CN101628929A - 一种固相合成侧链保护肽链的新方法 - Google Patents

一种固相合成侧链保护肽链的新方法 Download PDF

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Abstract

本发明为一种固相合成侧链保护肽链的新方法，属于有机化合物和多肽固相合成与制备技术领域。在肽链合成中，为了获得较大的肽链片段，需要利用侧链保护的肽链片段在液相中进行拼接，而常用的多肽固相合成树脂进行肽链合成时，应用酸性裂解试剂将肽链从树脂上切落，同时肽链的侧链保护基也被脱除，得到的是非保护的肽链。本发明通过在树脂上连接一段“手柄”，对树脂改进，在“手柄”上进行肽链合成，利用弱碱性条件将肽链从“手柄”上切割下来，不会脱除侧链保护基，可用于侧链保护肽链的固相合成。

Description

一种固相合成侧链保护肽链的新方法
本发明为一种固相合成侧链保护肽链的新方法，涉及一段“手柄”与多肽固相合成树脂的连接、肽链与“手柄”的连接，以及肽链从树脂上的切割方法，通过一段“手柄”对树脂的改进，在“手柄”上合成肽链，能够用弱碱性条件将肽链从树脂上切割下来，获得侧链保护的肽链片段。
技术领域
本发明属于有机化合物和多肽固相合成与制备技术领域。
背景技术
常用的肽链固相合成树脂有Merrifield树脂、Wang树脂和Rink Amide树脂。利用这些树脂进行肽链合成时，当肽链连接完成后，应用酸性裂解试剂将肽链从树脂上切落。常用的酸性裂解试剂是无水氢氟酸、三氟乙酸或以三氟乙酸为主要成分的混合溶液。由于常用的且比较容易脱去的氨基酸侧链保护基也是一些对酸敏感的保护基，在将肽链从树脂上切落的同时，肽链的侧链保护基也被脱除，得到的是非保护的多肽。然而，在实际合成大的肽链时，通常利用两段肽链在液相中进行拼接，此时需要肽链的侧链是保护的，应用现有的树脂很难得到保护的肽链。人们已经开发出一些特殊结构的树脂，如HMPA-AM树脂，能在碱性条件下将多肽链从树脂上切落，不会脱除侧链保护基，得到侧链保护的肽链，但这种树脂价格昂贵，高昂的价格限制了这种树脂的大量应用。本发明立足于在常用的多肽固相合成树脂上连接一段辅助“手柄”，连接“手柄”后，一是能够用通常的肽链合成方法在“手柄”上进行肽链的连接，二是将肽链从“手柄”上切割下来时避免应用强酸性条件，不会导致侧链保护基的脱除，提供了一种固相合成侧链保护肽链的新方法。
发明内容
本发明的目的是发明一种固相合成侧链保护肽链的新方法。在固相合成树脂上连接一段“手柄”，然后在“手柄”上进行肽链的合成，最后在一定条件下将肽链从“手柄”上切落，获得侧链保护的肽链。
本发明涉及的“手柄”的结构式如式(I)
Figure A20091016938500041
其中
Figure A20091016938500042
为Merrifield树脂或Wang树脂。当
Figure A20091016938500043
为Merrifield树脂时，X为HO，当
Figure A20091016938500044
为Wang树脂时，X为Cl或Br。
本发明还涉及“手柄”与Merrifield树脂的连接方法，包括：首先在固相反应器中将树脂溶胀活化，然后将5倍摩尔量的羟乙酸与2.5倍摩尔量的碳酸铯预先混合反应，将反应混合液加入到固相反应器中与树脂反应3至4小时。过滤除去溶剂，“手柄”连接到树脂上。如式(II)
Figure A20091016938500051
本发明还涉及“手柄”与Wang树脂的连接方法，包括：首先在固相反应器中将树脂溶胀活化，然后将5倍于树脂摩尔量的卤代乙酰卤(YCH2COZ)和5倍摩尔量的三乙胺加入到固相反应器中与树脂反应10小时。过滤除去溶剂，“手柄”连接到树脂上。如式(III)
Figure A20091016938500052
其中Y为Cl或Br，Z为Cl或Br。
本发明还涉及“手柄”上肽链的合成方法包括：
(1)当“手柄”上的X为HO时
肽链C端的第一个氨基酸与固定在树脂上的“手柄”的连接：将5倍于“手柄”摩尔量的氨基酸与5倍摩尔量的DIC和0.5倍摩尔量的DMAP混合反应5分钟，将反应混合液加入到固相反应器中与树脂上“手柄”的羟基反应4小时。过滤除去溶剂，第一个氨基酸连接到“手柄”上。
其它氨基酸的连接方法与通常的肽链合成方法相同：先脱除连接在树脂上氨基酸的保护基，再将5倍摩尔量的下一个待连接氨基酸和5倍摩尔量的2-(1H-苯并三唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、5倍摩尔量的1-羟基-苯并三氮唑(HOBt)和10倍摩尔量的二异丙基乙胺(DIPEA)混合反应3分钟后加入到树脂中，反应2小时后，过滤洗去溶剂。重复此步骤直至完成肽链连接。
(2)当“手柄”上的X为Cl或Br时
肽链C端的第一个氨基酸与固定在树脂上的“手柄”的连接：将5倍于“手柄”摩尔量的氨基酸与2.5倍摩尔量的碳酸铯预先混合反应，将反应混合液加入到固相反应器中与树脂反应3至4小时。过滤除去溶剂，第一个氨基酸连接到“手柄”上。
其它氨基酸的连接方法与通常的肽链合成方法相同：先脱除连接在树脂上氨基酸的保护基，再将5倍摩尔量的下一个待连接氨基酸和5倍摩尔量的2-(1H-苯并三唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、5倍摩尔量的1-羟基-苯并三氮唑(HOBt)和10倍摩尔量的二异丙基乙胺(DIPEA)混合反应3分钟后加入到树脂中，反应2小时后，过滤洗去溶剂。重复此步骤直至完成肽链连接。
本发明还涉及肽链从树脂上切落的方法包括：将氢氧化钠或四丁基氢氧化铵溶解在DMF和水的混合溶剂中，配制成0.5％～0.8％的浓度，将配制好的溶液加入到固相反应器中与树脂混合，反应2小时，过滤，滤液中加入饱和柠檬酸溶液中和至中性，加入乙酸乙酯提取其中的物质，减压彻底除去溶剂，得到侧链保护基全保留的肽链。
本发明设计的固相合成侧链保护肽链的新方法，主要借助于一段“手柄”的辅助，其中“手柄”连接到树脂上的方法简便，在“手柄”连接肽链的方法与通常树脂相同，将肽链从“手柄”上切割下来的条件温和，不会脱除侧链保护基，得到侧链保护的多肽。该方法简便易行、效率高，且不会提高合成成本。
具体实施方式
(1)“手柄”与Merrifield树脂的连接-羟乙酸与Merrifield树脂反应
Figure A20091016938500061
称取120mg(0.08mmol)Merrifield树脂(0.67mmol/g)加入到固相反应器中，加入4.0ml二氯甲烷，在摇床上振荡30min后，减压除去二氯甲烷，用4.0mlDMF洗涤树脂3次。将30mg(0.4mmol)羟乙酸与65mg(0.2mmol)碳酸铯在4.0ml DMF中混合反应10min，将反应混合液加入到固相反应器中与树脂混合，于摇床上振荡反应4小时，“手柄”通过酯键连接到树脂上。过滤除去溶剂，树脂先用3.0ml水洗涤两次以除去反应过程中生成的氯化铯，再用4.0mlDMF洗涤四次，用于以下的肽链合成。
(2)在(1)中的“手柄”上合成多肽H2N-Ala-Ser(tBu)-Gly-OH
①Gly与树脂的连接：将119mg(0.4mmol)Fmoc-Gly-OH与51mg(0.4mmol)DIC和5mg(0.04mmol)DMAP(122)混合反应5分钟，将反应混合液加入到固相反应器中与树脂混合，于摇床上振荡反应4小时。过滤除去溶液，用4.0ml DMF洗涤四次。
②脱除Fmoc：向固相反应器中加入4.0ml 20％哌啶/DMF溶液，于摇床上振荡反应5min，过滤除去溶液，再加入4.0ml 20％哌啶/DMF溶液，于摇床上振荡反应20min。用4.0mlDMF洗涤四次。
③154mg(0.4mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH和152mg(0.4mmol)HBTU、54mg(0.4mmol)HOBt、103mg(0.8mmol)DIPEA混合反应3分钟。将反应混合液加入到固相反应器与树脂混合，于摇床上振荡反应2小时。过滤除去溶液，用4.0ml DMF洗涤四次。
④脱除Fmoc：向固相反应器中加入4.0ml 20％哌啶/DMF溶液，于摇床上振荡反应5min，过滤除去溶液，再加入4.0ml 20％哌啶/DMF溶液，于摇床上振荡反应20min。用4.0mlDMF洗涤四次。
⑤125mg(0.4mmol)Fmoc-Ala-OH和152mg(0.4mmol)HBTU、54mg(0.4mmol)HOBt、103mg(0.8mmol)DIPEA(129)混合反应3分钟。将反应混合液加入到固相反应器与树脂混合，于摇床上振荡反应2小时。过滤除去溶液，用4.0ml DMF洗涤四次。
⑥脱除Fmoc：向固相反应器中加入4.0ml 20％哌啶/DMF溶液，于摇床上振荡反应5min，过滤除去溶液，再加入4.0ml 20％哌啶/DMF溶液，于摇床上振荡反应20min。用4.0mlDMF洗涤四次。
⑦将氢氧化钠溶解在DMF和水的混合溶剂中，配制成0.5％的浓度，取4.0ml配制好的溶液加入到固相反应器中与树脂混合，反应2小时，过滤，滤液中饱和柠檬酸溶液中和至中性，用5.0ml乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯层，减压彻底除去溶剂，得到肽链H2N-Ala-Ser(tBu)-Gly-OH。
(3)“手柄”与Wang树脂的连接-溴乙酰溴与Wang树脂反应
称取71mg(0.08mmol)Wang树脂(1.13mmol/g)加入到固相反应器中，加入4.0ml二氯甲烷，在摇床上振荡30min后，减压除去二氯甲烷，用4.0mlDMF洗涤树脂3次。将81mg(0.4mmol)溴乙酰溴与41mg(0.4mmol)三乙胺溶解在4.0ml DMF中，加入到固相反应器中与树脂混合，于摇床上振荡反应10小时，“手柄”通过酯键连接到树脂上。过滤除去溶剂，树脂用4.0ml DMF洗涤四次，用于以下的肽链合成。
(4)在改进后的树脂上合成多肽H2N-Ala-Lys(Boc)-Gly-OH
①Gly与树脂的连接：将119mg(0.4mmol)Fmoc-Gly-OH(297)与66mg(0.2mmol)碳酸铯在4.0ml DMF中混合反应10min，将反应混合液加入到固相反应器中与树脂混合，于摇床上振荡反应4小时。过滤除去溶液，用4.0ml DMF洗涤四次。
②脱除Fmoc：向固相反应器中加入4.0ml 20％哌啶/DMF溶液，于摇床上振荡反应5min，过滤除去溶液，再加入4.0ml 20％哌啶/DMF溶液，于摇床上振荡反应20min。用4.0mlDMF洗涤四次。
③188mg(0.4mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH和152mg(0.4mmol)HBTU、54mg(0.4mmol)HOBt、103mg(0.8mmol)DIPEA混合反应3分钟。将反应混合液加入到固相反应器与树脂混合，于摇床上振荡反应2小时。过滤除去溶液，用4.0ml DMF洗涤四次。
④脱除Fmoc：向固相反应器中加入4.0ml 20％哌啶/DMF溶液，于摇床上振荡反应5min，过滤除去溶液，再加入4.0ml 20％哌啶/DMF溶液，于摇床上振荡反应20min。用4.0mlDMF洗涤四次。
⑤125mg(0.4mmol)Fmoc-Ala-OH和152mg(0.4mmol)HBTU、54mg(0.4mmol)HOBt、103mg(0.8mmol)DIPEA混合反应3分钟。将反应混合液加入到固相反应器与树脂混合，于摇床上振荡反应2小时。过滤除去溶液，用4.0ml DMF洗涤四次。
⑥脱除Fmoc：向固相反应器中加入4.0ml 20％哌啶/DMF溶液，于摇床上振荡反应5min，过滤除去溶液，再加入4.0ml 20％哌啶/DMF溶液，于摇床上振荡反应20min。用4.0mlDMF洗涤四次。
⑦将氢氧化钠溶解在DMF和水的混合溶剂中，配制成0.5％的浓度，取4.0ml配制好的溶液加入到固相反应器中与树脂混合，反应2小时，过滤，滤液中饱和柠檬酸溶液中和至中性，用5.0ml乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯层，减压彻底除去溶剂，得到肽链H2N-Ala-Lys(Boc)-Gly-OH。

Claims (7)

1、在固相合成树脂上连接一段“手柄”，然后在“手柄”上进行肽链的合成，最后在一定条件下将肽链从“手柄”上切落，获得侧链保护的肽链。
2、权利要求1中的“手柄”的结构式如式(I)
Figure A2009101693850002C1
其中X为HO、Cl或Br，
Figure A2009101693850002C2
为Merrifield树脂或Wang树脂。当为Merrifield树脂时，X为HO，当
Figure A2009101693850002C4
为Wang树脂时，X为Cl或Br。
3、权利要求2中“手柄”与Merrifield树脂的连接方法为：首先在固相反应器中将树脂溶胀活化，然后将5倍摩尔量的羟乙酸与2.5倍摩尔量的碳酸铯预先混合反应，将反应混合液加入到固相反应器中与树脂反应3至4小时。过滤除去溶剂，“手柄”连接到树脂上。如式(II)
Figure A2009101693850002C5
4、权利要求3中“手柄”上肽链的合成方法包括：
(1)肽链C端的第一个氨基酸与固定在树脂上的“手柄”的连接：将5倍于“手柄”摩尔量的氨基酸与5倍摩尔量的DIC和0.5倍摩尔量的DMAP混合反应5分钟，将反应混合液加入到固相反应器中与树脂上“手柄”的羟基反应4小时。过滤除去溶剂，第一个氨基酸连接到“手柄”上。
(2)其它氨基酸的连接方法与通常的肽链合成方法相同：先脱除连接在树脂上氨基酸的保护基，再将5倍摩尔量的下一个待连接氨基酸和5倍摩尔量的2-(1H-苯并三唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、5倍摩尔量的1-羟基-苯并三氮唑(HOBt)和10倍摩尔量的二异丙基乙胺(DIPEA)混合反应3分钟后加入到树脂中，反应2小时后，过滤洗去溶剂。重复此步骤直至完成肽链连接。
5、权利要求2中“手柄”与Wang树脂的连接方法为：首先在固相反应器中将树脂溶胀活化，然后将5倍于树脂摩尔量的卤代乙酰卤(YCH2COZ)和5倍摩尔量的三乙胺加入到固相反应器中与树脂反应10小时。过滤除去溶剂，“手柄”连接到树脂上。如式(III)
Figure A2009101693850002C6
其中Y为Cl或Br，Z为Cl或Br。
6、权利要求5中“手柄”上肽链的合成方法包括：
(1)肽链C端的第一个氨基酸与固定在树脂上的“手柄”的连接：将5倍于“手柄”摩尔量的氨基酸与2.5倍摩尔量的碳酸铯预先混合反应，将反应混合液加入到固相反应器中与树脂反应3至4小时。过滤除去溶剂，第一个氨基酸连接到“手柄”上。
(2)其它氨基酸的连接方法与通常的肽链合成方法相同：先脱除连接在树脂上氨基酸的保护基，再将5倍摩尔量的下一个待连接氨基酸和5倍摩尔量的2-(1H-苯并三唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、5倍摩尔量的1-羟基-苯并三氮唑(HOBt)和10倍摩尔量的二异丙基乙胺(DIPEA)混合反应3分钟后加入到树脂中，反应2小时后，过滤洗去溶剂。重复此步骤直至完成肽链连接。
7、权利要求4和权利要求6中肽链从树脂上切落的方法包括：
将氢氧化钠或四丁基氢氧化铵溶解在DMF和水的混合溶剂中，配制成0.5％～0.8％的浓度，将配制好的溶液加入到固相反应器中与树脂混合，反应2小时，过滤，滤液中加入饱和柠檬酸溶液中和至中性，加入乙酸乙酯提取其中的物质，减压彻底除去溶剂，得到侧链保护基全保留的肽链。
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