CN113461651A - 一种高纯度荧光素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于荧光素提纯技术领域，涉及一种高纯度荧光素的纯化方法。以粗品荧光素为原料，其特征在于，乙酰化反应后纯水打浆，重结晶，然后利用甲醇钠脱乙酰精制得到精品荧光素。本发明是利用制备荧光素衍生物的方法提纯荧光素的新工艺，由于荧光素二乙酸酯易于制备、易于还原，并且具有很好的结晶性，与杂质的性质差别比较大，因此利用荧光素钠制备荧光素二乙酸酯，再经皂化还原的提纯路线克服了现有技术中酸碱重复使用，以及杂质常与荧光素产生共沉淀的问题。
Description
技术领域
本发明属于荧光素提纯技术领域，涉及一种高纯度荧光素的纯化方法。
背景技术
荧光素（fluorescein）又名荧光橙黄或荧光橙红，化学名称是3',6’-二羟基螺[异苯并呋喃1 ( 3H) ,9’-(9H)- 呫吨]-3-酮或9-(邻羧基苯基)-6-羟基-3H-呫吨-3-酮，由VonBayer在1871年首次合成。荧光素有三种互变结构形式存在：内酷式结构、醌式结构、两性离子式结构，分子结构式如下：
荧光素最大吸收/发射波长在492/571 nm（水中），荧光量子产率在0.92 (pH>8)。由于氧桥键的存在，两个苯环固定在一个平面上，使分子具有刚性共平面结构，在激发光作用下，能产生强烈的荧光。
高纯度荧光素钠被广泛应用于眼底造影的注射制剂或滴眼液制剂中，一般由纯化后的荧光素制得。荧光素通常由间苯二酚和苯酐缩合而得，国内常规提纯荧光素的方法一般由碱溶解后，酸析沉淀，如此循环多次而得到。由于酸析荧光素为无定形结晶，表面积大，对杂质吸附严重。同时，杂质大部分为酸性物质，不溶于酸性水溶液，所以，杂质常常和荧光素形成共沉淀。因此，常规工艺很难得到高纯度的荧光素。
发明内容
本发明针对传统粗品荧光素精制过程中存在的问题提出一种新型的高纯度荧光素的纯化方法。
为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：
一种高纯度荧光素的纯化方法，以苯酐、间苯二酚共热制得的粗品荧光素为原料，该工艺现已成熟，广泛应用在工业生产中，其产物粗品荧光素可直接购买得到，本发明不再赘述。本发明采用此工艺得到的粗品荧光素经过乙酰化反应后用纯水进行打浆，然后重结晶，再利用甲醇钠脱乙酰精制得到精品荧光素。
作为优选，具体步骤如下：
（1）乙酰化
将粗品荧光素和乙酸或乙酸乙酯混合均匀后，加入乙酸酐、缚酸剂50-60℃下反应3-5小时，降温至20-30℃以下析晶1-2h后过滤，滤饼用纯水打浆，45-55℃鼓风干燥8h，得到淡黄色双乙酰荧光素；
（2）重结晶
将淡黄色双乙酰荧光素加入5-6倍体积的（m/V）有机溶剂加热至40-45℃溶解后热滤，加入4-6倍体积的（m/V）析出溶剂降温至0-5℃抽滤，然后45-55℃下鼓风干燥8h得到白色晶状双乙酰荧光素；
（3）皂化反应
将白色晶状双乙酰荧光素加入4-6倍体积的（m/V）甲醇中，搅拌均匀后加入甲醇钠至混合物颜色变为橘红色，升温至55-65℃，搅拌进行皂化反应2-2.5h，补加乙酸继续搅拌反应3-3.5h，然后降温至0-5℃析晶1-1.5h后抽滤，50-55℃鼓风烘干8h；
（4）加入4-6倍体积的（m/V）乙醇中加热至65-75℃打浆30-40min，然后降至室温后抽滤，45-55℃鼓风干燥8h得到精品荧光素。
作为优选，步骤（1）中粗品荧光素：乙酸酐：缚酸剂质量比为1:（2-4）：（0.1-0.3），乙酸加入量为4-6L/千克粗品荧光素，缚酸剂为碳酸钠、碳酸钾、吡啶中的任意一种。
作为优选，步骤（2）中有机溶剂为二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、丙酮中的任意一种，所述析出溶剂为石油醚或乙醚。
作为优选，步骤（3）中白色晶状双乙酰荧光素：甲醇钠：乙酸质量比为1：（0.6-0.7）：（0.55-0.6）。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明是利用制备荧光素衍生物的方法提纯荧光素的新工艺，由于荧光素二乙酸酯易于制备、易于还原，并且具有很好的结晶性，与杂质的性质差别比较大，因此利用荧光素钠制备荧光素二乙酸酯，再经皂化还原的提纯路线克服了现有技术中酸碱重复使用，以及杂质常与荧光素产生共沉淀的问题。
附图说明
图1为取样点板分析情况。
图2-图4为实施例1-3制得的精品荧光素液相色谱检测图。
图5-图7为实施例1-3制得的精品荧光素气相色谱检测图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
下述各实施例中得到的产品采用高效液相色谱仪进行检测，检测条件如下。
仪器：高效液相色谱仪；
色谱柱：以Accucore™ Vanquish™ C18+ 超高效液相色谱柱（1.5 µm），规格150×2.1mm，1.5μm；
检测波长：245nm；
流速：1.0ml/min；
柱温：37℃；
流动相：以磷酸二氢钾溶液（取磷酸二氢钾0.32g，加水1000ml使溶解，用磷酸调节pH值至3.5）为流动相A；乙腈为流动相B。
梯度洗脱程序如表1所示。
表1 梯度洗脱程序
溶剂：流动相A-乙腈（30：70）。
数据处理采用自身对照法。
下述各实施例中得到的产品采用气相色谱仪检测溶剂残留，检测条件如下。
40℃维持8min，再以8℃/min的速度升至120℃，维持10min；以氮气为载气，流速为2.0mL/min。以水为溶剂时顶空瓶温度70-85℃，顶空时间30-60min，进样口温度200℃，如采用FID检测器，温度为250℃。取对照品溶液和供试品溶液，分别连续进样不少于2次，测定待测峰的峰面积。由于气相色谱为荧光素溶剂残留常用的检测手段，未特殊说明之处，色谱检测条件与常规条件一致。
实施例1
以苯酐与间苯二酚共热制得粗品荧光素作为原料，原料纯度不限，工业上得到的常规粗品荧光素即可。取粗品荧光素25g，冰乙酸125ml于500mL三口反应瓶内，80-100转/min搅拌均匀后取样点板得到如图1所示反应点，反应瓶内继续加入吡啶（缚酸剂）5g、乙酸酐10g，控温50-60℃搅拌反应3h，转速80-100转/min,继续取样点板得到如图1所示 产物点，TLC监控展开剂1ml乙酸乙酯加2ml石油醚，生成双乙酰荧光素Rf=0.8，反应物粗品荧光素Rf=0.5，产物点已无粗品荧光素，证明反应完全，可进行下一步处理。
反应完全后降温至25℃以下搅拌析晶1h抽滤，搅拌速率100-150转/min，滤饼用125ml纯化水打浆一次，打浆速率200转/min，打浆时间为10-30min，经过纯化水打浆，可以去除易溶于水的乙酸酐、吡啶、乙酸溶剂残留。打浆结束后，50℃鼓风干燥8h，得到橘黄色双乙酰荧光素28g。用5倍体积(140mL)二氯甲烷40℃溶清后热滤，加入5倍体积乙醚(700mL）析出，降温至0～5℃搅拌1h后抽滤，搅拌速率为80-100转/min，50℃鼓风干燥8h,得白色双乙酰荧光素25.3g。
取双乙酰荧光素25g，加5倍体积甲醇（125ml）于500mL三口瓶内，100-150转/min搅拌混匀后加入16.3g甲醇钠，此时反应液由黄色变红色，控温60℃继续反应2h；加入14.5g乙酸，继续反应3h；降温至0～5℃搅拌析晶1h后抽滤0.5-1h，50℃鼓风干燥8h得粗品荧光素18g。将粗品荧光素加入5倍体积的无水乙醇（90mL）中，70℃下100转/min打浆30min，降至室温抽滤0.5-1h，50℃鼓风干燥8h，得精品荧光素16.3g。
有关物质检测结果如图2。溶剂残留检测如图5。
从图2可以看出精品荧光素纯度达到99.91%。从图5可以看出有机溶剂无残留。
实施例2
本实施例未特殊说明之处，与实施例1一致。
取粗品荧光素100g，冰乙酸500ml于1L三口反应瓶内，搅拌均匀后加入吡啶20g、乙酸酐40g，控温50-60℃搅拌反应3h，TLC监控反应结果，展开剂1ml乙酸乙酯加2ml石油醚，生成双乙酰荧光素Rf=0.8，反应物粗品荧光素Rf=0.5。反应完全后降温至25℃以下搅拌析晶1h抽滤，滤饼用500ml纯化水打浆一次，50℃鼓风干燥，得到橘黄色双乙酰荧光素112g。用5倍体积二氯甲烷40℃溶清，加入5倍体积乙醚析出，降温至0～5℃搅拌1h后抽滤，50℃鼓风干燥得白色双乙酰荧光素101g。
取双乙酰荧光素100g，500ml甲醇于1L三口瓶内，搅拌混匀后加入65g甲醇钠，反应液由黄色变红色，控温60℃搅拌反应2h；加入58g乙酸，搅拌反应3h；降温至0～5℃搅拌析晶1h后抽滤，50℃鼓风干燥得粗品荧光素72g。将粗品荧光素加入5倍体积的无水乙醇中，70℃打浆30min，降至室温抽滤，50℃鼓风干燥，得精品荧光素65g。
有关物质检测结果如图3，溶剂残留检测如图6。
从图3可以看出精品荧光素纯度达到99.92%。从图6可以看出有机溶剂无残留。
实施例3
本实施例未特殊说明之处，与实施例1保持一致。
取粗品荧光素3kg，冰乙酸15L于50L玻璃反应釜内，搅拌均匀后加入吡啶600g、乙酸酐1.2kg，控温50-60℃搅拌反应3h，TLC监控反应结果，展开剂1ml乙酸乙酯加2ml石油醚，生成双乙酰荧光素Rf=0.8，反应物粗品荧光素Rf=0.5。反应完全后降温至25℃以下搅拌析晶1h抽滤，滤饼用15L纯化水打浆一次，50℃鼓风干燥8h，得到橘黄色双乙酰荧光素3.40kg。用5倍体积二氯甲烷40℃溶清，加入5倍体积乙醚析出，降温至0～5℃搅拌1h后抽滤，50℃鼓风干燥得白色双乙酰荧光素3.05kg。
取双乙酰荧光素3kg，15L甲醇于25L玻璃反应釜内，搅拌混匀后加入1.95kg甲醇钠，反应液由黄色变红色，控温60℃搅拌反应2h；加入1.74kg乙酸，搅拌反应3h；降温至0～5℃搅拌析晶1h后抽滤，50℃鼓风干燥得粗品荧光素2.17kg。将粗品荧光素加入5倍体积的无水乙醇中，70℃打浆30min，降至室温抽滤，50℃鼓风干燥，得精品荧光素1.95kg。
有关物质检测结果如图4，溶剂残留检测如图7。
从图4可以看出精品荧光素纯度达到99.98%。从图7可以看出有机溶剂无残留。
从图2至图4、图5至图7可以看出，通过实施例1-3方法得到的精制后的荧光素纯度非常高，且无溶剂残留。实施例1-3是逐步从小试到中试的放大过程，在放大过程中并未出现明显的异常，产物的质量非常稳定，证明工艺完善，适合大规模工业应用。实施例4本实施例与实施例3的不同之处在于，将冰乙酸用乙酸乙酯代替，其余条件保持一致。最终得精品荧光素1.95kg，经检测精品荧光素纯度达到99.97%，有机溶剂无残留。
实施例5
以苯酐与间苯二酚共热制得粗品荧光素作为原料，原料纯度不限，工业上得到的常规粗品荧光素即可。取粗品荧光素25g，乙酸乙酯100ml于500mL三口反应瓶内，80-100转/min搅拌均匀后，反应瓶内继续加入吡啶（缚酸剂）2.5g、乙酸酐5g，控温50-60℃搅拌反应5h，转速80-100转/min。反应完全后降温至20℃搅拌析晶2h抽滤，搅拌速率100-150转/min，滤饼用150ml纯化水打浆一次，打浆速率200转/min，打浆时间为30min，经过纯化水打浆，可以去除易溶于水的乙酸酐、吡啶、乙酸溶剂残留。打浆结束后，50℃鼓风干燥8h，得到橘黄色双乙酰荧光素。用5倍体积二氯甲烷45℃溶清后热滤，加入4倍体积乙醚析出，降温至0～5℃搅拌1.5h后抽滤，搅拌速率为80-100转/min，55℃鼓风干燥7h,得白色双乙酰荧光素。
取双乙酰荧光素，加5倍体积（质量体积比，下同）甲醇于500mL三口瓶内，100-150转/min搅拌混匀后加入16.0g甲醇钠，此时反应液由黄色变红色，控温65℃继续反应2.5h；加入15.2g乙酸，继续反应3.5h；降温至0～5℃搅拌析晶1.5h后抽滤0.5-1h，55℃鼓风干燥7h得粗品荧光素。将粗品荧光素加入5倍体积的无水乙醇中，75℃下100转/min打浆40min，降至室温抽滤1h，45℃鼓风干燥7h，得精品荧光素。
经检测精品荧光素纯度达到99.92%，且有机溶剂无残留。
实施例6
以苯酐与间苯二酚共热制得粗品荧光素作为原料，原料纯度不限，工业上得到的常规粗品荧光素即可。取粗品荧光素25g，乙酸乙酯1200ml于500mL三口反应瓶内，90转/min搅拌均匀，反应瓶内继续加入吡啶（缚酸剂）7.5g、乙酸酐10g，控温60℃搅拌反应3h，转速80-100转/min。反应完全后降温至22℃搅拌析晶1.5h抽滤，搅拌速率100-150转/min，滤饼用200ml纯化水打浆一次，打浆速率200转/min，打浆时间为25min，经过纯化水打浆，可以去除易溶于水的乙酸酐、吡啶、乙酸溶剂残留。打浆结束后，45℃鼓风干燥7.5h，得到橘黄色双乙酰荧光素。用5倍体积二氯甲烷40℃溶清后热滤，加入4倍体积乙醚析出，降温至0～5℃搅拌1.5h后抽滤，搅拌速率为80-100转/min，50℃鼓风干燥8h,得白色双乙酰荧光素。
取双乙酰荧光素，加5倍体积（质量体积比，下同）甲醇于500mL三口瓶内，100-150转/min搅拌混匀后加入15.5g甲醇钠，此时反应液由黄色变红色，控温65℃继续反应3h；加入15.8g乙酸，继续反应3.5h；降温至0～5℃搅拌析晶1.0h后抽滤0.5-1h，45℃鼓风干燥7.5h得粗品荧光素。将粗品荧光素加入6倍体积的无水乙醇中，65℃下100转/min打浆30min，降至室温抽滤1h，55℃鼓风干燥8h，得精品荧光素。
经检测精品荧光素纯度达到99.92%，且有机溶剂无残留。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (5)
1.一种高纯度荧光素的纯化方法，以粗品荧光素为原料，其特征在于，乙酰化反应后纯水打浆，重结晶，然后利用甲醇钠脱乙酰精制得到精品荧光素。
2.根据权利要求1所述高纯度荧光素的纯化方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）乙酰化
将粗品荧光素和乙酸或乙酸乙酯混合均匀后，加入乙酸酐、缚酸剂50-60℃下反应3-5小时，降温至20-30℃析晶1-2h后过滤，滤饼用纯水打浆，45-55℃鼓风干燥8h，得到淡黄色双乙酰荧光素；
（2）重结晶
将淡黄色双乙酰荧光素加入5-6倍体积的（m/V）有机溶剂加热至40-45℃溶解后热滤，加入4-6倍体积的（m/V）析出溶剂降温至0-5℃抽滤，然后45-55℃下鼓风干燥7-8h得到白色晶状双乙酰荧光素；
（3）皂化反应
将白色晶状双乙酰荧光素加入甲醇，甲醇用量为4-6L/kg双乙酰荧光素，搅拌均匀后加入甲醇钠至混合物颜色变为橘红色，升温至55-65℃，搅拌进行皂化反应2-2.5h，补加乙酸继续搅拌反应3-3.5h，然后降温至0-5℃析晶1-1.5h后抽滤，50-55℃鼓风烘干7-8h；
（4）按照4-6L/kg用量加入乙醇，加热至65-75℃打浆30-40min，然后降至20-25℃后抽滤，45-55℃鼓风干燥7-8h得到精品荧光素。
3.根据权利要求2所述高纯度荧光素的纯化方法，其特征在于，步骤（1）中粗品荧光素：乙酸酐：缚酸剂质量比为1:（0.2-0.4）：（0.1-0.3），乙酸或乙酸乙酯加入量为4-6L/kg粗品荧光素，缚酸剂为碳酸钠、碳酸钾、吡啶中的任意一种。
4.根据权利要求2所述高纯度荧光素的纯化方法，其特征在于，步骤（2）中有机溶剂为二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、丙酮中的任意一种，所述析出溶剂为石油醚或乙醚。
5.根据权利要求2所述高纯度荧光素的纯化方法，其特征在于，步骤（3）中白色晶状双乙酰荧光素：甲醇钠：乙酸质量比为1：（0.6-0.7）：（0.55-0.6）。
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|---|---|---|---|---|
| CN114736213A (zh) * | 2022-04-01 | 2022-07-12 | 合肥华纳生物医药科技有限公司 | 一种羧基-四氯-荧光素的制备方法 |
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2021
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