CN101437838A - 用于从树脂上释放保护的肽的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于将肽从固相载体树脂上裂解的组合物和方法。使用在与水混溶的有机溶剂中的盐酸来裂解肽－树脂连接键。任选地，可以向该裂解组合物加入三氟乙醇或六氟异丙醇来改良结果。当使用本发明的裂解组合物时，不必在裂解反应后进行除去羧酸副产物的蒸发或其它步骤。当将树脂从该裂解混合物滤除后，所述肽可立即用水沉淀。

Description

用于从树脂上释放保护的肽的组合物和方法

发明背景

本发明涉及肽合成以及，特别是，涉及固相肽合成，或涉及固相和液相肽合成的组合。文献中描述了肽合成的许多方法(例如，参见U.S.Pat.No.6,015,881；Mergler等人(1988)Tetrahedron Letters 29：4005-4008；Mergler等人(1988)Tetrahedron Letters 29：4009-4012；Kamber等人(eds)，Peptides，Chemistry and Biology，ESCOM，Leiden(1992)525-526；Riniker等人(1993)Tetrahedron Letters 49：11065-11133；和Andersson等人(2000)Biopolymers 55：227-250)。

在固相肽合成(SPPS)中，将氨基酸或肽基团结合(bound)至固相载体树脂(solid support resin)上。相继将氨基酸连接至该载体-结合的肽上，直到形成所需的肽。当形成所需的肽后，将其从树脂上裂解(cleaved)下来。这需要裂解该肽和树脂之间的连接键(attachment)，并随后使用合适的回收技术回收裂解下来的肽。

合成的肽中的氨基酸趋向于具有活性的侧链以及活性末端。当合成肽时，最重要的是一个肽上的氨基与另一个肽上的羧基反应。不需要的侧链基团的反应或在反应产物的错误的末端的反应产生了不需要的副产物。为了减少副反应，实践中通常将反应物的活性侧链基团和末端封闭(block)，从而确保所需的反应发生。

例如，典型的固相合成方案涉及通过第一个氨基酸的羧基部分，将第一个氨基酸连接至载体树脂上(虽然有一些合成方案通过氨基连接第一个氨基酸)。这使得树脂连接的氨基酸的氨基可以与其它氨基酸偶合。因此，新的氨基酸的羧基部分与树脂连接物质的游离氨基反应。为了避免与该新的氨基酸的氨基反应，在偶合反应期间使用保护基团将其氨基保护。两种已知的氨基保护基团为叔丁基氧基羰基(BOC)基团和9-芴甲基氨甲酸酯(9-fluorenylmethyl carbamate)(FMOC)基团。在文献中也已描述了许多其它的方法。偶合后，可将树脂连接的肽的N-端上的保护基团(通常为BOC或FMOC)除去，使得其它的氨基酸以相似的方式加入，从而使链增长。氨基酸反应物和树脂连接的肽的活性侧链基团也可使用侧链保护基团保护，并在整个合成期间维持封闭。

合成后，可从肽产物上除去一些或者所有的侧链保护基团。当基本上除去所有的保护基团时，这称为完全脱保护。完全脱保护可随着裂解同时发生，或者也可在之后进行，如果该肽还需要进一步处理、修饰、偶合至其它肽或其它物质等时。一些裂解试剂不仅将肽从载体树脂上裂解下来，而且同时会造成完全脱保护的发生。例如，与BOC化学相关的强酸裂解试剂易于在裂解的同时造成完全脱保护。然而，使用FMOC策略将肽从树脂上裂解下来，而侧链保护基团得到保持，从而进一步反应(如片段缩合)可以进行而基本上不受侧链基团的干扰。因此，该肽以保护的状态被裂解下来。

典型地，通过固相肽合成合成的肽的产率随着肽链长度的增加而降低，即，肽链越长，随着所需肽的不需要的副反应发生的概率越大。因此，对于特别长的肽，最终肽产物是以片段制备的，其然后结合以形成所需的肽产物。例如，假设75个氨基酸的肽可以三个肽片段来合成，每个肽片段分别通过固相肽合成来合成。由氨基酸1-25、氨基酸26-50和氨基酸51-75组成的片段可分别合成，然后在片段缩合步骤中结合以形成完整的75个氨基酸的最终的肽产物。

将以保护状态的肽从树脂载体上裂解的现有方法通常产生带有羧酸的副产物。羧酸会干扰随后的片段缩合反应，产生不需要的副产物。现有方法通过下述方法解决了该问题：其在裂解后通过额外的步骤，通常通过裂解溶液的蒸发，来除去不需要的羧酸。此额外的步骤和所需的溶剂造成了额外的时间、费用，以及产生了需要处理的废物，这又造成了另外的费用。因此，需要一种更加容易、便宜和有效的将肽从树脂上裂解的方法，其通过避免不需要的羧酸副产物的产生，且从而避免了随后的除去羧酸的步骤。

发明概述

本发明提供了将肽从固相载体树脂上裂解的组合物和方法。使用在与水混溶的有机溶剂中的盐酸来裂解肽-树脂连接键。任选地，可将三氟乙醇或六氟异丙醇加至该裂解组合物以改良结果。当使用本发明裂解组合物时，在裂解反应后不必进行蒸发或其它步骤以除去羧酸副产物。当将树脂从裂解混合物中过滤出来后，此肽可立即用水沉淀。

发明内容

本发明提供了将肽从固相载体树脂上裂解的组合物和方法，其省略了在肽片段的缩合前从裂解混合物中除去羧酸的随后步骤的必要，而该步骤是使用现有技术的组合物和方法是所需的。本发明可提供处理时间减少、产率和纯度增加、试剂量、起始原料、溶剂、废物的减少，以及其它小规模和大规模肽合成中都相关的改良。根据本发明制备的肽可通过本领域中已知的方法合成，并且本发明不限于任何特定的合成方法。任何肽都可根据本发明来制备。

FMOC合成策略的优点为合成的肽可以从固相载体树脂上以基本上完全保护的状态除去，即，该侧链保护基团保持在肽上。这是由于肽与树脂的连接键酸的敏感性比侧链保护基团的连接键的敏感性相对较强，后者需要较强的酸来将它们从肽上除去。因此，可以使用相对较低浓度的酸来将肽从树脂上裂解下来，同时仍使得侧链保护基团得到保持，因为该酸溶液并没有强到能够裂解这些基团的程度。典型地，使用2-氯三苯甲基氯树脂以利于这些优点，因为2-氯三苯甲基氯化物(2-chlorotrityl chloride))树脂和肽之间的连接是相对酸敏感的。然而，可以使用其它的树脂。尽管本发明描述了相关的FMOC肽合成策略，其它的固相肽合成策略和体系可以与本发明组合使用。该FMOC策略仅仅为大规模合成肽的优选方式。

通常，在本发明前，当在固相载体树脂上合成所需的肽时，使用乙酸(AcOH)或三氟乙酸(TFA)于溶剂如二氯甲烷(DCM)中的溶液来将该肽从树脂上除去。然而，使用AcOH或TFA来裂解肽在裂解混合物中产生羧酸副产物。如果不除去，这些羧酸会干扰随后的反应，如片段缩合反应，其中两个或多个肽片段结合在一起。因此，在合成步骤中需要额外的步骤来除去该羧酸。这通常通过将裂解混合物的蒸发后重构来实现。此额外的步骤需要更多的时间、溶剂、消耗、费用，并且可降低产率和纯度。此外，并不能完全除去该羧酸。因此，通常存在痕量的羧酸，其可降低最终肽产物的纯度。

本发明通过使用新的裂解试剂和方法，基本上消除了羧酸副产物的产生以及除去羧酸的耗钱和耗时的步骤，该步骤在现有技术的方法中是必须的。在一个实施方案中，该裂解试剂为在与水混溶的有机溶剂中的相对低浓度的盐酸(HCI)。与水混溶的有机溶剂的实例为二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)和二噁烷。然而，许多其它的与水混溶的有机溶剂为本领域中已知的。较广浓度范围的HCl会有效地将肽从树脂上裂解下来，且所有的都在本发明的范围内。然而，在优选约0.05N至约0.5N的HCl，最优选约0.1N的HCl的具体范围内，已经得到了最好的结果。

在本发明的另一实施方案中，本发明的裂解试剂还包括氟化的醇(fluorinated alcohol)，其包括但不限于三氟乙醇(TFE)或六氟异丙醇(HFIP)。该氟化的醇优选为裂解试剂的约1％至约12％，更优选约5％至约10％，且最优选约10％。本发明人已经发现了每克树脂约2mL至22mL的试剂，优选每克树脂约4mL至10mL的试剂，且更优选每克树脂约4mL至6mL的试剂足够将肽从树脂上裂解下来。然而，其它量的裂解试剂也可能有效地将肽从树脂上裂解下来。

如上所述，因为当使用本发明裂解试剂和方法时基本上不产生羧酸副产物，不需要除去羧酸副产物的蒸发步骤。因此，利用本发明可形成几个中间体肽片段(intermediate peptide fragments)，然后在片段缩合步骤中结合这几个片段。本发明的一个实施方案的特征为在裂解之后不用蒸发。裂解后，可将该裂解混合物过滤以除去树脂，并任选地用溶剂洗涤。由此得到的滤液简便地用水处理以沉淀肽片段，然后将其过滤并任选地用水洗涤。优选地使用冷水来沉淀所述肽，优选在约0℃至约25℃的范围内，最优选约0℃。然而，较温的水也会有效地将肽从裂解滤液中沉淀出来。本发明人已经发现每克树脂-肽至少约4mL的水会有效地沉淀已裂解的肽，尽管其它量也可能有效。

实施例：

下列实施例简要地描述了利用本发明的肽的合成。尽管实施例描述了恩夫韦地(enfuvirtide)的合成，但是描述的原理可应用至任何肽上，优选任何保护的肽，其在酸不稳定的载体上合成，该载体如氯三苯甲基氯化物(CTC)树脂、Sieber树脂或Rink树脂。此类肽的非限制性实施例包括普兰林肽(pramlintide)、艾塞那肽(exenatide)、恩夫韦地、降钙素(calcitonin)和PYY-3-36。下列实施例仅仅为制备恩夫韦地的优选方法，并不意味着以任何方式对其限制。

FMOC-氨基酸在CTC树脂上的负载(loading)：

1.通用方法

将在DCM或DMF+DCM(4:1)中的含有DIEA(1至1.7mole eq.)的FMOC氨基酸(0.8至1.5mole eq.)溶液加至预-溶胀的CTC树脂(1mole eq.)中，并在氮气流下摇动2小时。将其排干，并与MeOH+DIEA(9:1)混合物摇动20-30分钟以破坏树脂上过量的活性氯化物。将该树脂过滤，用DMF(1x 3min.)，DCM(1 x 3 min.)，IPA(2 x 3 min.)洗涤，并干燥至恒重。负载的氨基酸的取代密度由增重方法和DBU分析方法来确定。

2.片段-1：AC-AA(1-16)-CTR的合成

该合成在250ml反应器中，使用17.5g的FMOC-Gln-CTR(sub.＝0.60mm/g)以及使用基于FMOC的SPPS来手工进行。FMOC-基团使用20％的哌啶的NMP(2 x 20min.)溶液来除去，且所有的FMOC-氨基酸的偶合通过HBTU/HOBT方法，在DIEA(1.5eq.各自)的NMP+DCM(3:1)的溶液存在下进行，除了在位置15的FMOC-GIn(Trt)，其使用2.5摩尔当量的试剂来进行。所有的氨基酸通过一次偶合引入，除了Asn(trt)14，GIn(trt)13和Ser(tBu)12需要两次偶合。当除去最后一个氨基酸的FMOC基团后，将该树脂用5摩尔当量的乙酸酐和吡啶的NMP溶液处理1小时，从而将乙酰基引入至N-端。完全保护的肽-树脂的产量为34.9g(72.8％)，理论产量为48g。根据HPLC，该肽的纯度>89.1％(在262nm处)。

3.片段-2：FMOC-AA(17-26)-CTR的合成

合成起始使用25g的FMOC-Leu-CTR(sub.＝0.8mm/g)，并利用HBTU/HOBT(1.5mole eq.)偶合方法来进行。所有的氨基酸(1.5mole eq.)通过一次偶合，使用NMP+DCM(3:1)作为偶合溶剂且DIEA(1.5mole eq.)作为碱来引入。偶合的完成通过Kaiser测试来监测。FMOC基团的除去使用20％的哌啶的DMC溶液(2 x 20min.)来实现。保护的肽基(peptidyl)树脂的产量为58.7g(93.4％)，理论产量为62.9g。根据HPLC，该肽的纯度>97.1％(在262nm处)。

4.片段-3：FMOC-AA(27-35)-CTR的合成

合成起始使用37.5g的FMOC-Trp(BOC)-CTR(sub.＝0.7mm/g)，利用HBTU/HOBT偶合方法，在作为溶剂的NMP+DCM(3:1)中进行。所有的氨基酸通过一次偶合来偶合，除了最后一个氨基酸FMOC-Asp(otBu)偶合两次(2x2小时)，然后乙酰化。对于偶合使用1.5倍过量的氨基酸和试剂，且偶合的完成通过Kaiser方法监测。肽树脂的产量为73g(89.3％)，理论产量为81.8g。根据HPLC，该肽的纯度>80.65％(在220nm处)。

5.保护的片段从载体上的裂解

a.片段-1：Ac-AA(1-16)-OH的裂解

将10.0g(2mm)的Ac-AA(1-16)-CTR与100ml的0.1 N HCl的DMF溶液在室温下一起搅拌4.5小时，过滤后，用DMF洗涤。将合并的滤液加至0℃的搅拌的水中，将沉淀的固体过滤后，然后用水洗涤，并干燥，得到5.62g(78.5％)的保护的肽，理论产量为7.2g。根据HPLC，纯度>85.64％(IPA体系)。当使用含有10％的TFE的0.1 N HCl的DMF溶液裂解肽树脂时，该保护的肽的产率为92％，HPLC纯度>96.86％(IPA体系)。

b.片段-2：FMOC-AA(17-26)-OH的裂解

将保护的肽树脂(5g，1.7mm)样品用50ml的0.1 N HCl的DMF溶液摇动4.5小时，过滤，然后用DMF洗涤。将该滤液加至0℃的搅拌的水中，且将沉淀的固体过滤，用水洗涤，并干燥，得到2.9g(74.2％)保护的肽。根据HPLC，该肽的纯度>90.1％(ACN体系)和>81％(IPA体系)。当使用含有10％的TFE的0.1N的HCl的DMF溶液来裂解该肽树脂时，肽的产率为91.6％，HPLC纯度>96.66％(IPA体系)。

c.片段-3：FMOC-AA(27-35)-OH的裂解

将2.5g(0.8mm)的肽基树脂样品与含有10％ TFE的25ml的0.1 N HCl的DMF溶液在室温下一起搅拌4.5小时，并过滤。将该滤液加至0℃的搅拌的水中，并通过过滤收集得到的固体，然后用水洗涤。干燥过夜后，得到72.4％(1.28g)的所需肽，HPLC纯度为84％。当使用含有5％ TFE的0.1 NHCl的DMF溶液来裂解肽树脂时，保护的肽的产量为67.9g(1.2g)，纯度为88.2％。

6.通过在溶液中片段缩合来合成保护的恩夫韦地

a片段-3与Phe-NH2的偶合至FMOC-AA(27-36)-NH2

将片段-3(2.62g，1eq.)，Phe-NH2(0.24g，1.2eq.)和HOAT(0.2g，1.2eq.)的混合物使用30ml的DMF在DIEA(0.43ml；2.1eq.)的存在下搅拌，该溶液在0℃下用HBTU(0.55g，1.2eq.)处理15-20分钟，然后在室温下处理70-80分钟。反应的进程通过TLC(CM-10)和HPLC监测。将反应混合物在0℃下冷却，并用20-30ml水处理，将析出的无色固体过滤，然后用水洗涤，干燥，得到2.76g(98.6％)的FMOC-AA(27-36)-NH2。根据HPLC，该肽的纯度>88.15％。将该实验重复几次，产率范围为97-100％，纯度介于82.6-88.2％之间。

b.FMOC-AA(27-36)-NH2脱保护为H-AA(27-36)-NH2片段-4

将FMOC-AA(27-36)-NH2(1.16g，0.5mm)于5ml的5％的哌啶的DMA溶液在室温下搅拌2小时，然后随着搅拌用15ml水在0℃下稀释。将该析出的无色固体过滤，然后用水洗涤，并干燥。其用乙醚和己烷洗涤(各一次)，得到0.91g(86.7％)的产物，HPLC纯度为85.85％(ACN体系)。

c.片段-2和4偶合至F-AA(17-36)-NH2

[A]HBTU/HOAT方法

将片段-2(1.80g，0.8mm，1eq.)，片段-4(1.68g＝0.8mm)，HBTU(0.3g，0.8mm)和HOAT(0.16g，1.2mm，1.5eq.)于含有DIEA(0.2ml，1.2mm)的23ml DMF中的溶液在0-5℃下搅拌15-20分钟，室温下搅拌2小时，反应的进程通过CMA(90:8:2)中的TCL和HPLC监测。其用23ml的冷水在0-5℃下处理，搅拌30分钟后，过滤，然后用水洗涤，干燥，得到3.53g(101.2％)的产物，纯度为79.4％。用95％ IPA/H2O重结晶后，产率为74.5％，纯度为89.96％。其含有痕量的片段-2(0.24％)和片段-4(0.15％)(IPA体系)。

[B]TBTU/HOAT方法

偶合反应在DMA溶剂中使用TBTU以如上述相同的摩尔比例进行，产量为3.56g(101.95％)，纯度为70.2％。使用95％ IPA/H2O重结晶后，产率为74.5％(2.6g)，HPLC纯度为88.4％(IPA体系)。

将其使用哌啶(10eq.)的DMA溶液脱保护，并用水分离，得到93.3％的产物，HPLC纯度为85.3％(IPA体系)。

d.片段-1与H-AA(17-36)-NH2偶合至保护的恩夫韦地

将片段-1(0.4g，1eq.)，HOAT(0.03g，1.5eq.)和DIEA(0.03ml，1.5eq.)于8ml DMA中搅拌至得到澄清溶液，然后在0.5℃下搅拌。加入TBTU(0.04g，1eq.)，并将该溶液在0℃下搅拌15-20分钟，然后加入H-AA(17-36)-NH2(0.5g，1eq.)于DMA中的溶液，继续在0℃下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌2小时。加入0℃的冷水(～15ml)，过滤沉淀的固体，然后用水洗涤，干燥，得到保护的恩夫韦地，产率为97.3％(0.9g)，HPLC纯度>66.93％(IPA体系)。使用95％ ACN/H2O重结晶后，该肽的产率为55.3％，纯度>72.8％。(方案-1)

7.片段的原位偶合

a.F-AA(27-35)-OH从其CTC树脂上的释放

将5.0g(1.62mm)的FMOC-AA(27-35)-CTR与25ml的0.1N的HCl的DMF溶液搅拌4小时，过滤，然后用10ml的DMF洗涤一次。FMOC-AA(26-35)-OH的DMF溶液的总的体积＝35ml(1.62mm，假定)。

b.FMOC-AA(27-36)-NH2)H.AA(27-36)-NH2的制备

将上述溶液(来自于步骤#1)在0℃下搅拌，并用DIEA中和至pH～7。加入1.2倍过量的Phe-NH2(0.32g，1.94mm)，HOAT(0.26g)，HBTU(0.74g)和2.1倍过量的DIEA(0.6ml，3.4mm)，将该混合物在0℃下搅拌0.5小时，在室温下搅拌2小时。反应的完全通过TLC(CM-10)监测。完全后，加入DBU(10eq.)，并继续搅拌另外2小时，脱保护的进程通过TLC(CM-10)和HPLC监测。

c.FMOC-AA(17-26)从载体上的释放以及其与H-AA(27-36)-NH2偶合至FMOC-AA(17-36)-NH2→H.AA(17-36)-NH2

将4.7g(1.62mm)的FMOC-AA(17-26)-CTR与25ml的0.1N的HCl的DMF溶液搅拌4小时，过滤，然后用10ml的DMF洗涤(总体积＝35)，将该溶液在0℃下搅拌。其用H-AA(27-36)-NH2(步骤#2)的溶液处理，并将该混合物的pH调节至7。加入HOAT，HBTU(1mole eq.各自)和DIEA(1.8mole eq.)，并将该混合物在0℃下搅拌0.5小时，在室温下搅拌2小时至过夜。反应的进程通过TLC(CM-10)和HPLC监测。完全后将混合物用DBU(10eq.)处理2小时以除去N-端FMOC基团(混合物体积＝70ml)。将其在0℃下中和至pH～7，以在下一反应中使用。

d.Ac-AA(1-16)-OH从载体上的释放及其与H-AA(17-36)-NH2偶合至AC-AA(1-36)-NH2

将8.3g(1.62mm)的AC-AA(1-16)-CTR用40ml的0.1N的HCl的DMF溶液如上所述裂解4小时，在℃下将过滤的溶液的pH调节至7。然后将其用HOAT(1.5eq)，DIEA(1.5eq.)和HBTU(1eq.)依次处理，在0℃下搅拌15-20分钟后，加入该脱封闭(deblocked)的溶液(步骤#3)，并继续在0℃下搅拌0.5小时，室温下搅拌2小时至过夜。然后将其加至搅拌的水中(～300ml)，同时固体沉淀出来。搅拌1小时后，过滤固体，并用水洗涤，干燥。该干燥的固体用己烷洗涤，得到10.9g(91.2％)的产物。根据HPLC，产物纯度仅为32.71％，含有大约26％的未反应的片段-1。

因此，使用50％量的H-AA(17-36)-NH2，HOAT，DIEA和HBTU再进行反应，并按通常后处理，得到13.2g(110％)的产物。根据HPLC，该肽的纯度为45.7％。

当0℃搅拌的于DMF溶液中的分离的片段-1(0.98g，0.3mm)与于DMF溶液中的分离的FMOC-AA(17-36)-NH2(1.31g，0.3mm)的DBU脱FMOC的且中和的溶液，在1.5摩尔当量的HOAT，DIEA和1摩尔当量的HBTU的存在下缩合时，该产物的分离产率为91.9％(2g)，HPLC纯度>62.1％。

以类似的方式，当分离的H-(17-36)-NH2与未分离的片段-1偶合时，该肽的产率和纯度分别为95.7％和33.6％。

Claims (25)

1.组合物，其用于在固相肽合成期间将包含侧链保护基团的肽从树脂上裂解，所述组合物包含：

a.与水混溶的有机溶剂；和

b.0.05N至0.5N的盐酸；

其中所述组合物将所述肽从所述树脂上裂解下来，而不除去所述的侧链保护基团。

2.权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含：

c.约1％至约12％的氟化的醇。

3.权利要求2的组合物，其中所述氟化的醇包括三氟乙醇或六氟异丙醇。

4.权利要求2的组合物，其中所述组合物包含0.1N的盐酸。

5.权利要求3的组合物，其中所述组合物包含5％至10％的三氟乙醇。

6.权利要求3的组合物，其中所述组合物包含约10％的三氟乙醇。

7.权利要求3的组合物，其中所述组合物包含约5％至约10％的六氟异丙醇。

8.权利要求3的组合物，其中所述组合物包含约10％的六氟异丙醇。

9.权利要求2的组合物，其中所述与水混溶的有机溶剂包括二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、二甲亚砜、四氢呋喃或二噁烷。

10.权利要求2的组合物，其中所述与水混溶的有机溶剂包括二甲基甲酰胺。

11.权利要求2的组合物，其中当使用该组合物裂解肽时，基本上没有羧酸副产物产生。

12.组合物，其用于在固相肽合成期间将包含侧链保护基团的肽从树脂上裂解，所述组合物包含：

a.二甲基甲酰胺；

b.约0.1N的盐酸；和

c.约10％的六氟异丙醇；

其中所述组合物将所述肽从所述树脂上裂解下来，而不除去所述的侧链保护基团。

13.一种固相肽合成的方法，其包括：

a.通过将组合物作用于该树脂-肽连接键，将树脂连接的中间体肽片段从树脂上裂解下来，所述组合物包含：

与水混溶的有机溶剂；

05N至0.5N的盐酸；和

约1％至约12％的氟化的醇，

从而产生包含非-树脂连接的中间体肽片段的裂解混合物；

b.通过用水处理所述裂解混合物，沉淀所述中间体肽片段；和

c.结合至少两个中间体肽片段；

其中，所述固相肽合成的方法并不需要在树脂-肽裂解反应和结合至少两个中间体肽片段的反应之间进行蒸发步骤。

14.权利要求13的方法，其中所述盐酸为0.1N的盐酸。

15.权利要求13的方法，其中所述氟化的醇包括三氟乙醇或六氟异丙醇。

16.权利要求15的方法，其中所述组合物包含5％至10％的三氟乙醇。

17.权利要求15的方法，其中所述组合物包含约10％的三氟乙醇。

18.权利要求15的方法，其中所述组合物包含约5％至约10％的六氟异丙醇。

19.权利要求15的组合物，其中所述组合物包含约10％的六氟异丙醇。

20.权利要求15的组合物，其中所述与水混溶的有机溶剂包括二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、二甲亚砜、四氢呋喃或二噁烷。

21.权利要求20的方法，其中所述与水混溶的有机溶剂包括二甲基甲酰胺。

22.权利要求15的方法，其中在裂解期间，每克树脂-肽用约2ml至约22ml的组合物处理该树脂-肽。

23.权利要求15的方法，其中在裂解期间，每克树脂-肽用约4mL至约10mL的组合物处理该树脂-肽。

24.权利要求15的方法，其中在裂解期间，每克树脂-肽用约4mL至约6mL的组合物处理该树脂-肽。

25.权利要求15的方法，其中在沉淀该中间体肽片段期间，每克树脂-肽用约4mL水处理该裂解混合物。