CN101624349B - 一种丝氨酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于有机化学技术领域，具体涉及一种丝氨酸的制备方法。以胱氨酸或半胱氨酸为原料，经羧酸酯化、氨基保护得到N-保护的半胱氨酸酯，该N-保护的半胱氨酸酯经卤化得到N-保护的卤代丙氨酸酯，后者经碱水解得到丝氨酸。本发明方法具有反应条件温和、易操作、收率高、成本低、生产设备简单、适合工业化的优点。

Description

一种丝氨酸的制备方法

技术领域

本发明属于有机化学技术领域，具体涉及一种丝氨酸的制备方法。

背景技术

丝氨酸属于非必须氨基酸，具有许多重要的生理功能和作用，因此，在医药、食品、化妆品中均有较为广泛的应用。其制备方法主要有蛋白质水解提取法(水解损失率较高，水解设备腐蚀严重，环境污染严重，水解所得的氨基酸是混合氨基酸，还须进一步分离、精制，这又增加了生产操作的复杂性，成本高)、发酵法(日本用以甘氨酸、甘油酸为前体发酵生产L-丝氨酸，但此法对设备要求较高，产酸率一般较低，分离困难，后处理麻烦，提取率低，因而成本高、价格较贵)、酶法(酶法生产虽然具有工艺简单、周期短、耗能低、专一性强、收率高等特点，但要将它们应用于工业化生产，还需要进一步研究。如何获得廉价的合成底物和酶源是这一方法能否成立的关键)和化学合成法(化学合成法最大的优点是可采用多种化学原料，多种工艺路线，生产规模大，产品易分离提纯。但是此法最大的缺点是：所用原料成本较高、毒性较大，得到的都是DL-丝氨酸，因此都必须进行拆分，才能得到L-型氨基酸，这无形中又增加了成本，且拆分过程只用了一半的氨基酸)。

以前曾有专利CN 1609097报道以胱氨酸为原料，通过酯化、卤代、皂化得到丝氨酸的方法。但该法使用了氯气——几乎每年我国都会发生若干起泄漏事件的主角，如重庆天原化工总厂、杭州电化基团、齐齐哈尔市化学制药厂、上海嘉定分子筛器厂、湖北东风造纸厂等均发生过不同程度的氯气泄漏事故。

发明内容

本发明的目的在于克服现有制备丝氨酸方法的如上所述的局限性，以价廉易得的半胱氨酸(1)或胱氨酸(2)为原料，通过简单、易操作、对设备要求简单、收率高、成本低、易于工业化生产的办法。

本发明的具体步骤如下：

其中，R基团为甲基(-CH₃)、乙基(-CH₂CH₃)、正丙基(-CH₂CH₂CH₃)、异丙基(-C(CH₂)HCH₃)、正丁基(-CH₂CH₂CH₂CH₃)、叔丁基(

)、环己基(

)、苄基(Bn-)；保护基团P为叔丁氧羰基(Boc-)、苄氧羰基(Cbz-)、芴甲氧羰基(Fmoc-)、乙酰基(CH₃CO-)、苯甲酰基(C₆H₅CO-)；X为氯(Cl-)、溴(Br-)。

首先，以半胱氨酸(1)为原料参照Cowling等的专利(US 3884761)、Benoiton等(Can.J.Chem.1968，46，1549-1552)的方法首先进行羧基的酯化制备半胱氨酸酯，然后再参照Threadgill等(J.Org.Chem.1989，54，2940-2949)、Olsen等(J.Org.Chem.1985，50，4332-4336)Carpino等(J.Org.Chem.1972，37，3404-3409)、kRajewski等(Bioorg.Med.Chem.Lett.2003，13，3203-3205)、Kelleman等(Biopolymers 2003，71，686-695)的方法对氨基进行保护，由此制备N-保护的半胱氨酸酯(3)。

或者以胱氨酸(2)为原料参照Cowling等的专利(US 3884761)、Benoiton等(Can.J.Chem.1968，46，1549-1552)的方法进行羧基酯化制备胱氨酸二酯，然后再参照Threadgill等(J.Org.Chem.1989，54，2940-2949)、Olsen等(J.Org.Chem.1985，50，4332-4336)、Carpino等(J.Org.Chem.1972，37，3404-3409)、Krajewski等(Bioorg.Med.Chem.Lett.2003，13，3203-3205)、Kelleman等(Biopolymers 2003，71，686-695)的方法对氨基进行保护得到N，N’-双保护的胱氨酸二酯，然后再参照Swali等(Tetrahedron 2002，58，9101-9109)方法还原二硫键得到N-保护的半胱氨酸酯(3)。

在成功得到N-保护的半胱氨酸酯(3)之后，我们以3为原料，以Ph₃P+NXS的复合物为卤化试剂，在CH₂Cl₂中，室温搅拌条件下进行了卤化反应，成功制备中间体N-保护的卤代丙氨酸酯(4)。详细的反应条件研究表明卤化试剂为Ph₃P+NXS或者Ph₃P+CCl₄均可，其中Ph₃P与NXS或CCl₄二组分的摩尔比为1∶0.9～1.1，溶剂为CH₂Cl₂、CHCl₃、或CCl₄；反应原料3与反应溶剂比例为1mmol∶5～15mL；反应条件为室温～回流条件温度；反应时间为4～48小时；反应收率为39.0-84.7％。

最后将上述制备的N-保护的卤代丙氨酸酯(4)置于适当的碱水溶液中，加热回流，待反应完成后，冷却反应液，加入稀盐酸将反应液直接酸化为pH＝6.0，加入等体积的乙醇沉淀，所得沉淀即为丝氨酸。本反应所用碱的种类为NaOH、KOH、Na₂CO₃等，碱液浓度为1～3mol/L，反应温度为90～120℃，反应时间为10～15小时，反应收率56.5～89.3％。

本发明采用价廉易得的半胱氨酸(1)或胱氨酸(2)为原料，通过简单的反应得到N-保护的半胱氨酸酯(3)，后者经卤化得到N-保护的卤代丙氨酸酯(4)，4经碱水解制备丝氨酸。

与现有方法比较，本发明反应原料来源丰富易得，反应操作简单，收率高，后处理简单，成本低，适于工业化生产。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，但实施例并不限制本发明的保护范围。

实施例1：

将3.00g半胱氨酸盐酸盐置于配有回流冷凝管的三颈圆底烧瓶中，加入20mL无水甲醇，搅拌使之溶解，快速导入干燥的HCl气体，使翻腾鼓泡，加热回流1.5小时。反应结束后，将混合物减压蒸馏，除去过量的甲醇。当甲醇挥发至反应体积的约1/4时，在0℃冷冻结晶。粗品用甲醇重结晶，干燥得半胱氨酸甲酯盐酸盐2.45g，白色结晶，熔点：136-142℃，收率75.0％。

将上述制得的半胱氨酸甲酯盐酸盐1.72g悬浮于20mL CH₂Cl₂中，搅拌成浆状后缓慢滴入1.39mL Et₃N，搅拌10min后，加入2.18g Boc₂O，反应混合物在N₂保护下搅拌16小时，然后用水、饱和NaHCO₃、水、饱和食盐水依次洗涤，最后用Na₂SO₄干燥，浓缩蒸去溶剂得N-Boc保护的半胱氨酸甲酯2.29g，无色油状液体，收率97.0％。

在N₂气氛围下，将1.1mmol NXS溶解于10mL CH₂Cl₂中，然后加入1.1mmol PPh3，再加入1.0mmol的上述制备的N-Boc保护的半胱氨酸甲酯，室温搅拌反应。待反应完毕，过滤除去固体。母液浓缩干，柱层析分离得到产物。当NXS为NBS时产物为Boc-β-bromo-Ala-OMe(收率39.0％)：白色固体，熔点：48-50℃， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=+21.3$ (c＝1.3，CHCl₃)。¹H NMR：δ5.40(1H，NH)，4.75(1H，m)，3.83(1H，m)，3.80(3H，s)，3.71(1H，dd，J＝9.2，3.0Hz)，1.46(9H，s).ESIMS(positive mode)：m/z 304([M⁷⁹ _Br+Na]⁺)，306([M⁸¹ _Br+Na]⁺).IRv_max：3436，2928，1717，1632，1502，1369and 1166cm^-1.当NXS为NCS时产物为Boc-β-chloro-Ala-OMe(收率83.0％)：白色固体，熔点：59-60℃， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=+39.2$ (c＝0.5，CHCl₃)(Lit^[25] ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{21}=+37.8$ (c＝1.5，CHCl₃).¹HNMR：δ5.42(1H，NH)，4.71(1H，m)，3.97(1H，dd，J＝11.1，2.0Hz)，3.85(1H，dd，J＝11.1，2.8Hz)，3.81(3H，s)，1.46(9H，s).ESIMS(positive mode)：m/z 260([M³⁵ _Cl+Na]⁺)，262([M³⁷ _Cl+Na]⁺).IRv_max：3436，2980，1716，1634，1508，1369，1167and 1064cm^-1.

将上述制备的N-Boc保护的半胱氨酸甲酯1mmol置于配有回流冷凝管的圆底烧瓶中，加入5ml的NaOH(2mol/L)溶液，搅拌、加热回流12小时，反应完毕后，冷却至室温，加入1mol/L的HCl溶液，调节pH至6.0，加入等体积无水乙醇使沉淀完全，过滤，收集固体即为丝氨酸。当以Boc-β-chloro-Ala-OMe为原料时，收率89.3％；当以Boc-β-bromo-Ala-OMe为原料时，收率62.5％。熔点：220℃(dec.)， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-6.4$ (c，0.51，H₂O).IR：v_max(cm^-1)＝3445，3092，2041，1599，1500，1470，1411，1384，1342，1304，1126，1086，1013，918，853，804，611and 526；¹H-NMR(600MHz，D₂O)：δ3.87(1H，dd，J＝12.3，3.8Hz，3-Ha)，3.83(1H，dd，J＝12.3，5.6Hz，3-Hb)，3.73(1H，dd，J＝4.7，3.9Hz，2-H).

实施例2：

将600mL无水乙醇置于1000mL的三颈瓶中，冰盐浴冷却至-5℃左右，边搅拌边滴加新蒸二氯亚砜29mL，然再加入胱氨酸24g，搅拌30min，升至室温再搅拌30min，然后回流约20小时，L-胱氨酸全部溶解，溶液变得透明澄清。自然冷却至室温，有大量白色晶体析出，放置一夜，然后过滤干燥得白色晶体26.9g。母液浓缩并用乙醚沉降得白色固体7.9g，共得胱氨酸二乙酯二盐酸盐34.8g，熔点：178-181℃，收率94.6％。

将上述制得的胱氨酸二乙酯二盐酸盐1.85g溶于100mL水中，搅拌，冰盐浴冷却至0℃，然后缓慢加入1.68g NaHCO₃，向此溶液中滴入苄氯2.15mL，反应体系维持在0℃，搅拌1小时，然后升至室温搅拌反应5小时。反应混合物用EtOAc萃取(4×30mL)，合并萃取液，并依次用水、饱和食盐水洗涤，并用Na₂SO₄干燥。减压浓缩除去溶剂，所得白色固体用乙酸乙酯和石油醚重结晶得2.42g白色晶体，熔点：78-80℃，收率86.0％。

将563mg N-苄氧羰基保护的胱氨酸乙酯溶于5mL HOAc和25mL乙醚的混合液中，冰盐浴冷却，然后分批加入1.95g锌粉，N₂保护下升至室温，搅拌反应，36小时后，反应混合物过滤，并用5％HOAc的乙醚溶液洗涤滤渣，然后减压浓缩，残余物溶解于20mL 1mol/L的HCl中，乙酸乙酯萃取(3×15mL)，合并有机层，用水、饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥。浓缩得油状N-苄氧羰基保护的半胱氨酸乙酯。

在得到N-苄氧羰基保护的半胱氨酸乙酯后，按照实施例1中的方法制备卤代丙氨酸酯。当NXS为NCS时产物为Z-β-chloro-Ala-OEt(收率84.7％)：白色固体，熔点：55-56℃， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=+32.8$ (c＝0.5，CHCl₃)。¹H NMR：δ7.31-7.37(5H，m)，5.68(1H，d，J＝5.8Hz)，5.14(2H，s)，4.74(1H，m)，4.22-4.30(2H，m)，3.99(1H，dd，J＝11.0，2.4Hz)，3.89(1H，dd，J＝11.0，2.8Hz)，1.30(3H，t，J＝7.2Hz).ESIMS(positive ion mode)：m/z 308[M³⁵ _Cl+Na]⁺，310[M³⁷ _Cl+Na]⁺.IR v_max：3331，2978，2926，1746，1693，1527，1350，1329，1269，1219，1074，1038，923，780，733，697，582and 522cm^-1.

将上述制备的Z-β-chloro-Ala-OEt 1mmol置于配有回流冷凝管的圆底烧瓶中，加入5ml的NaOH(2mol/L)溶液，搅拌、加热回流12小时，反应完毕后，冷却至室温，加入1mol/L的HCl溶液，调节pH至6.0，加入等体积无水乙醇使沉淀完全，过滤，收集固体即为丝氨酸，收率88.2％。

实施例3：

首先按照实施例2的方法制备胱氨酸二乙酯二盐酸盐，然后将185mg胱氨酸二乙酯二盐酸盐溶于3mL 1mol/L的Na₂CO₃水溶液中，加入1mL 1，4-二氧六环，搅拌，然后滴入Fmoc-Osu的1，4-二氧六环溶液(354mg Fmoc-Osu溶于3mL 1，4-二氧六环)，同时加入1mLCH₃CN，室温搅拌反应20小时，向反应体系中加入10mL水，然后用EtOAc萃取(3×15mL)，合并萃取液，并依次用饱和NaHCO₃、饱和食盐水洗涤，Na₂SO₄干燥。浓缩后，柱层析分离(石油醚∶丙酮＝5∶1)得N-Fmoc保护的胱氨酸二乙酯∶白色晶体，熔点：97-101℃，¹HNMR：δ7.75(2H，d，J＝7.6Hz)，7.59(2H，m)，7.38(2H，t，J＝7.4Hz)，7.29(2H，t，J＝7.4Hz)，5.72(1H，d，J＝7.0Hz)，4.66(1H，d，J＝6.0Hz)，4.36-4.42(2H，m)，4.21-4.24(3H，m)，3.20(2H，d)，1.29(3H，t，J＝7.2Hz).ESIMS(positive ion mode)：m/z 741[M+1]⁺，763([M+Na]⁺)，779([M+K]⁺)。

将296mg Fmoc-保护的L-胱氨酸乙酯溶于3mL HOAc和2mL CH₂Cl₂的混合溶液中，分批加入522mg锌粉，N₂保护下室温搅拌反应48小时，过滤，并用少量HOAc和CH₂Cl₂洗涤滤渣，减压浓缩干，然后溶解于20mL 0.5mol/L的HCl中，用EtOAc萃取(3×15mL)，合并有机层，分别用0.5mol/L HCl、水、0.5mol/L NaOH、水、饱和食盐水依次洗涤，无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩得N-Fmoc保护的半胱氨酸乙酯，白色固体290mg。m.p.：116-118℃，¹HNMR：δ7.77(2H，d，J＝7.4Hz)，7.61(2H，d，J＝6.4Hz)，7.41(2H，t，J＝7.4，7.2Hz)，7.32(2H，td，J＝7.2，2.2Hz)，5.68(1H，d，J＝6.6Hz)，4.64(1H，br，s)，4.42-4.44(2H，m)，4.23-4.28(3H，m)，3.00(2H，d)，1.31(3H，t，J＝6.8Hz)，ESIMS(positive ion mode)：m/z 394[M+Na]⁺.

在得到N-Fmoc保护的半胱氨酸乙酯后，按照实施例1中的方法制备卤代丙氨酸酯。当NXS为NBS时产物为Fmoc-β-bromo-Ala-OEt(收率71.0％)：白色固体，熔点：125-126℃. ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=+38.8$ (c＝0.1，CHCl₃)，¹HNMR：δ7.77(2H，d，J＝7.6Hz)，7.61(2H，d，J＝6.0Hz)，7.41(2H，t，J＝7.6Hz)，7.33(2H，td，J＝7.3，2.0Hz)，5.71(1H，d，J＝7.1Hz)，4.78-4.79(1H，m)，4.40-4.45(2H，m)，4.24-4.34(3H，m)，3.84(1H，dd，J＝10.4，3.0Hz)，3.76(1H，dd，J＝10.4，3Hz)，1.33(3H，t，J＝7.1Hz).ESIMS(positive ion mode)：m/z 440([M+Na]⁺)，442([M+2+Na]⁺).IR v_max：3432，3327，2930，1728，1703，1538，1449，1277，1182，1153，1090，1031and 756cm^-1。当NXS为NCS时产物为Fmoc-β-chloro-Ala-OEt(收率80.0％)：白色固体，熔点：126-127℃. ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=+21.4$ (c＝0.2，CHCl₃)，¹HNMR：δ7.77(2H，d，J＝7.7Hz)，7.40-7.45(2H，m)，7.31-7.34(2H，m)，5.72(1H，d，J＝7.3Hz，)，4.74-4.76(1H，m)，4.41(2H，d，J＝7.2Hz)，4.31(2H，q，J＝7.1Hz)，4.25(1H，t，J＝7.2Hz)，4.00(1H，dd，J＝11.4，3.0Hz)，3.91(1H，dd，J＝11.4，3.0Hz)，1.32(3H，t，J＝7.1Hz).ESIMS(positive ion mode)：m/z 396[M+Na]⁺，398[M+2+Na]⁺.IRv_max：3436，3315，2931，1748，1688，1529，1383，1345，1260，1215，1104，1032and 736cm^-1.

将上述制备的N-Fmoc保护的卤代丙氨酸酯1mmol置于配有回流冷凝管的圆底烧瓶中，加入5ml的NaOH(2mol/L)溶液，搅拌、加热回流12小时，反应完毕后，冷却至室温，加入1mol/L的HCl溶液，调节pH至6.0，加入等体积无水乙醇使沉淀完全，过滤，收集固体即为丝氨酸。当以Fmoc-β-chloro-Ala-OEt为原料时，收率88.5％；当以Fmoc-β-bromo-Ala-OEt为原料时，收率56.5％。

Claims (4)

1.一种丝氨酸的制备方法，其特征是：以半胱氨酸1或胱氨酸2为原料制备N-保护的半胱氨酸酯3，再通过卤化试剂为Ph₃P+NXS的复合物卤化制备N-保护的卤代丙氨酸酯4，再将N-保护的卤代丙氨酸酯4置于碱水溶液中水解制备丝氨酸5，化合物结构式如下：

其中，R基团为甲基或乙基或正丙基或异丙基或正丁基或叔丁基或环己基或苄基；保护基团P为叔丁氧羰基或苄氧羰基或芴甲氧羰基或乙酰基或苯甲酰基；X为氯或溴。

2.根据权利要求1所述制备丝氨酸的方法，其特征在于：制备N-保护的卤代丙氨酸酯4的步骤中卤化剂Ph₃P与NXS的摩尔比为1∶0.9～1.1；反应溶剂为CH₂Cl₂或CHCl₃或CCl₄溶液；反应原料3与反应溶剂比例为1mmol∶5～15mL；反应条件为室温～回流温度；反应时间为4～48小时。

3.根据权利要求1所述的丝氨酸的制备方法，其特征在于：以N-保护的卤代丙氨酸酯4制备丝氨酸5的步骤中碱的种类为NaOH或KOH或Na₂CO₃，碱液浓度为1～3mol/L，反应温度为90～120℃，反应时间为10～15小时。

4.根据权利要求1所述的丝氨酸的制备方法，其特征在于：将水解后的反应液直接酸化为pH＝6.0，加入等体积的乙醇，经沉淀后，所得沉淀即为丝氨酸。