CN101605796B

CN101605796B - 基本上纯的荧光素

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Publication number: CN101605796B
Application number: CN2007800456277A
Authority: CN
Inventors: G·彼得林斯基; G·R·哈里斯; B·S·斯科特
Original assignee: Alcon Manufacturing Ltd
Current assignee: Alcon Research Co ltd; Alcon Inc
Priority date: 2006-12-11
Filing date: 2007-12-04
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2027-12-04
Also published as: MX2009005679A; CA2671860A1; US7982056B2; AU2007333307B2; US20080176930A1; WO2008073764A3; JP5384363B2; EP2114953B1; JP2013241472A; RU2477284C2; ZA200903447B; JP2010512409A; AR064288A1; KR20150013356A; RU2009126572A; AU2007333307A1; KR20090086620A; CN101605796A; TWI518089B; EP2481741A1

Abstract

本发明涉及制备基本上纯的荧光素的改善的方法，以及由该方法制备的基本上纯的荧光素。本发明特别涉及提供用于血管造影术的药物组合物。由本发明方法制备的基本上纯的荧光素颜色浅、氯化钠含量低并且基本上无吡啶。

Description

基本上纯的荧光素

发明领域

本发明涉及包含基本上纯的荧光素的组合物，制备基本上纯的荧光素的方法，由该方法制备的基本上纯的荧光素，测定荧光素纯度的分析方法以及用于血管造影术的药物组合物。

发明背景

荧光素是橙红色化合物，C₂₀H₁₂O₅，其在碱性溶液中显示出强荧光并且例如在医学中用于诊断目的，在海洋学中用作示踪剂以及用作纺织染料。

荧光素首先由德国化学家Adolf Von Baeyer于1871年从石油衍生物间苯二酚(1，3-二羟基苯)和邻苯二甲酸酐合成的。Paul Erlich(德国细菌学家)应用荧光染料(荧光素钠盐)(后来被称为“荧光素钠”)来示踪眼中房水的分泌途径。据说这是荧光染料在体内用于研究生理学的第一个实例。

荧光素血管造影术是重要的诊断工具，它允许研究眼后部的血管病症。这些血管是许多涉及视网膜的疾病的因素。血管造影术是通过将荧光素注射入患者手臂的静脉来进行的。在很短的时间内(即典型地从几秒至数秒)，染料通过眼后部的血管，并且当染料在眼血管中循环时，应用配有特别滤光镜的照相机对染料成像。通过检查由此产生的影像，可以得出关于任何循环问题的评价，例如血管渗漏、肿胀、异常或新血管等。

荧光素吸收蓝光，在465-490nm波长处发生峰吸收和激发。荧光在520-530nm黄绿波长处发生。尽管通常称为荧光素，但是造影术中所用的染料是荧光素钠(可溶的荧光素二钠盐)。

荧光素静脉内注射的正常成人剂量是500mg。其典型地以5mL 10％溶液或2mL 25％溶液的剂量包装。进入循环系统后，约80％的染料分子与血清蛋白结合。当用适合波长的光激发时，剩余未结合的或游离的荧光素分子发出荧光。染料通过肝代谢形成荧光素单葡糖苷酸，并且在施用后24至36小时内最终通过尿排泄。

已经报道了荧光素配方中的荧光素纯度可能与副作用和注射耐受有关。(“Effective differences in the formulation of intravenous fluoresceinand related side effects(静脉内荧光素配方和相关副作用的有效差异)”，Yannuzi等人，Am.J.Ophthalmol.1974，78(2)，第217-221页)。因此，消除造影术所用的荧光素组合物中的所有或基本上所有杂质是本发明的主要目的。

将以下出版物可能涉及关于荧光素组合物以及制备和纯化荧光素的方法的另外的信息。

德国专利No.136498(Friedrich等人)，标题为“Process for PreparingHighly Purified Fluorescein for Inj ection Purposes(制备用于注射目的的高度纯化的荧光素的方法)”，描述了应用吡啶制备荧光素的方法。

美国专利申请公布No.US2006/0106234A1(Tran-Guyon等人)，标题为“High Purity Phthalein Derivatives and Method for Preparing Same(高纯度酞衍生物及其制备方法)”，描述了应用无水溶剂制备荧光素的方法。

还参考了以下专利或公布用于进一步的背景：美国专利No.5,637,733号(Sujeeth)，标题为“Synthesis of Fluorescein Compounds with ExcessResorcinol as a Solvent(用过量间苯二酚作为溶剂合成荧光素化合物)”，以及美国专利No.1,965,842(Kranz)，标题为“Production ofHydroxybenzene-Phthaleins(羟基苯-酞类的制备)”。

高度纯化的荧光素对于制备用于注射目的的溶液是必需的。所用的纯化的荧光素理论上应当是：(i)无杂质，所述的杂质可能是有毒的和/或缺乏荧光的；(ii)低盐，所述的盐可能引起可注射的荧光素产品不可接受的高重量克分子渗透浓度或高张力；并且(iii)颜色浅。某些杂质带有很强的颜色。因此，在特别的频率处没有颜色可以表明此类杂质不存在。因此，荧光素组合物的颜色分布被认为是重要的质量属性和纯度的可视标志。

需要鉴定并且定量荧光素组合物中可能存在的非常低水平的杂质的方法。该方法应当能够分离、鉴定并且定量可能存在的那些杂质。

因此，需要的是高纯度、颜色浅、氯化钠含量低的荧光素组合物和不需要应用吡啶或其它非水(和潜在有害的)溶剂来制备该荧光素的方法，以及用于测定该荧光素纯度的方法。本发明涉及满足该需要。

发明概述

本发明涉及包含基本上纯的荧光素的组合物，制备纯化的荧光素的新的并且改善的方法，以及通过这些方法制备的荧光素组合物。本发明还涉及用于血管造影术包含基本上纯的荧光素的药物组合物，以及测定荧光素组合物纯度的方法。通过本发明方法制备的高度纯化的荧光素比先前的荧光素组合物具有更低水平的有关物质杂质。通过这些新方法制备的荧光素还比其它已知的组合物颜色浅(在590nm处)，提供了纯度的清楚可视的标志。本发明的荧光素还比其它已知的组合物氯化钠含量低，因此更易于配制用于药物用途。本发明的方法对其它已知的方法进行改善：在纯化过程中不应用吡啶，无需应用无水溶剂，减少了乙酰化粗荧光素所需的乙酸酐的量，以及改善了高度纯化的荧光素的产量。通过提供用于分离和定量荧光素组合物中有关物质杂质的可靠方法，从而用于测定荧光素组合物的纯度，本发明还促进了技术状态。

本发明可以在多个申请中体现，包括(但不限于)以下概述的那些：

本发明的一个实施方案涉及包含基本上纯的荧光素的组合物；更特别的是，荧光素基本上无吡啶。

本发明的另一个实施方案涉及基本上纯的荧光素，其不包含浓度大于约0.1％重量、更优选0.01％重量的任何有关物质杂质。

本发明的另一个实施方案涉及具有色数为约0.015至约0.050AUC的基本上纯的荧光素。

本发明的另一个实施方案涉及具有残留氯化物含量小于约0.25％重量的基本上纯的荧光素。

本发明的另一个实施方案涉及基本上纯的荧光素，其中有关物质杂质的总量小于约0.6％重量、优选小于0.06％重量。

本发明的另一个实施方案涉及制备基本上纯的荧光素的方法。该方法包括水解二乙酰基荧光素以形成荧光素，将荧光素用炭处理，过滤，在滤液中加入乙醇，应用酸性溶液调节pH以形成沉淀，过滤并且洗涤。在该实施方案的一个方面中，将pH水平调节至约1.0至约2.5。在另一个方面，当调节pH水平时，将冷却温度维持在约20℃至约25℃，并且pH水平调节持续约2至4小时。本发明还涉及由该方法制备的基本上纯的荧光素组合物。

本发明的另一个实施方案提供了HPLC方法，该方法用于定量荧光素有关物质杂质的水平。该方法包括获得组合物的高压液相色谱图；确定色谱图中相应于有关物质杂质的峰并且进行峰面积测量以测定其相对浓度。在该实施方案的一个方面中，峰具有相对HPLC保留时间为约0.75、1.19、1.23、1.68和1.71。另一个实施方案提供了HPLC/MS方法，该方法用于确定荧光素中的有关物质杂质。

本发明优选的实施方案涉及用于血管造影术包含基本上纯的荧光素的药物组合物，更特别的是组合物，其中荧光素是基本上无吡啶的。

本发明另一个优选的实施方案涉及用于血管造影术包含基本上纯的荧光素的药物组合物，其中组合物不包含浓度高于约0.1％重量、更优选0.01％重量的任何有关物质杂质。

本发明另一个优选的实施方案涉及用于血管造影术包含基本上纯的荧光素的药物组合物，其中组合物中存在的有关物质杂质的总量小于约0.6％重量、更优选小于约0.06％重量。

本发明另一个优选的实施方案涉及用于血管造影术包含基本上纯的荧光素的药物组合物，其中荧光素具有色数为约0.015至约0.050AUC。

本发明另一个优选的实施方案涉及用于血管造影术的荧光素的药物组合物，其中组合物具有残留氯化物量小于约0.25％重量。

本发明通过以下附图和详述进行更全面的讨论。

附图简述

图1是荧光素洗涤试验的试验设计图。

图2是荧光素pH/沉淀试验的试验设计图。

图3是显示实施例3中描述的荧光素药物的颜色强度的UV/VIS光谱图。

图4是实施例5中描述的稀释空白的HPLC色谱图。

图5是实施例5中描述的1％USP荧光素参考标准品的HPLC色谱图。

图6是实施例5中描述的供应商A荧光素原料的HPLC色谱图。

图7是实施例5中描述的添加0.8％间苯二酚的新方法荧光素原料的HPLC色谱图。

图8是实施例5和6中描述的荧光素和可能的杂质的结构图。

图9是荧光素钠注射液的代表性HPLC色谱图。

图10A是UV检测的荧光素钠注射液的色谱图。

图10B是在13.65-14.45分钟取样的荧光素的HPLC峰的热喷雾质谱图。

图11A是应用质谱仪在m/z 259处的质量选择检测的荧光素钠注射液中杂质A的色谱图。

图11B是在11.95-12.05分钟取样的杂质A的HPLC峰的热喷雾质谱图。

图12A是应用质谱仪在m/z 285处的质量选择检测的荧光素钠注射液中杂质B的色谱图。

图12B是在15.45-15.55分钟取样的杂质B的HPLC峰的热喷雾质谱图。

图13A是应用质谱仪在m/z 347处的质量选择检测的荧光素钠注射液中杂质C的色谱图。

图13B是在16.10-16.50分钟取样的杂质C的HPLC峰的热喷雾质谱图。

图14A是应用质谱仪在m/z 347处的质量选择检测的荧光素钠注射液中杂质D的色谱图。

图14B是在18.20-18.65分钟取样的杂质D的HPLC峰的热喷雾质谱图。

图15A是应用质谱仪在m/z 333处的质量选择检测的荧光素中杂质E的色谱图。

图15B是在13.23-13.52分钟取样的杂质E的HPLC峰的APCI质谱图。

图15C是通过220-500nm的总吸收扫描检测的荧光素中杂质E的色谱图。

图15D是杂质E峰的UV-Vis光谱图。

图16A是应用质谱仪在m/z 425处的质量选择检测的荧光素中杂质F的色谱图。

图16B是在19.10-19.32分钟取样的杂质F的HPLC峰的APCI质谱图。

图16C是通过220-500nm的总吸收扫描检测的荧光素中杂质F的色谱图。

图16D是杂质F峰的UV-Vis光谱图。

图17A是应用质谱仪在m/z 375处的质量选择检测的荧光素中杂质G的色谱图。

图17B是在21.27-21.54分钟取样的杂质G的HPLC峰的APCI质谱图。

图17C是通过220-500nm的总吸收扫描检测的荧光素中杂质G的色谱图。

图17D是杂质G峰的UV-Vis光谱图。

图18A是在51.75-51.85分钟取样的杂质H-1的HPLC峰的APCI质谱图。

图18B是通过220-500nm的总吸收扫描检测的荧光素中杂质H-1的色谱图。

图19A是在52.67-52.79分钟取样的杂质H-2的HPLC峰的APCI质谱图。

图19B是通过220-500nm的总吸收扫描检测的荧光素中杂质H-2的色谱图。

图20是杂质H-2的UV-Vis吸收扫描。

发明详述

除非另外说明，本文所用的以下缩略语和术语应当理解为具有以下含义：

缩略语“APCI”表示大气压化学电离。

缩略语“M/S”或“MS”表示质谱。

缩略语“HPLC”表示高效液相色谱。

缩略语“UV-Vis”表示紫外-可见。

缩略语“LC/MS”表示液相色谱/质谱。

术语“炭”包括有效降低色数的活性炭试剂。示例性试剂包括但不限于

Figure DEST_PATH_G54361116150138000D000031

SA Plus和

Figure DEST_PATH_G54361116150138000D000032

SX Ultra，从供应商Univar USA，Dallas，Texas可商购获得。能够降低色数的炭形式可以通过常规试验来确定。(已经确定例如另一种可商购获得的炭形式没有有效降低色数，即

Figure DEST_PATH_G54361116150138000D000033

KB。)

术语“色数”是指在590nm处测量时，在pH 9.4的氢氧化钠和碳酸氢钠水溶液中制备的1.0％的荧光素原料溶液的吸收。

术语“荧光素药物”和“荧光素原料”在本文可互换应用。

术语“有关物质杂质”包括荧光素的合成的杂质、异构体、氧化产物、二聚化产物和分解产物和/或荧光素反应物。该有关物质杂质的示例性结构如图8中所示。

术语“基本上无吡啶”表示荧光素组合物至少99％无吡啶。更优选的是分析纯至少99.9％；甚至进一步优选的是荧光素组合物完全无吡啶。

术语“基本上纯的荧光素”指的是总体不存在或接近总体不存在杂质、例如有关物质杂质。例如，当荧光素组合物被称为是基本上纯的时，其中或者没有可检测到的有关物质杂质，或者如果检测到单个有关物质杂质，那么它是以不大于0.1％重量的量存在，或者如果检测到多个有关物质杂质，那么它们是以合计不大于0。6％重量的量存在。

本发明的方法制备低有关物质杂质分布的荧光素产物。通常已知即使纯化的荧光素物质也可能包含低水平的某些杂质，例如间苯二酚和2-(2’，4’-二羟基苯甲酰基)苯甲酸。但是，先前没有认识到荧光素商购样品可能包含除间苯二酚和2-(2’，4’-二羟基苯甲酰基)苯甲酸之外的许多杂质。通过本发明的方法基本上降低了这些潜在的杂质的量。此类杂质在本文统称为“有关物质杂质”。

进行试验，通过LC/MS测定这些有关物质杂质的分子量，并且尽管无需结合理论，但是本文的这些杂质的结构是可能的(参见图8)。以下发现并且详述了用于分辨和定量甚至在纯化的荧光素组合物中可能存在的低水平有关物质杂质的方法。本文发现了本发明的方法提供了高度纯化的荧光素，其具有基本上降低的水平的有关物质杂质。这一点可以在本发明的纯化的荧光素药物的杂质分布中观察到，如下表1所示，相比于来自多个厂商的技术级荧光素的杂质分布，如下表2所示，以及来自多个厂商的荧光素药物的杂质分布，如下表3至5所示。

本发明涉及的通用方法的示意图说明如下。将商品级荧光素通过与乙酸酐在回流温度下反应来二乙酰化。将所产生的二乙酰化的荧光素分离，然后与碱反应，产生脱乙酰化的荧光素，然后将其用炭处理，产生颜色浅、高纯度和氯化物含量低的荧光素。反应流程图说明如下：

制备本发明纯的荧光素所用的特别溶剂、反应时间和温度以及pH值已经基于一系列试验确定。这些试验的目的是获得高纯度、颜色浅和盐含量低的药物级荧光素，以及避免应用在现有已知方法中所用的有害溶剂，即吡啶。另外的目的是通过例如应用最少量的溶剂或降低必需步骤的反应循环时间使得本方法中涉及的花费和时间最小化。

纯化荧光素的方法开始于将荧光素转化为O，O’-二乙酰基荧光素。对于该目的，将乙酸酐用作溶剂和试剂，完全避免应用吡啶，一种在现有技术方法中所用的有害溶剂。因此，将荧光素和乙酸酐的混合物在回流下搅拌数小时，并且将产生的悬浮液冷却。进一步冷却至冰点或刚低于产生完全结晶。收集结晶物质并且先用冷的乙酸酐洗涤，然后用冷的丙酮洗涤。然后将物质再悬浮于丙酮中，同时搅拌并且温和加热。冷却后，收集白色结晶物质，用冷的丙酮洗涤并且空气干燥，得到高纯度的O，O’-二乙酰基荧光素。

然后，将O，O’-二乙酰基荧光素逆转化为荧光素，同时形成钠盐并且除去最终的杂质。为了完成该转化，应用苛性溶液将O，O’-二乙酰基荧光素的乙酰基水解。因此，将O，O’-二乙酰基荧光素和甲醇装入适合的容器中，加入制备的氢氧化钠的去离子水溶液，并且将混合物加热至回流，同时搅拌。然后将混合物冷却，应用助滤剂过滤，然后用甲醇洗涤。然后通过真空蒸馏减少滤液的体积，加入水，并且将反应混合物冷却。然后将反应混合物的pH调节至8.5至8.7之间。加入适合的炭、例如

SX Ultra，同时搅拌1小时。如果需要，重复加入炭的步骤。接下去是关键的沉淀步骤。首先，在滤液中加入乙醇，从而获得2∶1比例的乙醇-水。该比例是基于意外的发现，在沉淀过程中有机溶剂与水的比例越高，产生的荧光素产物中氯化物含量越低。为了明确该作用所进行的试验在下面进一步描述。然后，为了酸化荧光素，加入稀释的盐酸溶液，以便确定校准的pH范围。该范围是基于意外的发现，pH越低，提供更需要的颜色的产物。更特别的是，通过试验确定，滤液最适的pH范围应当在1.0至2.5之间，并且酸化应当缓慢进行，例如历经2至4小时进行，从而避免产物的聚集，并且冷却。进一步搅拌并且冷却后，将荧光素通过过滤分离。将产物用水和乙醇的溶液洗涤，并且干燥产物，获得80-90％产率的非常高质量荧光素。该高纯度的荧光素可以用于制备注射用的荧光素。对于该目的，应用氢氧化钠将荧光素转化为可溶的二钠盐形式，并且装入安瓿中用于随后的灭菌。

为了完成本发明方法所进行的试验的一个实例是校准pH范围，在该pH范围内荧光素产物沉淀。部分基于对形成的产物的颜色谱的经验观察将该pH范围从更高调节至更低范围。因此，确定了最佳的pH范围是约pH1.0至约pH 2.5，在该pH范围内荧光素产物应当沉淀，以便实现颜色浅产物的目的。

还意外发现，在沉淀过程中，有机溶剂与水性溶剂的比例越高，产生的荧光素产物中的氯化物含量越低。该结果不是预期的，因为预期的是低的有机物/水性物比例对于降低氯化钠水平是必需的。更高比例的有机溶剂的应用对改善过滤速率具有额外的益处，从而减少了处理物质所需的时间。

进行进一步的沉淀试验以开发本发明的方法并且描述如下，并且在图1和2中显示。特别的是，进行试验以通过改变沉淀方法来降低氯化物水平，如下表6所示。

表6：沉淀试验

试验参考	水∶乙醇的比例	体积	洗涤^＊(是或否)	氯化物(％wt)	注释
						A	1∶1	10	否	0.91	黄-红色固体
	1∶1	15	否	0.87	黄-红色固体

[0085]

B	1∶1	10	否	0.80	黄-红色固体
							2∶1	15	否	0.97	黄-红色固体
C	1∶1	10	否	0.76	黄-红色固体
							1∶2	15	否	0.65	暗红色固体
D	1∶1	10	否	1.45	86％产率，黄-红色固体
						E	1∶2	15	否	0.45	92％产率，暗红色固体
F	1∶1	10	是	0.10	87％产率，黄-红色固体
						G	1∶2	15	是	0.0056	78％产率，暗红色固体
H	1∶1	10	否	1.05	黄-红色固体
						I	1∶2	15	否	0.49	暗红色固体
J	1∶1	10	是	0.13	黄-红色固体
						K	1∶2	15	是	0.026	暗红色固体

^＊水∶乙醇，3∶1，2×1体积洗涤

表6显示了沉淀介质的溶剂比的改变影响存在的氯化物的量。特别的是，增加沉淀介质中乙醇与水的比例产生更低的氯化物含量。试验A显示当水∶乙醇(1∶1)沉淀介质的体积由10体积(参考)增加至15体积(参见表6)时，氯化物含量微小降低。试验B将来自水∶乙醇(1∶1，10体积，参考)的沉淀与来自水∶乙醇(2∶1，15体积)的沉淀进行了比较。试验结果与直觉相反，因为具有更低水含量和更小体积的参考反应产生更低的氯化物含量。

试验C将来自水∶乙醇(1∶1，10体积，参考)的沉淀与来自水∶乙醇(1∶2，15体积)的沉淀进行了比较。试验C的结果显示更高有机物含量的沉淀介质产生更低的氯化物含量。

沉淀介质中更高有机物含量产生更低的氯化物含量的趋势在试验D、E、F和G以及试验H、I、J和K(对于未洗涤和洗涤的产物)中得到了重现。尽管结果显示与直觉相反，但是相信(没有结合理论)更高的有机物含量允许更快和更有效的洗涤产物块。

所考虑的另一方面是荧光素颜色是否取决于沉淀介质的pH；参见下表7，其中应用2∶1比例的乙醇∶水的沉淀介质。

表7

作为pH函数的荧光素颜色

[乙醇∶水(2∶1)的沉淀介质]

试验参考	pH1.0-1.5	pH2.0-2.5	pH3.0-3.5	pH4.0-4.5
					L	红色固体	红色固体	栗色固体	棕色固体

结果表明荧光素颜色对pH变化是敏感的。例如，在pH约3.0时，产物的外观开始呈现栗色，其被认为是不希望的。

提供以下实施例1-8以进一步说明本发明的某些实施方案。由实施例5、6、7和/或8获得的代表性数据如图9至19所示。

图9-14的数据是由LC/MS获得的，应用热喷雾质谱与HPLC连接。峰是通过应用UV检测器(280nm)和热喷雾质谱来观察的。试验条件：仪器＝Vestec Model 201B热喷雾质谱，连接Waters Model 600 MS HPLC系统和Waters Model 486MS UV检测器(280nm)；柱＝Waters SymmetryC-8，5μm，3.9×150mm；流动相＝历经25分钟由0％B至100％B程序化的线性梯度；流动相A＝在10∶90 V∶V甲醇∶水中的0.1M乙酸铵；流动相B＝在甲醇中的0.1M乙酸铵；流速＝1.0mL/分钟；样品浓度＝纯的；以及进样体积＝20μL。

图15-20的数据是由LC/MS获得的，应用质谱与HPLC连接。该质谱是应用大气压化学电离(APCI)接口，并且质谱是在正离子检测模式下运行的。峰是通过应用监测220-500nm总吸收的UV-Vis检测器和质谱来观察的。应用Waters Symmetry C-8柱(3.9×150mm)，流速0.6mL/分钟，并且设定程序为历经30分钟由0％流动相B至100％流动相B。流动相B是在甲醇中的0.01M乙酸铵，并且流动相A是在10∶90/甲醇∶水中的0.01M乙酸铵。

实施例1

荧光素二乙酸酯的形成

在5升3颈圆底烧瓶中加入荧光素(1000g，3.01mol)和乙酸酐(1622g，15.9mol)。将产生的混合物在回流下搅拌3-5小时并且将产生的悬浮液冷却至室温。继续搅拌，将反应混合物进一步冷却至-5至3℃，以实现完全结晶。将结晶的物质收集在Buchner过滤器上，用冷的乙酸酐(2×500mL)洗涤，然后用冷的丙酮(1×600mL)洗涤。将物质部分干燥并且重新悬浮于丙酮(1000mL)中，同时搅拌并且温和加热。一旦冷却，将白色结晶物质收集在过滤器上，用冷的丙酮(2×700mL)洗涤并且空气干燥。产率：～75％-85％；TLC显示单点；MP＝203-205.5℃；并且纯度99.7％。

实施例2

由二乙酰基荧光素形成荧光素，钠盐的形成以及除去最终的杂质

将O，O’-二乙酰基荧光素(1000g)和甲醇(4000mL)装入适合的反应器中。单独地，在去离子水(620mL)中制备氢氧化钠溶液(480g，50％苛性)。将氢氧化钠溶液装入包含O，O’-二乙酰基荧光素和甲醇的反应器中。将混合物加热至回流并且在回流下搅拌90分钟。将反应混合物冷却至20℃至25℃之间。应用助滤剂(100g)将混合物过滤，然后用甲醇(500mL)洗涤。将滤液(5000mL)在真空下蒸馏至残留体积在1400mL至1700mL之间，然后将反应混合物冷却至20℃至25℃之间。将去离子水(5000mL)加入至蒸馏浓缩物中。单独地，在去离子水(72g)中制备氢氧化钠溶液(56g，50％苛性)。将新鲜制备的氢氧化钠溶液(100mL)用于调节反应的pH至8.5至8.7之间。在室温下，将Norit SX Ultra(100g)、助滤剂(100g)和去离子水(500mL)加入至反应中，然后将混合物搅拌1小时。将此批过滤并且在室温下将另外的Norit SX Ultra(100g)和去离子水(500mL)加入至滤液中，然后将混合物搅拌1小时。将此批过滤并且用去离子水(2000mL)洗涤。将乙醇(10000mL)加入至滤液中。单独地，通过将盐酸(32％，820g)溶于去离子水(320mL)中制备盐酸溶液。将稀释的酸溶液用于调节滤液的pH至1.0至2.5之间，同时将此批的温度维持在20℃至25℃之间。将此批在20℃至25℃之间搅拌1小时，然后通过过滤分离。将滤饼用(注射用水∶乙醇)：(3∶1)溶液(2×1000mL)洗涤。将产物干燥，得到典型地为80-90％产率的非常高质量的荧光素。

实施例3

荧光素药物颜色强度

仪器

能够接受1cm比色杯和从660nm扫描至570nm的分光光度计。

适合波长从660nm至570nm的物质、例如石英的分光光度计比色杯(1cm光程长)。

荧光素药物的颜色强度如以下描述的测定。该方法用于确定在pH9.4的氢氧化钠和碳酸氢钠水溶液中制备的1.0％的荧光素原料溶液的颜色，通过测量其在590nm处的吸收而实现。该数值还可以称为“色数”。在590nm处测量吸收的增加相应于完成的药物产品可见的颜色强度的增加。

将荧光素(250mg±5mg，精确称量)和碳酸氢钠(50mg)称重放入25mL烧杯中。加入氢氧化钠(5mL，1％)。将溶液在搅拌下温和温热。加入氢氧化钠(1％，至多另外1mL，合计6.0mL)直至所有的物质溶解并且溶液澄清。将反应冷却至室温。将pH调节至pH9.4，如果需要，滴加1％氢氧化钠。如果pH高于9.4，将溶液弃去并且应用更少的氢氧化钠重新制备。将溶液定量地转移至容量瓶(25mL)中并且用纯水QS至25.0mL。终浓度为10mg/mL或1％。

方法

将分光光度计调零，通过用样品和参考比色杯中的纯水建立空白用户基线，以100nm/分钟的速率从660nm扫描至570nm而实现。将荧光素溶液(1％)加入至样品比色杯中。将样品溶液以100nm/分钟的速率从660nm扫描至570nm。吸收读数在590nm处记录。一式两份的测量在分开的等份样品上进行。表1列出了应用该方法试验的数个荧光素原料样品的典型的色数结果。该结果应用以下部分所示的等式校正。图3显示了由荧光素原料样品获得的典型的光谱。

计算

对于样品浓度将吸收读数进行如下校正：

样品荧光素批次的颜色强度测量是如实施例2中描述的那样获得的，并且在下表8中列出。

表8

实施例4

应用电位滴定法测量荧光素残留氯化物

仪器

Brinkman 716 DMS Titrino自动滴定仪或同等物

Brinkman 730样品转换器和759摆动头(Swing Head)自动进样器或同等物

Ag滴定电极

5-位分析天平或同等物

超声仪

加热板

能够3,000rpm的离心机

培养管，16×125mm，VWR Cat#47729-578或同等物

16mm培养管的白色盖子，VWR Cat#60828-760或同等物

血清过滤器，6×16mm，VWR Cat#28295-556或同等物

以下方法用于定量荧光素中残留的氯化物的量，应用电位硝酸银滴定液、自动滴定仪和银电极。

(1)试剂溶液的制备，氢氧化铵(5N)

在纯水(～600mL)中加入浓氢氧化铵(～338mL)并且用纯水稀释至1000mL。将该溶液用于自动滴定仪冲洗和储存银电极。

(2)标准化的溶液制备，硝酸银，0.10N，水溶液

优选应用具有分析证书的商购的制备的0.10N硝酸银溶液。但是，如果无法获得商业证明的硝酸银溶液，那么可以将硝酸银(17.0g)称重并且溶于纯水(1000mL)中并且标准化。将氯化钾参考标准品(干燥的，50mg)称重并且溶于滴定杯中的纯水(～30mL)中。将硝酸(1mL)加入至该溶液中。将溶液应用银棒电极进行电位滴定。每mL的0.10N硝酸银相当于7.455mg的氯化钾。应用以下等式计算硝酸银的当量浓度：N AgNO₃＝(mg KCl×纯度KCl)/(mL AgNO₃×74.55)。

(3)样品制备和滴定

将荧光素原料(2g)称重至培养管(16×125mm)中。加入纯水(热的，10mL)。加入硝酸(1mL)并且将所有试管盖好，振摇2分钟并且超声15分钟。将所有试管离心30分钟(～3,000rpm)。应用血清过滤器将沉淀物从上清液中分离。将溶液倒入滴定杯中。用纯水(5mL一份)将血清冲洗并且过滤。将冲洗液倒入滴定杯中。将血清过滤器移走并且丢弃。将上述方法重复第二次，除了将所有试管盖好并且振摇1分钟，并且将所有试管离心20分钟(～3,000rpm)。将第一次和第二次提取物的溶液合并并且将血清过滤器用纯水冲洗。将合并的溶液用0.10N AgNO₃滴定至其电位终点。滴定参数包括每个样品之后应用洗涤循环(5N氢氧化铵)和冲洗循环(5N氢氧化铵)。参数清单如下所示。

(4)计算

V＝0.10N AgNO₃滴定的体积

N＝AgNO₃滴定液的当量浓度

35.453＝氯化物的分子量

W＝所取的荧光素样品的重量

表9

实施例5

在该方法中，在甲醇中制备荧光素原料溶液并且应用高效液相色谱(HPLC)系统、梯度流动相程序和C-18柱与其有关物质分离。有关物质是对荧光素参考标准品的1％溶液定量的。将紫外HPLC检测器用于测量280nm处波长处的峰响应。流动相A是0.01M乙酸铵、10％甲醇/90％水和0.5％乙酸。流动相B是0.01M乙酸铵、100％甲醇、0.5％乙酸。参考标准品是0.5mg/mL荧光素的甲醇溶液，在甲醇中稀释至终浓度为0.005mg/mL，或者类似制备的1％的样品，最终理论浓度为0.5mg/mL的荧光素。应用能够程序化梯度操作的高效液相色谱系统，具有HPLC UV/VIS检测器并且监测280nm的能力。柱：3.9×150mm Waters Symmetry C-18柱，5μm(或同等物)，对于荧光素能够至少20,000塔板/柱。流速：0.6mL/分钟。梯度程度如下：

时间(分钟) ％流动相A ％流动相B

0 80％ 20％

60 20％ 80％

柱洗涤：

61 0％ 100％

66 0％ 100％

平衡

67 80％ 20％

应用峰面积，计算等于或大于0.025％的已知和未知杂质的百分数浓度，如以下计算部分所示。尽管该方法的定量限是0.025％，但是杂质通常是以浓度≥0.05％报道的。在荧光素的分析中发现9种杂质并且它们的分子量是通过LC/MS确定的。它们可能的结构在图8中呈现。发现杂质H为两个非对映异构体，H-1和H-2。应用该色谱方法，在该方法中所引用的荧光素批次中鉴定的杂质的典型的相对保留时间(RRT)、容量因子(k’)和洗脱时间的梯度组成(％B)如下：

RRT k’ B(％)

杂质A 0.75 11.1 43.0

杂质D 1.19 18.2 56.5

杂质F 1.23 18.8 57.7

杂质H-1 1.68 26.0 71.0

杂质H-2 1.71 26.5 72.0

如果峰的相对保留时间、容量因子和近似的流动相组成相应于上述有关物质，那么荧光素色谱图中的峰可以鉴定为有关物质A、D、F、H-1或H-2。但是，色谱系统间每个相对保留时间值可以变化约0.02。色谱系统的修改也可以影响上述值。尽管杂质B、C、E和G没有在本分析的四个荧光素批次中鉴定出来，但是供应商A荧光素的在先LC/MS分析表明杂质B、C、E和G具有约1.09、1.11、1.20和1.44的RRT’s。RRT’s分别为1.10和1.74的两个未知杂质存在于本申请报道的四批荧光素原料中。它们的浓度在0.025％至0.05％之间。在RRT＝1.10处的未知峰可能是杂质B或C。荧光素原料样品的色谱图如图6所示。在荧光素药物中观察到了二乙酰基荧光素并且出现在相对于荧光素的1.35的保留时间处。

间苯二酚是荧光素的已知常见杂质。间苯二酚在荧光素的合成中用作原料并且是潜在的降解产物。如以上呈现的，发现间苯二酚在RRT为0.14、k’为2.9并且％B为24.6处洗脱。偶尔可以发现间苯二酚作为未分离的双峰洗脱。包含间苯二酚的荧光素药物的色谱图如图7所示。

鉴定任何非相关的峰(即溶剂前沿、系统峰)加上间苯二酚并且从以下计算中省略。间苯二酚在RRT为约0.14处洗脱(参见图7)。计算每个有关物质的百分数浓度，如下所示。

％总的有关物质＝∑(单个杂质≥0.025％)

通过将浓度为0.025％或更高的杂质相加来计算总的杂质。

依照下式计算相对保留

RRT = \frac{t_{i}}{t_{f}}

t_i＝杂质峰的保留时间

t_f＝荧光素峰的保留时间

确定该方法的定量限为0.127μg/mL的荧光素(0.025％的样品制剂浓度)。确定检测限为0.05μg/mL的荧光素(0.01％的样品制剂浓度)。

应用该方法分析四批供应商A荧光素原料。检测出七种杂质并且鉴定出五种杂质(A、D、F、H-1和H-2)。可报告的杂质(≥0.025％)的总百分数范围为0.2％至0.7％之间。结果列于下表10。

在该方法的可选择的方法中，将样品和标准品制剂的稀释液变成允许同时分析间苯二酚和其它有关物质杂质。为了制备稀释液，首先将0.77g乙酸铵溶于1000mL水中，用乙酸将pH调节至3.9，然后加入等体积的乙酸铵缓冲液和甲醇。首先以50mg比15mL的比例将荧光素溶于甲醇中，然后如实施例5中描述的方法，将该稀释液替代甲醇用于稀释标准品和样品，同样将空白由甲醇变成稀释液。在用稀释液稀释后，将荧光素标准品和样品制剂避光。间苯二酚和邻苯二甲酸的典型的相对保留时间(RRT)如下：

RRT k’ B(％)

间苯二酚 0.13 1.21 24.2％

邻苯二甲酸 0.16 1.53 24.9％

还可以将RRF(相对响应因子)添加到杂质的计算中，其中RRF表示相对于荧光素的响应。

杂质 RRF ¹

间苯二酚 1.7

邻苯二甲酸 2.6

杂质A 0.43

杂质D 1.0

杂质F 1.0

杂质H-1 1.0

杂质H-2 1.0

每个有关物质的百分数浓度可以计算如下：

¹杂质D、F、H-1和H-2的相对响应因子没有确定。它们的相对响应因子设定为1.0。

实施例6

进行研究以确定荧光素有关物质杂质的鉴定。分析荧光素样品中杂质的存在和浓度。鉴定分析是通过高效液相色谱/质谱(LC/MS)进行的。

将由LC/MS系统获得的代表性的HPLC色谱图进行重复，如图9所示。荧光素在色谱图中显示出主要峰。图10(b)中所示的荧光素的热喷雾质谱图在m/z 333处显示出M+H分子离子，其与332的分子量一致。

图11(b)中所示的杂质A的热喷雾质谱图在m/z 259处显示出M+H分子离子，表示258的分子量。图8中杂质A([2-(2’，4’-二羟基苯甲酰基)苯甲酸])的可能的结构先前作为荧光素制剂中的杂质已经报道。

图12(b)中所示的杂质B的热喷雾质谱图在m/z 285处显示出M+H分子离子，表明284的分子量。284的分子量可能对应于C₁₅H₈O₆、C₁₆H₁₂O₅和C₁₇H₁₈O₄的元素式。图8中所示的杂质B的可能的结构可能来源于间苯二酚与琥珀酸的反应(在邻苯二甲酸用于荧光素前体中作为杂质)。

图13(b)中所示的杂质C的热喷雾质谱图在m/z 347处显示出M+H分子离子。这表示346的分子量，并且对应于比荧光素增加14个质量单位。

图14(b)中所示的杂质D的热喷雾质谱图也在m/z 347处显示出M+H分子离子，其可能是杂质C的异构体。杂质C和D的可能的结构彼此是互变异构体，它们都是荧光素的奎宁型氧化产物。

图15(b)中所示的杂质E的APCI在m/z 333处显示出M+H分子离子，表明332的分子量，以及UV_max在492nm处的UV光谱。因此，这表示杂质E可能是荧光素的位置异构体。

图16(b)中所示的杂质F的APCI在m/z 425处显示出M+H分子离子，表明424的分子量，以及UV_max大于400nm。该光谱显示出与将另外的间苯二酚分子加入至母体化合物中一致。因此，化合物F可能由三个间苯二酚形成，而母体可能由两个间苯二酚形成。

图17(b)中所示的杂质G的APCI在m/z 375处显示出M+H分子离子，表明374的分子量，以及UV_max在484nm处。光谱和亲脂性显示出与荧光素的乙酸酯一致。

图18(a)和19(a)中所示的杂质H-1和H-2的APCI在m/z 739处显示出两个化合物的M+H分子离子，表明每个分子量为738。两个化合物的UV-Vis吸收光谱是相同的，UV_max在233nm处，并且更弱的吸收最大值在462和488nm处。杂质H-2的吸收光谱如图20所示。

实施例7

注射用荧光素或25％的荧光素钠(Fluorescite)的制备

在60％的所需的注射用水的配料罐中，溶解并且称量所需量的氢氧化钠。加入并且溶解荧光素。如果溶解所需，加入另外的注射用水，但是体积不超过总体积的90％。搅拌30分钟后，如果荧光素没有完全溶解，进行下一步，调节pH。将pH调节至9.4，其用3N氢氧化钠和/或1N盐酸完成。将混合物在180 R.P.M.下搅拌30分钟。重新检查pH。如果低于9.3或高于9.5，用3N氢氧化钠和/或1N盐酸重新调节至9.4。将荧光素钠溶液用另外的注射用水定容，并且搅拌15分钟。如上所述重新检查pH。应用氮气罐，将溶液加压过滤通过一系列具有5微米、0.8微米和0.45微米孔径的三个膜过滤器，过滤至无菌填充罐中。应用上述方法，重新检查产物的pH。将样品无菌取出用于试验室试验。将产物装入先前灭菌的安瓿中。在每个安瓿中加入2.15至2.25mL。装入后立刻将样品通过标准方法顶封或拉封。在灭菌过程中检查每个安瓿的封口。取决于批次大小，将安瓿在121℃下高压灭菌20分钟或更长。仔细检查渗漏。在最佳的光学条件下逐个检查每个安瓿的不溶性微粒。

实施例8

注射用荧光素或10％荧光素钠的制备

作为制备注射用荧光素的可选择的方法，在适合的不锈钢罐中加入约70％-75％的批量注射用冷水(约30℃)。加入荧光素并且混合直至悬浮液完全。记录初始pH。加入足量(总体积的约7.5％)的7N氢氧化钠，然后加入另外量的7 N氢氧化钠，添加间在等待约15分钟后重新检查pH值，直至pH在9.3-9.5之间，目标为pH9.4。如果pH高于9.5，通过加入1N盐酸调节pH，以获得pH范围为9.3-9.5。在pH范围达到后，继续混合不少于15分钟。将该批用注射用水调至最终重量，并且混合不少于30分钟。测量pH并且用氢氧化钠或盐酸调节至所需的。将产物无菌地装入无菌的小瓶中，根据标准操作方法进一步检查并且试验。

本文突出显示的特别的实施方案不旨在是本发明所有实施方案的目录。进一步的是，本领域那些技术人员将认识到或能够确定只是应用常规试验，本发明实施方案的许多同等物。这些同等物旨在包括在以下权利要求中。

Claims

1.制备基本上纯的荧光素的方法，该方法包括：

(a)将商品级荧光素和乙酸酐的混合物在回流下搅拌数小时，并且将产生的悬浮液冷却，进一步冷却至冰点或刚低于产生完全结晶，收集结晶物质并且先用冷的乙酸酐洗涤，然后用冷的丙酮洗涤，然后将物质再悬浮于丙酮中，同时搅拌并且温和加热，冷却后，收集白色结晶物质，用冷的丙酮洗涤并且空气干燥，得到高纯度的O，O’-二乙酰基荧光素；

(b)应用在水中的氢氧化钠水解由商品级荧光素制备的二乙酰基荧光素以形成荧光素；

(c)将反应混合物的pH调节至8.5至8.7之间；

(d)将适合的炭加入至荧光素的溶液中以形成荧光素/炭混合物，然后过滤荧光素/炭混合物以形成滤液；

(e)将乙醇加入至滤液中以获得2∶1比例的乙醇-水；

(f)在冷却下，应用稀释的盐酸溶液调节pH至1.0-2.5的水平，该过程持续2至4小时，以形成沉淀；

(g)过滤溶液以保留沉淀；

(h)用水和乙醇溶液洗涤沉淀，干燥；

其中如果没有检测到有关物质杂质，或者如果检测到单一的有关物质杂质并且其存在的量不大于0.1％重量，或者如果检测到多种有关物质杂质并且其总共存在的量不大于0.6％重量，则产生的荧光素被定义为基本上纯的，

并且其中所述的有关物质杂质包含荧光素的合成的杂质、异构体、氧化产物、二聚化产物和分解产物和/或荧光素反应物，其选自：