本发明的鸡血藤提取物中染料木黄酮HPLC谱图，图2所示图谱是本发明的鸡血藤提取物中芒柄花黄素HPLC素谱图；图3是鸡血藤提取物HPLC谱图，其中，鸡血藤提取物(3.825mg/ml)，进样体积(20μl)，染料木黄酮和芒柄花素(0.1mg/ml)，进样体积(20μl)，标记峰分别为：A和B。 

实施例2 

取鸡血藤提物，添加适量微晶纤维素、淀粉或其他赋形剂，按药剂学上常规方法分剁制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、丸剂等内服剂型。 

实施例3 

测试本发明之鸡血藤提物的化学抗氧化作用。 

(1).用DPPH清除实验观察鸡血藤提物对自由基的清除作用，如图4所示，该图显示的是：鸡血藤提取物体外清除二苯代苦味酰肼(DPPH)自由基的作用(均数±SD，n＝5)，结果表明鸡血藤提取物对DPPH半清除浓度(IC₅₀)为9.64±0.26μg/ml。对照二丁基羟基甲苯(BHT)对DPPH的半清除浓度为14.99±0.83μg/ml。与对照组比较，P＜0.05。 

(2).用Fe+3还原法检测鸡血藤提物的总还原力，如图5所示，该图谱显示了鸡血藤提取物总还原力(均数±SD，n＝5)的情况，结果表明鸡血藤提物有很强的总还原力，为2062.56±36.74μmol/g，对照抗氧化剂BHT总还原力为781.99±9.61μmol/g。与对照组比较，P＜0.05。 

实施例4 

测试本发明之鸡血藤提物的细胞抗氧化作用。 

(1).用双氧水诱导损伤大鼠嗜铬神经细胞(PC12)模型检测样品对氧化损伤细胞的保护作用。 

常规方法培养PC12细胞，10,000个/孔，隔夜贴壁，加入提取物和300μM H₂O₂，24小时后加入噻唑蓝(MTT)检测细胞增值率。如图6所示，该图谱显示了鸡血藤提取物对双氧水损伤的大鼠嗜铬神经细胞(PC12)的保护作用(均数±SD，n＝5)，结果表明，鸡血藤提取物显著提高了PC12细胞的存活率。 

(2).用6-羟基多巴胺损伤人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)模型检测样品对神经细胞的保护作用。 

常规方法培养SH-SY5Y细胞，10,000个/孔，隔夜贴壁，加入100μmol/L6-OHDA，4小时后加入鸡血藤提物，24小时后加入噻唑蓝(MTT)检测细胞增值率。如图7所示，该图谱显示了鸡血藤提取物对6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的保护作用(均数±SD，n＝5)，结果表明，鸡血藤提取物显著提高了SH-SY5Y细胞的存活率。 

实施例5 

测试本发明之鸡血藤提物的对6-OHDA诱导的PD大鼠抗氧化状态影响及对PD疾病的治疗作用。 

230-250克成年健康雄性大鼠40只，水合氯醛麻醉，大鼠脑立体定位仪固定，分别在前囟后3.0mm，正中线右侧2.5mm和前囟后2.4mm，正中线右侧 2.7mm处钻孔，硬脑膜腹侧8.6mm用微量注射泵分别注入0.2％的6-OHDA 3ul和4.5ul，留针10min后缓慢拔针。手术完毕，堵塞骨孔，缝合切口。造模后2周，腹腔注射0.01％阿朴吗啡10ml/kg，诱发大鼠旋转行为(逆时针方向)。10min后开始记录，共记录30min。旋转速度达到6转/min以上者视为选择性偏侧大鼠PD模型制备成功。随机挑选造模成功后的PD大鼠，分成4组，每组5-7只。正常组和模型组每天用生理盐水灌胃，治疗组分别以900，300mg/kg/day的鸡血藤提取物灌胃。给药四星期后用阿朴吗啡诱导大鼠旋转，之后禁食过夜，眼眶取血，心脏灌流，取出脑组织切片观察。用凯基生物科技有限公司生产的试剂盒检测血液中SOD活性，GSH和MDA含量。如图8所示，该图谱显示了鸡血藤提取物对6-ODHA致PD大鼠SOD活性影响(均数±SD，n＝5)，结果发现鸡血藤提取物能显著降低PD大鼠血清中的MDA含量。与模型组比较，P＜0.05。图9显示的是鸡血藤提取物对6-ODHA致PD大鼠GSH含量影响(均数±SD，n＝5)，另外，图10显示的是鸡血藤提取物对6-ODHA致PD大鼠MDA含量影响(均数±SD，n＝5)，图11显示的是鸡血藤提取物对6-ODHA致PD大鼠同侧旋转影响(均数±SD，n＝5)，图12显示的是鸡血藤提取物对6-ODHA致PD大鼠大脑黑质部位神经元细胞数量的影响(均数±SD，n＝5。 

总结上述数据，表明： 

鸡血藤提取物能显著增加PD大鼠血清中的GSH含量；与模型组比较，P＜0.05； 

鸡血藤提取物能显著提高PD大鼠血清中的SOD活性。与模型组比较，P＜0.05； 

鸡血藤提取物能延缓大鼠PD的发展； 

鸡血藤提取物能显著保护PD大鼠大脑黑质部位神经元细胞；与模型组比较，P＜0.05。 

Claims (7)

1.一种鸡血藤有效部位提取物，其特征在于含有主要成份染料木黄酮和芒柄花黄素，通过下述方法制得：

a.取鸡血藤药材，除去杂质，并粉碎，得药材粗粉或细颗粒；

b.加入10倍质量体积比的石油醚，于室温下振荡过夜，然后过滤取滤渣，溶剂回收；

c.上一步骤所得滤渣加入10倍质量体积比的乙酸乙酯/氯仿混合溶剂振荡过夜，所述的乙酸乙酯/氯仿混合溶剂是指乙酸乙酯与氯仿按体积比1∶1混合，过滤取滤渣，溶剂回收；

d.上一步骤所得滤渣加入10倍质量体积比的甲醇，在室温下振荡过夜，过滤，取滤液；

e.上一步骤所得滤液经浓缩后再进行真空冻干成粉末。

2.一种鸡血藤提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

a.取鸡血藤药材，除去杂质，并粉碎，得药材粗粉或细颗粒；

b.加入10倍质量体积比的石油醚，于室温下振荡过夜，然后过滤取滤渣，溶剂回收；

c.上一步骤所得滤渣加入10倍质量体积比的乙酸乙酯/氯仿混合溶剂振荡过夜，所述的乙酸乙酯/氯仿混合溶剂是指乙酸乙酯与氯仿按体积比1∶1混合，过滤取滤渣，溶剂回收；

d.上一步骤所得滤渣加入10倍质量体积比的甲醇，在室温下振荡过夜，过滤，取滤液；

e.上一步骤所得滤液经浓缩后再进行真空冻干成粉末。

3.一种药物组合物，由权利要求1所述的鸡血藤有效部位提取物及药学上可接受的载体组成。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征是：所述的药物组合物是以所述鸡血藤有效部位提取物作为原料制成的胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂或滴丸剂。

5.权利要求1所述的鸡血藤有效部位提取物在制备防治氧化药物中的应用。

6.权利要求1所述的鸡血藤有效部位提取物在制备防治氧化应激疾病药物中的应用。

7.权利要求1所述的鸡血藤有效部位提取物在制备防治帕金森疾病药物中的应用。

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